陳芷珊，陳瀅鍇，陳中婷，蒙淑玲，江明生，陳海蘭，3，4*

(1. 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心，廣西 南寧 530004；3. 廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室，廣西 南寧 530004；4. 廣西高校動物疫病預防與控制重點實驗室，廣西 南寧 530004)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的單股正鏈RNA病毒，可感染各日齡各品系的豬，引發(fā)豬流行性腹瀉(PED)。PED是一種以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的高度接觸性腸道傳染病，對哺乳仔豬危害最大，死亡率可高達100%[1]。豬流行性腹瀉在1971年首次發(fā)現(xiàn)于英國，隨后在歐洲和亞洲的部分國家相繼流行，各地的哺乳仔豬大量被感染并發(fā)生死亡[2]。2007年在泰國暴發(fā)PED，給當?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[3]。2004年杜堅等[4]首次用血清學方法證實了廣西豬場存在PEDV感染，但未出現(xiàn)大規(guī)模疫情暴發(fā)。2010年，中國首先于南方地區(qū)出現(xiàn)PED暴發(fā)，隨后遍及全國各地，給中國的養(yǎng)豬企業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失和影響[5]。近幾年的調(diào)查結果表明，PEDV在廣西的平均檢出率最高為58.26%，表明PED在廣西生豬養(yǎng)殖場中的危害不容忽視[6]。對PEDV感染的早期篩查是控制該病毒傳播和PED疫情蔓延的關鍵，因此，建立一種PEDV現(xiàn)場快速檢測方法對PED的防制有著重要意義。

常用的PEDV檢測方法主要包括病原學檢測方法和血清學檢測方法，其中病原學檢測方法包括常規(guī)反轉錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR和環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)，而血清學檢測方法主要有間接免疫熒光(IFA)、病毒中和檢測(VN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫層析技術等[7]。RT-PCR和熒光定量PCR檢測方法有較好的特異性和靈敏度，但是需要較高水平的專業(yè)能力和昂貴的設備支持，不適用于養(yǎng)殖場的現(xiàn)場快速檢測。RT-LAMP具有引物特異性強，反應條件簡單和時間短等優(yōu)點，但由于反應需要多條引物，且相關試劑價格較高，限制了該方法在基層檢測的普及[8]。VN檢測試劑盒操作簡便且無需專門設備，但檢測結果的判斷具有主觀性，并且檢測的重復性易受影響[9]。ELISA可用于大規(guī)模臨床檢測，但仍需要嚴格的操作技術和昂貴的儀器，不適用于PEDV急性感染的一線臨床檢測[10-11]。免疫層析技術具有檢測快速、價格低廉、操作簡單、攜帶方便、安全無污染等特點，適用于臨床快速檢測，但傳統(tǒng)膠體金免疫層析技術的準確性和靈敏度有待提高[12]。熒光免疫層析技術 (LFIA) 是以熒光物質(zhì)為信號源，建立在層析膜上的基于抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術。該檢測技術將免疫熒光和免疫層析技術相結合，克服了傳統(tǒng)膠體金免疫層系技術靈敏度較低的不足，且保留了快捷簡便、價格低廉、不依賴儀器設備和專業(yè)技術人員等優(yōu)點，被廣泛運用于疾病檢測、食品安全監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)測等方面[13-16]。

本研究以羧基化量子點微球為標記材料，建立了一種用于PEDV現(xiàn)場快速檢測的熒光免疫層析檢測技術，可由養(yǎng)殖人員在現(xiàn)場直接完成PEDV感染的快速篩查，對及時制定正確有效的疫病防控措施具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

鼠抗PEDV單克隆抗體(貨號：JN1401，批號：M20201109)購于北京金諾百泰生物技術有限公司；羊抗鼠IgG多克隆抗體(貨號：D111024，批號：H318AA0001)購于生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜，貨號：500774047，批號：S019110264)由德國Sartorius公司提供；羧基化量子點微球購于北京納晶生物科技有限公司；2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)，碳二亞胺(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，牛血清白蛋白(BSA)，硼酸鈉和硼酸由美國Sigma公司生產(chǎn)；樣品墊、結合墊、吸水紙和聚氯乙烯(PVC)底板等購于上海金標生物科技有限公司。

