張智恒，趙維武，孫海譽，孫秋慧，郭山，代舒同

山東元泰生物工程有限公司（日照 276800）

蛋糕是一種外來的焙烤食品，在發(fā)展過程中，不斷地與國內(nèi)的需求創(chuàng)新融合。它的消費已從特定場景，擴展至人民日常生活中。出品形式也逐漸小份化，滿足零售的需求。蛋糕含蛋量高、營養(yǎng)豐富，口感綿軟細膩、香味濃郁，深受消費者喜愛，漸漸發(fā)展為國人舌尖上的剛需[1]。但是蛋糕富含蛋白質(zhì)和淀粉，水分含量高，易受微生物污染，造成霉斑和拉絲。蛋糕多數(shù)pH偏堿性，大多數(shù)化學(xué)保鮮劑保鮮效果差強人意[2]。鑒于蛋糕的食用頻次及化學(xué)保鮮劑的體內(nèi)殘留風(fēng)險，人們傾向于使用抑菌效率高、安全風(fēng)險低的天然保鮮劑。在國內(nèi)，ε-聚賴氨酸已被批準(zhǔn)作為微生物源食品防腐劑使用，肉桂酸鉀是食品香料型保鮮劑，迷迭香提取物是天然食品抗氧化劑和保鮮劑[3-5]。據(jù)報道，迷迭香提取物對黃曲霉、黑曲霉、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等細菌和真菌都有抑制效果[6-9]。也有研究表明，肉桂酸鉀對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、釀酒酵母等有抑制作用[10-11]。試驗采用3種原料復(fù)配使用，運用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化配比，以延長蛋糕保質(zhì)期，為企業(yè)應(yīng)用新型保鮮劑提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

ε-聚賴氨酸（山東元泰生物工程有限公司）；肉桂酸鉀（武漢能邁科實業(yè)有限公司）；迷迭香提取物（河南中大恒源生物科技股份有限公司）；氯化鈉（分析純，佛山西隴化工有限公司）；平板計數(shù)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖肉湯（上海博微生物科技有限公司）；孟加拉紅瓊脂、營養(yǎng)肉湯、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽肉湯（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）。

蛋糕制作原料：低筋面粉（五得利面粉集團有限公司）；白砂糖（云南滇鵬糖業(yè)有限公司）；泡打粉（北京古松經(jīng)貿(mào)有限公司）；牛奶（鄭州花花牛乳制品有限公司）；色拉油（益海嘉里食品營銷有限公司）；抹茶粉（余姚綠谷工坊食品有限公司）；白醋、雞蛋、食用鹽（購于市場）。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZF-50L-Ⅰ立式高壓蒸汽滅菌器（山東申安醫(yī)療器械廠）；HH-4A數(shù)顯恒溫水浴鍋[國華（常州）儀器制造有限公司]；BSM220分析天平（0.000 1 g，山東卓精電子科技有限公司）；JE3002電子天平（0.01 g，上海蒲春計量儀器有限公司）；MF-GFZ-136L鼓風(fēng)干燥箱[邁福（山東）科學(xué)儀器股份有限公司]；LKB-204J烤箱（山東省博興縣凱凱廚房設(shè)備有限公司）；ZG-LZ908和面機（中山市燦欣電器制品有限公司）；BJPX-Ⅰ-250生化培養(yǎng)箱、BJPX-Ⅲ-250霉菌培養(yǎng)箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；RE-205電動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上?？怖x器設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 抹茶戚風(fēng)蛋糕制作工藝流程

蛋清→加入適量白醋→低速攪打→加入白糖→快速攪打→蛋白糊

牛奶、色拉油→攪拌至無油花→加入低筋面粉、抹茶粉、泡打粉、鹽→翻拌→加入蛋黃→攪拌→蛋黃糊→加入蛋白糊→調(diào)糊→注?！婵尽鋮s→脫?！善?/p>

以蛋清140 g、蛋黃60 g、低筋面粉100 g、白砂糖80 g、泡打粉2 g、牛奶60 g、色拉油60 g、抹茶粉10 g、食用鹽1 g、白醋0.2 mL的比例制作蛋糕。蛋糕的冷卻、脫模、切分在無菌環(huán)境下進行，密閉包裝，在37 ℃、Hr70%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中放置3 d[12]。

1.3.2 優(yōu)勢菌落的篩選

在無菌環(huán)境下稱取10.0 g蛋糕，分別置于90 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中。將營養(yǎng)肉湯置于37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，無菌條件下在平板計數(shù)瓊脂上劃線分離，得多個單菌落，觀察菌落形態(tài)、顏色、大小，并進行革蘭染色。將馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基置于28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)72 h后，無菌條件下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上劃線分離，得多個單菌落，觀察菌落形態(tài)、顏色、大小[13]。

1.3.3 混合細菌、混合霉菌的制作

一般情況下，不添加任何保鮮劑的蛋糕，引起腐敗的細菌和霉菌不止一種。為了盡可能還原蛋糕中的微生物生態(tài)環(huán)境，將分離的細菌、霉菌分別混合制成混合細菌、混合霉菌[14-15]。

