陳 濤，陳凌君*，李 媛

1.永州市中心醫(yī)院冷水灘院區(qū) 麻醉科，湖南 永州 425000；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 麻醉科，海南 ?？?570105

缺血性腦血管病主要指腦組織供血中斷或不足引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。目前,尚無有效治療措施,因此開發(fā)有效的藥物用于神經(jīng)保護(hù)具有重要意義。咪達(dá)唑侖(midazolam)是γ氨基丁酸受體激動(dòng)劑,具有抗焦慮、抗驚厥等作用[2]。研究表明咪達(dá)唑侖可以促進(jìn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元增殖并降低細(xì)胞凋亡,實(shí)現(xiàn)對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用[3]。研究表明,CREB/PGC-1α信號(hào)通路在細(xì)胞代謝過程中扮演著重要角色[4]。研究顯示激活CREB/PGC-1α信號(hào)通路減少腦組織線粒體損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,減少氧自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷[5]。咪達(dá)唑侖是否可以調(diào)控CREB/PGC-1α信號(hào)通路來降低氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/restoration,OGD/R)誘的神經(jīng)損傷還不清楚。因此本研究以HT22細(xì)胞為研究對(duì)象,探究咪達(dá)唑侖對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

小鼠神經(jīng)元細(xì)胞系HT22(智立中特生物科技有限公司)。

DMEM培養(yǎng)基(上海圻明生物科技有限公司);咪達(dá)唑侖(恒瑞醫(yī)藥有限公司);CREB抑制劑KG-501(Med Chem Express公司);MTT試劑盒(上海海方生物技術(shù)有限公司);Edu試劑(深圳海思安生物技術(shù)有限公司);Trizol試劑(廣州威佳科技有限公司);總RNA提取試劑盒(上?？ㄟ~舒生物科技有限公司);蛋白提取試劑盒(鄭州隆之鼎商貿(mào)有限公司);TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(上海瑞楚生物科技有限公司);RT-qPCR試劑盒(北京博邁德生物科技有限公司);胰蛋白酶(北京緣生化科技有限公司);Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α一抗及二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組與處理:將細(xì)胞分為對(duì)照組,氧糖剝奪4 h后復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)24 h為OGD/R組[6],3、6、12 μmol/mL咪達(dá)唑侖[3]、12 μmol/mL咪達(dá)唑侖+25 μmol/L的KG-501[7]干預(yù)OGD/R細(xì)胞為咪達(dá)唑侖低、中、高劑量組和咪達(dá)唑侖高劑量+KG-501組。對(duì)照組和OGD/R組不添加藥物處理。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:收集各處理組HT22細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí),向每孔中加入MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,再加入二甲基亞砜,避光震蕩溶解后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值(A490)。

1.2.3 Edu染色檢測(cè)細(xì)胞增殖:將上述各組HT22細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種到24孔板中。無菌培養(yǎng)36 h,然后向每孔中加入適量Edu孵育2 h,按照Edu-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行Edu及DAPI染色,隨后以熒光顯微鏡采集各組細(xì)胞圖像,采用Image J軟件定量各組Edu陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù),計(jì)算各組細(xì)胞增殖率,公式為:增殖率=Edu陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取各組HT22細(xì)胞,用PBS清洗,加入500 μL結(jié)合緩沖液沉淀細(xì)胞并收集,然后加入annexin V-FITC與PI試劑,室溫避光反應(yīng)15 min,上樣用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6含量:離心收集各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液,按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.6 試劑盒檢測(cè)SOD、CAT、MDA:用裂解液裂解各分組HT22細(xì)胞,按照試劑盒說明書檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)CREBmRNA和PGC-1αmRNA表達(dá)水平:收集各分組HT22細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量PCR擴(kuò)增cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法計(jì)算CREBmRNA和PGC-1αmRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物:CREBmRNA:正向5′-ATGTGCCCATGTCGGAT TATC-3′;反向:5′-GAGGAAGCGACAAGTGTG-3′;PGC-1αmRNA:正向:5′-CGGCAACCTCTTCAGAA CG-3′;反向:5′-CTCAGTTGGAAGGTACCGCG-3′;GAPDH:正向:5′-CCGCACAGCGACTCGCCTTT-3′;反向:5′-AGACAAGACGACGCCGGTT-3′。

1.2.8 Western blot檢測(cè)Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α的蛋白表達(dá)量:用蛋白裂解液裂解各處理組HT22細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,檢測(cè)細(xì)胞中蛋白含量,電泳進(jìn)行蛋白分離,轉(zhuǎn)膜,于5%的脫脂奶粉封閉液中封閉;加入Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α(稀釋1∶1 500)一抗4 ℃搖床過夜,洗膜后再分別加入二抗(稀釋1∶5 000)常溫下孵育2 h,加入ECL發(fā)光液顯影,用Image-Pro Plus進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 咪達(dá)唑侖對(duì)HT22細(xì)胞增殖能力的影響

與對(duì)照組相比,OGD/R組細(xì)胞A490值(24、48 h),細(xì)胞增殖率顯著性降低(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達(dá)唑侖低、中、高劑量組細(xì)胞A490值(24、48 h),細(xì)胞增殖率顯著性升高,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達(dá)唑侖高劑量組相比,咪達(dá)唑侖高劑量+KG-501組A490值(24、48 h),細(xì)胞增殖率顯著性降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the midazolam high dose group.