PEDV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和偽狂犬病毒(PRV)，由廣西大學動物科學技術預防獸醫(yī)實驗室分離保存；腸炎沙門菌(ATCC 14028)購于北京保藏生物科技有限公司；大腸桿菌(CMCC(B)44102)和金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)，由中國微生物菌種保藏中心提供；副溶血弧菌由廣西大學水產(chǎn)病害實驗室分離保存；豬輪狀病毒(PoRV)和豬丁型冠狀病毒(PDCoV)強陽性糞便樣品，由廣西獸醫(yī)研究所收集和提供。

1.2 主要儀器和設備

ZQ2002微電腦自動斬切機、CTS300XYZ數(shù)控裁條機和HM3035三維化膜噴金儀由上海金標生物科技有限公司生產(chǎn)；熒光試紙條讀值儀由北京納諾金生物科技有限公司研制。

1.3 熒光免疫層析試紙條的制備和優(yōu)化

1.3.1 量子點微球標記抗體的制備

取25 μL濃度為1 μmol/L的羧基化量子點微球，加入25 μL 20 mmol/L MES(pH=6.0)，混勻后分別加入現(xiàn)配的0.5 μL 20 mg/mL EDC和0.5 μL 20 mg/mL NHS，混勻后超聲5 min，再于37 ℃活化15 min。然后于8 000g離心20 min，棄去上清液。用25 μL 10 mmol/L MES(pH=6.0)重懸沉淀，加入10 μg PEDV抗體，混勻后置于37 ℃避光反應1 h，反應后用0.1 mol/L甘氨酸封閉30 min。5 510g離心15 min，棄去上清液后，用50 μL硼酸鹽緩沖液(BB)重懸沉淀，再次離心棄去上清液。用復溶液(濃度為10 mmol/L的Tris緩沖液，pH=8.5，添加有10%蔗糖、10%海藻糖、0.5% BSA和0.2%吐溫20)重懸沉淀，涂于結合墊上，37 ℃真空烘干3 h。

1.3.2 熒光免疫層析試紙條的組裝與樣品檢測

利用接觸式自動劃膜儀將鼠抗PEDV單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體分別包被在NC膜上作為檢測線及質(zhì)控線，37 ℃烘干3 h。然后將固定有T線和C線抗體的NC膜、噴涂有量子點微球標記抗體的結合墊、樣品墊和吸水紙依次粘貼到PVC底板上，并采用數(shù)控裁條機裁成3.0 mm寬的試紙條。

將60 μL樣品滴加到樣品墊上，室溫放置10 min后，用波長為365 nm的紫外手電筒觀察結果。若T線、C線均有條帶出現(xiàn)，判定為陽性；若T線沒有條帶，C線有條帶，則判定為陰性；若C線沒有條帶，則判定試紙條無效，需重新檢測。

1.3.3 量子點微球標記抗體最佳復溶液體積的確定

將采用25 μL量子點微球體系標記好的抗體離心后，分別用150、300、600和900 μL復溶液重懸后，制備熒光試紙條，并用于樣品的檢測，根據(jù)試紙條顯色程度確定最佳復溶液體積。

1.3.4 檢測線和質(zhì)控線抗體包被濃度的確定

分別采用0.3、0.5和1.0 mg/mL的鼠抗PEDV單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體包被T線和C線，并以PBST和稀釋后的病毒液上樣，測試試紙條T線、C線的顯色程度。用不同濃度的抗體劃膜，以相同樣品上樣測試，以試紙條顯色程度確定T線、C線的劃膜抗體濃度。