將劃線分離的各細菌單菌落用接種環(huán)接入營養(yǎng)肉湯，在37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌生理鹽水稀釋成1.0×106～5.0×106CFU/mL，將各細菌懸浮液等體積混合，就制成混合細菌。

將劃線分離的各霉菌單菌落用接種環(huán)挑取菌絲體或孢子接入沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，在28 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，無菌環(huán)境下用4層滅菌紗布過濾，用無菌生理鹽水稀釋濾液，制成孢子濃度1.0×105～5.0×105CFU/mL的孢子懸液，然后將各霉菌孢子懸液等體積混合，就制成混合霉菌[16-17]。

1.3.4 最小抑菌濃度的測定

參照《消毒技術(shù)規(guī)范2002年版》中最小抑菌濃度測定試驗（營養(yǎng)肉湯稀釋法）、WS/T 411—2013《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 抗絲狀真菌藥物敏感性試驗 肉湯稀釋法》中宏量肉湯稀釋法操作步驟，測定ε-聚賴氨酸、迷迭香提取物、肉桂酸鉀對混合細菌、混合霉菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。最終保鮮劑質(zhì)量濃度分別為8.000，4.000，2.000，1.000，0.500，0.250，0.125，0.063，0.031和0.016 g/kg。

1.3.5 保鮮劑在蛋糕中的添加及響應(yīng)面優(yōu)化

由于3種保鮮劑都有較好的熱穩(wěn)定性，故可先與低筋面粉預(yù)混，根據(jù)工藝加入產(chǎn)品中[18]。制成的添加保鮮劑的成品蛋糕密閉包裝，在37 ℃、Hr70%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中放置3 d后，按照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》和GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》進行微生物檢測。

根據(jù)3種保鮮劑測得的對混合細菌、混合霉菌的最小抑菌濃度，確定在蛋糕中的添加量。以ε-聚賴氨酸添加量、肉桂酸鉀添加量、迷迭香提取物添加量為因素，運用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）原理，設(shè)計三因素五水平的中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）試驗，以微生物總數(shù)（蛋糕37 ℃、Hr70%放置3 d的菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)之和）為響應(yīng)值，優(yōu)化各保鮮劑添加量。

1.3.6 產(chǎn)品驗證及其他指標(biāo)檢測

對最優(yōu)的3種保鮮劑的添加量進行驗證試驗，并且根據(jù)GB 7099—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 糕點、面包》檢測產(chǎn)品的酸價、過氧化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌落的分離純化結(jié)果

2.1.1 優(yōu)勢細菌的分離純化結(jié)果

通過對腐敗蛋糕中的微生物的培養(yǎng)、分離、純化，得到2種細菌，菌落形態(tài)及革蘭染色觀察結(jié)果見表1。

表1 菌落形態(tài)及革蘭染色觀察結(jié)果

2.1.2 優(yōu)勢霉菌的分離純化結(jié)果

通過對腐敗蛋糕中的微生物的培養(yǎng)、分離、純化，得到2種霉菌，菌落形態(tài)觀察結(jié)果見表2。

表2 菌落形態(tài)及顯微鏡觀察結(jié)果

2.2 最小抑菌濃度測定結(jié)果

由表3可知，ε-聚賴氨酸對引起蛋糕腐敗的微生物抑菌能力最強，其次是肉桂酸鉀，迷迭香提取物弱于二者。由于霉菌不同于細菌的細胞結(jié)構(gòu)，以及3種保鮮劑對兩者抑菌機理的差異，3種保鮮劑對混合霉菌的MIC值均高于混合細菌。ε-聚賴氨酸抑制細菌的主要原理是細胞膜的損傷和ROS（活性氧）升高引起的細胞死亡；抑制霉菌的主要原理是創(chuàng)傷菌絲體和促進孢子產(chǎn)生過多ROS，從而抑制孢子萌發(fā)和造成菌絲體創(chuàng)傷性空腔[19-23]。肉桂酸鉀和迷迭香提取物抑制細菌的原理則是有效成分直接作用于細胞壁和細胞膜，造成胞內(nèi)成分泄漏；抑制霉菌的原理是損傷菌絲骨架，造成細胞間隔解體，表面扭曲[24-30]。

表3 3種保鮮劑對混合細菌、混合霉菌MIC值單位：g/kg

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 試驗因素及水平

根據(jù)3種保鮮劑對混合細菌、混合霉菌的MIC值，以混合霉菌的MIC值為基準(zhǔn)質(zhì)量濃度，用其值的7.95%，25.00%，50.00%，75.00%和92.05%為各因素的水平，設(shè)置響應(yīng)面的三因素五水平表，見表4[31]。

表4 響應(yīng)面分析法的因素和水平表 單位：g/kg

2.3.2 響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果分析

通過Design Expert 10軟件對CCD試驗進行設(shè)計，試驗結(jié)果如表5所示。分析試驗數(shù)據(jù)得到回歸方程模型：R=1 203.60-153.40A+64.50B-178.13C+183.75AB+148.75AC+236.25BC+242.81A2+202.15B2+35.98C2。

