楊鎧菲，朱靜格，張洋洋，趙俊果，高雨悅，胡煥煥，2*，姬國杰

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院1.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；2.生育力保存重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，河南 新鄉(xiāng) 453000

宮頸癌是世界范圍內(nèi)對(duì)女性危害嚴(yán)重的第4大惡性腫瘤,主要發(fā)病于發(fā)展中國家和欠發(fā)達(dá)國家[1]。凋亡的特征是常見的形態(tài)學(xué)和生化改變[2],多數(shù)化療藥物都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其抗癌活性,細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性可能與細(xì)胞凋亡作用相關(guān)[3]。然而,由于外界藥物的刺激,細(xì)胞啟動(dòng)一種自我保護(hù)的機(jī)制——細(xì)胞自噬。細(xì)胞自噬是一個(gè)嚴(yán)格受基因調(diào)控的過程,細(xì)胞自噬作用在細(xì)胞更新和增殖分化過程中都起著作用[4]。自噬與腫瘤密切相關(guān)[5],研究表明,細(xì)胞自噬作用對(duì)宮頸癌細(xì)胞藥物敏感性也有一定影響[6]。同種藥物在不同的細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡有著不同的影響,更好的理解細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的關(guān)系有助于腫瘤藥物的研發(fā)與腫瘤治療。

Bcl-2蛋白家族成員可以與自噬相關(guān)蛋白Beclin1結(jié)合從而直接抑制細(xì)胞自噬。凋亡途徑的完整性在Bcl-2家族對(duì)于自噬的抑制中起重要作用,當(dāng)Bax和Bak被敲除時(shí),細(xì)胞中固有的凋亡途徑也會(huì)失去功能,Bcl-2家族也就失去抑制細(xì)胞自噬的功能[7]。在肝癌細(xì)胞中,自噬對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出抑制作用[8]。藥物對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的影響在不同的細(xì)胞中顯示出不同的作用,有相關(guān)研究指出自噬促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡[9]。

目前的大量研究證明索拉菲尼(sorafenib)在多種腫瘤如肝癌[10]、結(jié)腸癌[11]、黑色素瘤[12]、宮頸癌HeLa細(xì)胞[13-14]中都具有有效性。近年來,也有各種有關(guān)提高索拉菲尼的靶向性和治療效果的研究[15]。在某些細(xì)胞中(如白血病)索拉菲尼可獨(dú)立于RAF/MEK/ERK抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17],索拉菲尼介導(dǎo)的人類白血病細(xì)胞的殺傷力作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)以及抑制翻譯導(dǎo)致的抗凋亡蛋白髓樣細(xì)胞白血病(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)下調(diào)有關(guān),但在人類白血病細(xì)胞中,使用合適濃度索拉菲尼在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生氧化應(yīng)激,可以有效的滅活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases 1,ERK1)[17]。

本研究主要針對(duì)索拉菲尼如何通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬影響HeLa細(xì)胞增殖,以及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬之間的關(guān)系和細(xì)胞自噬與HeLa細(xì)胞耐藥性的關(guān)系來進(jìn)行研究。在了解細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡之間關(guān)系的同時(shí),為宮頸癌治療的聯(lián)合用藥以及新藥的開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞系(購買自湖南豐暉生物科技有限公司)。Gibco胎牛血清、2.5%胰蛋白酶(10×)、臺(tái)盼藍(lán)染液(0.4%)、索拉菲尼、RPMI 1640培養(yǎng)基(北京索萊寶生物科技有限公司);CCK-8試劑、PBS(10×)、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma Aldrich公司);TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) ver3.0試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng):在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)條件下,保證溫度和濕度,用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%匯合時(shí),使用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)索拉菲尼的IC50值:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成濃度為3×104cells/mL的單細(xì)胞懸液,向各孔加入100 μL細(xì)胞懸液;待細(xì)胞貼壁后,換不同濃度加藥培養(yǎng)基(每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)),放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h;24 h后,用5 mL針管吸出加藥培養(yǎng)基,用0.9%氯化鈉溶液洗1～2次,再向每孔加入10 μl 5 mg/mL MTT溶液,在恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h;用5 mL針管吸去MTT溶液,向每孔加150 μl DMSO,在室溫將96孔板在黑暗狀態(tài)下震蕩10 min,570 nm下測(cè)定吸光值,計(jì)算索拉菲尼對(duì)HeLa細(xì)胞抑制率及IC50值。