1.4 熒光免疫層析試紙條的性能考察

1.4.1 敏感性考察

1.4.2 特異性考察

利用熒光試紙條分別檢測PoRV(強陽性豬糞便樣品)，PDCoV(強陽性豬糞便樣品)，PCV2病毒液(1.0×106TCID50/mL)，PRV病毒液(1.0×106TCID50/mL)，沙門菌(1.0×107CFU/mL)，大腸桿菌(1.0×107CFU/mL)，金黃色葡萄球菌(1.0×107CFU/mL)及副溶血球菌(1.0×107CFU/mL)，并設置PEDV陽性對照和陰性對照，根據(jù)T線熒光信號判斷試紙條的特異性。

1.4.3 臨床樣品檢測

分別采用熒光試紙條和RT-PCR對50份樣品(腸道組織或肛門拭子，由生豬養(yǎng)殖公司和第三方檢測公司提供)中的PEDV進行檢測，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。使用試紙條進行檢測時，取臨床樣品1 g，加入1 mL的樣品稀釋液，震蕩混勻后離心，取60 μL上清液滴于樣品墊位置，待10 min時觀察C、T線顯色結果及測定熒光值。對于RT-PCR，取臨床樣品1 g，加入3 mL PBS，反復凍融3后，提取核酸，反轉錄后分別以5′-AAGGCTCCATCATCTTTACG-3′和5′-ACTCCGATACGAG-TCTAGCG-3′為上下游引物，對PEDV的N基因進行PCR擴增。PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結果

2.1 量子點標記最佳復溶液體積的確定

將25 μL羧基化量子點體系標記的抗體分別用150、300、600和900 μL復溶液重懸后涂布于結合墊上制備試紙條，檢測PEDV陰性和陽性樣品后根據(jù)試紙條顯色程度確定最適復溶液體積。圖1顯示，各試紙條的C線的熒光顯色均清晰，均無假陽性出現(xiàn)，膜面干凈。但從陽性樣品檢測結果發(fā)現(xiàn)，用600 μL和900 μL體積的復溶液會導致T線不顯色。用150 μL和300 μL復溶液重懸標記抗體制備的試紙條T線清楚，但用300 μL體積復溶液的試紙條結合墊比用150 μL體積復溶液的釋放更全，可得出最佳復溶液體積為300 μL。

1～4. 復溶液體積分別為150、300、600和900 μL。

2.2 檢測線和質(zhì)控線抗體包被濃度的確定

采用不同濃度的鼠抗PEDV單克隆抗體和羊抗鼠IgG多克隆抗體分別包被T線和C線，并對陰性樣品和陽性樣品進行檢測。由圖2和圖3可見，當試紙條T線包被濃度為0.5 mg/mL，C線包被濃度為0.3 mg/mL時，試紙條的顯色清晰，且所耗抗體量少。因此，后續(xù)研究采用的T線包被濃度均為0.5 mg/mL，C線包被濃度均為0.3 mg/mL。

1. T線包被濃度0.3 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL；2. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL；3. T線包被濃度1.0 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL。

1. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度0.3 mg/mL；2. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度0.5 mg/mL；3. T線包被濃度0.5 mg/mL，C線包被濃度1.0 mg/mL。

2.3 敏感性考察

將載毒量為1.0×104TCID50/mL的PEDV病毒液以1∶10、1∶20、1∶30、1∶35、1∶40和1∶50的比例進行稀釋后，采用制備好的PEDV熒光試紙條對PEDV稀釋液進行檢測，平行重復5次，考察試紙條的靈敏度。根據(jù)圖4試紙條顯色程度，可知當病毒以1∶10、1∶20、1∶30和1∶35稀釋時，T線均顯色清晰；當病毒以1∶40和1∶50稀釋時，T線顯色不清晰，與陰性對照相似。采用熒光試紙條讀值儀測定T線熒光值，結果如表1所示。對陰性樣品重復檢測的結果為294，故檢測閾值確定為336。由表1可見，當病毒以1∶50稀釋時，T線熒光值為369，大于閾值。因此，所制備的熒光試紙條基于肉眼觀察和熒光試紙條讀值儀的檢測限分別確定為2.9×102TCID50/mL和2.0×102TCID50/mL。