表5 CCD試驗設(shè)計與結(jié)果

對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合分析，得到回歸方程的方差分析和系數(shù)估計值，如表6所示。響應(yīng)面模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.981 4，模型回歸效果極顯著（P＜0.01）；失擬項沒有顯著性（P＞0.05），說明該回歸方程模擬的三因素五水平分析可靠；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.981 4，矯正決定系數(shù)Radj2=0.964 6，說明自變量的選擇是合適的，模型能夠較準(zhǔn)確描述試驗結(jié)果，可進行下一步的研究分析。

表6 回歸方程的方差分析

根據(jù)表6可知：A、C的P＜0.01，B的P＜0.05，說明ε-聚賴氨酸添加量、迷迭香提取物添加量對蛋糕的微生物總數(shù)影響極為顯著，肉桂酸鉀添加量對蛋糕的微生物總數(shù)影響為顯著，ε-聚賴氨酸添加量、迷迭香提取物添加量對蛋糕的微生物總數(shù)影響力比肉桂酸鉀添加量大。AB、AC、BC的P值均小于0.01，說明ε-聚賴氨酸添加量、迷迭香提取物添加量、肉桂酸鉀添加量三者中的任意兩者之間的交互作用對蛋糕的微生物總數(shù)影響都是極為顯著的。

圖1～圖3反映了各個因素之間的交互作用對蛋糕的微生物總數(shù)的影響，響應(yīng)面整體呈現(xiàn)中心凹陷的形狀，并且等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明A、B、C三因素中兩兩之間的交互作用對蛋糕的微生物總數(shù)的影響極具顯著性。由圖1可知：固定迷迭香提取物添加量，當(dāng)肉桂酸鉀處于較低添加量時，隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，微生物總數(shù)先大幅降低后處于平緩狀態(tài)；當(dāng)肉桂酸鉀處于較高添加量時，隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，微生物總數(shù)先大幅降低后升高。3種保鮮劑作用于細菌的部位和原理既有相同（都結(jié)合細胞膜，造成膜損傷），又有不同（胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合不同）。某種保鮮劑添加量較高時，就會造成另外2種保鮮劑與細菌接觸的幾率降低，不能較好發(fā)揮協(xié)同作用。

圖1 ε-聚賴氨酸與肉桂酸鉀的交互作用

圖2 ε-聚賴氨酸與迷迭香提取物的交互作用

圖3 肉桂酸鉀與迷迭香提取物的交互作用

2.3.3 各個因素最佳水平的確定

通過Design Expert 10軟件處理數(shù)據(jù)，得到各個因素的最佳水平，即ε-聚賴氨酸添加量0.147 g/kg，肉桂酸鉀添加量0.137 g/kg，迷迭香提取物添加量0.750 g/kg，此時蛋糕的微生物總數(shù)（細菌霉菌總數(shù)之和）最小，為920 CFU/g。

2.3.4 產(chǎn)品驗證及其他指標(biāo)檢測

按照上述最佳水平進行3次平行試驗，置于37 ℃、Hr70%恒溫恒濕培養(yǎng)箱3 d后，霉菌、大腸菌群未檢出，細菌菌落總數(shù)平均值為950 CFU/g，接近預(yù)測值；繼續(xù)加速，到第6天，霉菌總數(shù)平均值為138 CFU/g，大腸菌群未檢出，細菌菌落總數(shù)平均值為3.4×104CFU/g，接近變質(zhì)。同時做的空白對照組，第3天時，霉菌總數(shù)平均值達到320 CFU/g，大腸菌群未檢出，細菌菌落總數(shù)平均值已達5.0×104CFU/g，已不符合GB 7099—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 糕點、面包》要求。

迷迭香具有抗油脂氧化的作用。測定添加復(fù)配組蛋糕和空白對照組蛋糕的酸價和過氧化值。復(fù)配組酸價平均值為0.88 mg/g，空白對照組酸價平均值為1.46 mg/g；復(fù)配組過氧化值平均值為0.05 g/100 g，空白對照組過氧化值平均值為0.08 g/100 g。加入復(fù)配保鮮劑之后，蛋糕的酸價和過氧化值都會顯著降低。

3 結(jié)論

以新型保鮮劑ε-聚賴氨酸、肉桂酸鉀、迷迭香提取物為原料，通過最小抑菌濃度試驗和響應(yīng)面試驗，得出3種保鮮劑最佳添加量：ε-聚賴氨酸0.147 g/kg，肉桂酸鉀0.137 g/kg，迷迭香提取物0.750 g/kg，并經(jīng)過驗證，復(fù)配保鮮劑可顯著延長抹茶戚風(fēng)蛋糕保質(zhì)期。試驗旨在為新型保鮮劑在糕點中的應(yīng)用提供理論支持，肉桂酸鉀、迷迭香提取物自身帶有一定味道，后續(xù)將聯(lián)合兩者的生產(chǎn)廠家開發(fā)出專用的保鮮型肉桂酸鉀和迷迭香提取物。