1.2.3 建立細(xì)胞耐藥株:用間歇誘導(dǎo)法構(gòu)建耐藥細(xì)胞株[18],以0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μmol/L為梯度的索拉菲尼處理HeLa細(xì)胞,每個(gè)濃度維持1周,并篩選出可穩(wěn)定傳代的耐藥細(xì)胞株,然后用常規(guī)培養(yǎng)基穩(wěn)定耐藥細(xì)胞株,最后維持在含索拉菲尼藥物的培養(yǎng)液中。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期:在MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性后,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞24 h,選用合適濃度的索拉菲尼處理HeLa細(xì)胞。將細(xì)胞收集在1.5 mL 離心管中,用0.9%氯化鈉溶液洗滌細(xì)胞3次,離心之后棄去上層清液,以200 μL生理鹽水重懸細(xì)胞,再將800 μL乙醇加入離心管,固定-20 ℃過夜;低速離心機(jī)離心,用1mL低滲溶液,在37 ℃孵箱中放置30 min;再進(jìn)行離心,加入1mL PI溶液(50 μg/mL),放入冰水混合物30 min;用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光染料激發(fā)后PI-DNA復(fù)合物發(fā)出的熒光,用ModFit3.2進(jìn)行細(xì)胞周期各階段的量化。

1.2.5 總RNA提取和PCR檢測(cè):TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA,將樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板用PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以GAPDH為內(nèi)參。取10 μL Taq mix(Taq+dNTP)、6 μL H2O、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL Sample混合為20 μL總體系,放入PCR儀,設(shè)定程序,PCR擴(kuò)增結(jié)束,進(jìn)行電泳,對(duì)電泳圖進(jìn)行灰度值分析,進(jìn)而分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá):HeLa細(xì)胞中加適量細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min;于4 ℃下12 000 rpm離心5 min,保留上清,使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度并進(jìn)行定量。取20 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,設(shè)置90 V電泳30 min,達(dá)到分離膠后調(diào)整電壓為120 V,待其達(dá)到末端停止電泳。使用電泳槽濕轉(zhuǎn)1 h,將樣品轉(zhuǎn)移至 PVDF膜,再用5%脫脂奶粉在37 ℃孵箱中封閉0.5 h。取出膜,進(jìn)行一抗孵育,放置于4 ℃冰箱過夜。之后用HRP二抗,在室溫狀態(tài)下孵育1 h,最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光,進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HeLa細(xì)胞耐藥株的構(gòu)建

以間歇誘導(dǎo)法構(gòu)建耐藥細(xì)胞株,最終篩選出的索拉菲尼IC50濃度為16.992 μmol/L。親本株:細(xì)胞多為圓形;耐藥株:在細(xì)胞進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)之后,多為不規(guī)則形狀,且細(xì)胞體積增大(圖1)。

A.parental cell strain; B.drug-resistant strains of sorafenib.

2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞活力逐漸下降且親本株下降較為明顯(圖2)。同時(shí),索拉菲尼藥物對(duì)親本細(xì)胞有更高的抑制率,說明索拉菲尼藥物對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用,并且對(duì)親本細(xì)胞株的抑制作用更加顯著(P<0.05),而耐藥細(xì)胞株則具有更強(qiáng)的增殖能力(圖3)。

圖2 細(xì)胞活性比較Fig 2 Comparison of cell viability in each group

圖3 細(xì)胞增殖情況比較Fig 3 Comparison of cell proliferation curves in each

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

流式檢測(cè)結(jié)果顯示,加藥組G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著升高(圖4)。耐藥細(xì)胞株在G0/G1期發(fā)生細(xì)胞周期阻滯,在G1期細(xì)胞有明顯數(shù)量增加。說明索拉菲尼是通過阻滯細(xì)胞周期來抑制細(xì)胞增殖(圖5)。

A.control group; B.sorafenib group; C.cell quantification map of each stage; *P<0.05 compared with control group.