1～6. 病毒液稀釋倍數(shù)為10、20、30、35、40、50；7. 陰性對照。

表1 試紙條靈敏度試驗熒光值

2.4 特異性測定

使用所制備的熒光免疫層析試紙條對PoRV、PDCoV、PCV2、PRV、沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及副溶血球菌進行檢測，結果如圖5所示?？梢?，只有檢測PEDV陽性樣品時，試紙條T線清晰可見；而檢測其他病原時，結果如檢測陰性樣品一致，均無T線顯示，說明試紙條特異性較好。

1～10. 分別為陰性樣品、PEDV、PoRV、PDCoV、PCV2、PRV、沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血球菌。

2.5 臨床樣品檢測

分別采用熒光試紙條和RT-PCR對50份臨床樣品進行檢測，結果如表2所示。根據(jù)表2結果，計算得到的PEDV熒光免疫層析試紙條與RT-PCR的陽性符合率為76.2%，陰性符合率為89.7%，總符合率為90.0%，說明所制備的PEDV熒光試紙條具有較高的準確性。

表2 試紙條和RT-PCR臨床樣品檢測

3 討論

PED主要經(jīng)糞-口傳播，隨糞便排出的病毒可形成氣溶膠顆粒隨空氣進行遠距離傳播感染其他仔豬，最遠傳播距離可達10英里[17-18]。PEDV感染后，豬可出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、厭食、脫水和體重減輕等臨床癥狀，哺乳仔豬大量死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染早期的治愈率遠高于后期，所以PEDV感染的早期診斷對PED的防控尤其重要[21]。

量子點又稱半導體納米晶體，是一種穩(wěn)定的納米晶粒，具有發(fā)光率高、壽命長、光穩(wěn)定性好等優(yōu)勢[22]。近年來，量子點制備和表面修飾技術得到了快速發(fā)展，量子點作為熒光探針在生物醫(yī)學、食品安全等領域中應用越來越廣泛[22-23]。PEDV熒光免疫層析將免疫熒光和免疫層析技術相結合，在保留膠體金免疫層析技術操作簡單、不依賴專業(yè)實驗室和設備、快速方便的優(yōu)勢的前提下，通過包含有大量量子點粒子的羧基化量子點微球作為標記材料，可有效提高試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性，實現(xiàn)生豬養(yǎng)殖場PEDV的現(xiàn)場快速準確檢測。

量子點標記抗體時，使用不同體積的復溶液會導致單位體積內(nèi)的量子點量標記抗體量的變化，進而使每根試紙條上所包含的量子點微球標記抗體的含量不同。量子點和標記抗體量較少時，會影響T、C線的顯色程度，易產(chǎn)生假陰性；量子點和標記抗體量較多時，會影響量子點的擴散，導致較多的量子點留在結合墊或使膜面不清晰，造成量子點和抗體的浪費，甚至出現(xiàn)假陽性。因此，對復溶液的用量進行優(yōu)化能使試紙條檢測在耗費最少的情況下獲得最優(yōu)結果。本研究發(fā)現(xiàn)，在25 μL量子點微球標記體系下，600 μL以上的復溶液會導致T線不顯色，而150 μL以下的復溶液會造成釋放不充分，300 μL復溶液重懸標記抗體制備的試紙條T線清楚，釋放完全，膜面干凈。

本研究制備的PEDV量子點熒光免疫層析試紙條，基于肉眼觀察和熒光試紙條讀值儀的檢測限分別為2.9×102TCID50/mL和2.0×102TCID50/mL。邊紅芬等[24]基于細胞表面熒光免疫吸附法制備單克隆抗體，研制出一種用于PEDV現(xiàn)場檢測的新型免疫層析方法，最低檢測限為7.8×103TCID50/mL。王華俊等[25]建立了一種快速、定量檢測PEDV的時間分辨熒光免疫層析檢測方法，對PEDV的最低檢測限為3 896 997 TCID50/mL。Lyoo等[26]開發(fā)了一種用于PEDV檢測的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為1.0×104TCID50/mL。因此，本研究制備的免疫層析試紙條具有更高的靈敏度，有望用于PEDV的現(xiàn)場快速檢測。