2.2 各分組HT22細(xì)胞凋亡率比較

與對(duì)照組相比,OGD/R組細(xì)胞凋亡率顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達(dá)唑侖低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著性降低,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達(dá)唑侖高劑量組相比,咪達(dá)唑侖高劑量+KG-501組凋亡率顯著性升高(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the midazolam high dose group.

2.3 各分組細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6水平比較

與對(duì)照組相比,OGD/R組細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6水平顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達(dá)唑侖低、中、高劑量組細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6水平顯著性降低,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達(dá)唑侖高劑量組相比,咪達(dá)唑侖高劑量+KG-501組細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6水平顯著性升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the midazolam high dose group.

2.4 各分組HT22細(xì)胞SOD、CAT、MDA水平比較

與對(duì)照組相比,OGD/R組細(xì)胞SOD、CAT活性顯著性降低,MDA含量顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達(dá)唑侖低、中、高劑量組細(xì)胞SOD、CAT活性顯著性升高,MDA含量顯著性降低,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達(dá)唑侖高劑量組相比,咪達(dá)唑侖高劑量+KG-501組細(xì)胞SOD、CAT活性顯著性降低,MDA含量顯著性升高(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the Midazolam high dose group.

2.5 各分組HT22細(xì)胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達(dá)水平比較

與對(duì)照組相比,OGD/R組細(xì)胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達(dá)水平顯著性降低(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達(dá)唑侖低、中、高劑量組細(xì)胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達(dá)水平顯著性升高,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達(dá)唑侖高劑量組相比,咪達(dá)唑侖高劑量+KG-501組細(xì)胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達(dá)水平顯著性降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the Midazolam high dose group.

2.6 各分組HT22細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組相比,OGD/R組細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表達(dá)水平顯著性降低,Bax蛋白表達(dá)顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達(dá)唑侖低、中、高劑量組細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表達(dá)水平顯著性升高,Bax蛋白表達(dá)顯著性降低,(P<0.05);與咪達(dá)唑侖高劑量組相比,咪達(dá)唑侖高劑量+KG-501組細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表達(dá)水平顯著性降低,Bax蛋白表達(dá)顯著性升高(P<0.05)(圖6,7)。

A.control; B.OGD/R; C.midazolam low dose group; D.midazolam medium dose group; E.midazolam high-dose group; F.midazolam high dose +KG-501 group.

圖7 不同劑量咪達(dá)唑侖處理的HT22細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α蛋白表達(dá)比較

3 討論

當(dāng)大腦缺血缺氧時(shí),腦組織出現(xiàn)代謝功能障礙,誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡,最后導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙,嚴(yán)重者引起死亡,稱之為缺血性卒中,其死亡率約占所有卒中87%[8]。該疾病是由多種病理過程共同作用的結(jié)果,研究表明,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在腦組織損傷中發(fā)揮重要作用,減小氧化應(yīng)激和腦組織細(xì)胞凋亡成為研究重點(diǎn)[9]。本研究顯示,OGD/R對(duì)HT22細(xì)胞造成一定損傷。

CREB是一種轉(zhuǎn)錄因子,參與許多生理過程,如增殖、分化、調(diào)節(jié)炎癥等。CREB是調(diào)節(jié)PGC-1α表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,而PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄共激活劑,可募集核受體或轉(zhuǎn)錄因子,并調(diào)節(jié)細(xì)胞核和線粒體中下游基因的轉(zhuǎn)錄。還可獨(dú)立對(duì)抗ROS的產(chǎn)生,抑制NF-κB的途徑,從而減少炎性的發(fā)生[14]。有研究表明腦活素可以激活CREB/PGC-1α信號(hào)通路減少神經(jīng)炎來改善腦缺血損傷[14]。羅氟酞普蘭通過激活CREB/PGC-1α信號(hào)通路來降低PD模型中神經(jīng)細(xì)胞的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,從而改善神經(jīng)細(xì)胞功能[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,OGD/R可抑制HT22細(xì)胞中CREB和PGC-1α基因和蛋白表達(dá)。咪達(dá)唑侖干預(yù)可提高CREB和PGC-1α基因和蛋白表達(dá)。為驗(yàn)證該結(jié)論,在咪達(dá)唑侖干預(yù)基礎(chǔ)上,添加KG-501處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),KG-501可部分逆轉(zhuǎn)咪達(dá)唑侖對(duì)OGD/R誘導(dǎo)HT22細(xì)胞的治療作用。提示KG-501可減弱咪達(dá)唑侖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用,加重細(xì)胞凋亡和損傷。

綜上所述,咪達(dá)唑侖可減輕細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,降低細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,從而減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究?jī)H在細(xì)胞水平進(jìn)行探究,后續(xù)還需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。