A.parental strain; B.drug-resistant strain; C.cell quantification map of each stage; *P<0.05 compared with parental group.

2.4 目標(biāo)mRNA表達(dá)量在親本株和耐藥株中的測(cè)定

PCR結(jié)果顯示, 經(jīng)索拉菲尼處理的細(xì)胞耐藥基因表達(dá)量相對(duì)升高,凋亡基因與凋亡抑制基因也相對(duì)升高,但凋亡基因升高更為顯著(P<0.05)(圖6)。在15 μmol/L之前,細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用,在15 μmol/L之后,細(xì)胞凋亡被抑制(圖7)。

A.parental group; B.drug-resistant strain group; *P<0.05 compared with 0 μmol/L group.

*P<0.05 compared with control group.

2.5 自噬標(biāo)志物蛋白在親本和耐藥細(xì)胞的表達(dá)情況

LC3有兩種亞型分別為L(zhǎng)C3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,常被作為檢測(cè)細(xì)胞自噬的標(biāo)志,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值被用來判定細(xì)胞自噬程度的高低。Western blot結(jié)果顯示,耐藥細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值顯著高于親本細(xì)胞,表明索拉菲尼會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞LCs的自噬水平升高(圖8)。

*P<0.05 compared with parental strain.

3 討論

近幾年來,宮頸癌被稱為危害女性生殖功能的惡性腫瘤之一,迄今仍缺乏有效的治療手段,一方面因?yàn)殄e(cuò)綜復(fù)雜的病理因素,另一方面因?yàn)榉幰欢螘r(shí)間后腫瘤出現(xiàn)耐藥性。近幾年的研究認(rèn)為細(xì)胞自噬是腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性的原因之一,但目前對(duì)細(xì)胞凋亡與自噬對(duì)腫瘤增殖作用的影響仍存在爭(zhēng)議,高水平的自噬伴隨caspase家族蛋白的低表達(dá)[19]。所以,一定程度上細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)負(fù)相關(guān), 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活; 外界藥物的刺激在引起細(xì)胞自噬,自噬相關(guān)蛋白作為caspase家族蛋白的底物,輕微的下調(diào)caspase蛋白活性,調(diào)控細(xì)胞凋亡,這時(shí)細(xì)胞自噬與腫瘤細(xì)胞的耐藥性呈現(xiàn)正相關(guān)。由于細(xì)胞自噬在一定程度上引起細(xì)胞死亡,如果藥物的刺激對(duì)腫瘤細(xì)胞的刺激較大,這時(shí)細(xì)胞自噬與細(xì)胞耐藥性呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān),即自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。所以,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬對(duì)于腫瘤細(xì)胞都存在拮抗效應(yīng),只是在不同的時(shí)期發(fā)揮的主效應(yīng)不同,若細(xì)胞凋亡大于細(xì)胞自噬所發(fā)揮的效應(yīng),自噬就引起細(xì)胞的耐藥性;若細(xì)胞自噬大于細(xì)胞凋亡所發(fā)揮的效應(yīng),自噬就會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡。所以,探索細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的界限有助于更好的理解藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。在了解細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡之間關(guān)系的同時(shí),為宮頸癌治療的聯(lián)合用藥以及新藥的開發(fā)提供指導(dǎo)。

綜上所述,藥物索拉菲尼通過阻滯細(xì)胞周期來達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。細(xì)胞自噬一方面參與了細(xì)胞耐藥的發(fā)展,促進(jìn)細(xì)胞存活;另一方面,在一定的限度上,也能激活耐藥細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)。隨著對(duì)自噬和凋亡界限研究的不斷深入,以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,相信未來在宮頸癌的治療方面將會(huì)取得重大進(jìn)展。