劉鏑鉞，程子龍，陳益，陳思宇，李文良，毛立，楊蕾蕾，孫敏，張紋紋，熊富強(qiáng)，劉茂軍，4*

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；4. 獸用生物制品(泰州)國泰技術(shù)創(chuàng)新中心，江蘇 泰州 225300)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)可以引起牛、羊等多種反芻動(dòng)物發(fā)生病毒性腹瀉，該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，BVDV自然感染對象主要是奶牛和黃牛，也可感染牦牛、山羊、綿羊和豬等[1]。感染BVDV的牛主要表現(xiàn)為腹瀉、消化道黏膜糜爛、產(chǎn)奶量下降、持續(xù)性感染、呼吸綜合征等[2]，懷孕母牛會(huì)發(fā)生流產(chǎn)、胎兒畸形、木乃伊胎、死胎、繁殖力下降等繁殖障礙[3]，病牛不僅表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀，也會(huì)出現(xiàn)免疫力下降，從而繼發(fā)感染其他病原或與其他病原共感染[4]，使患病牛發(fā)病率和死亡率大大增加。近年來BVDV感染呈上升趨勢，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

BVDV是黃病毒科瘟病毒屬的成員之一，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12.5 kb[3]。根據(jù)5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR)以及Npro、E2基因序列的遺傳進(jìn)化關(guān)系，將BVDV分為基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)，目前已鑒定出BVDV-1至少有22個(gè)基因亞型(1a～1v)、BVDV-2有4個(gè)基因亞型(2a～2d)[6-7]。根據(jù)體外培養(yǎng)是否可以導(dǎo)致細(xì)胞病變分為致細(xì)胞病變型(cytopathic，CP)和非致細(xì)胞病變型(noncytopathic，NCP)2種生物型，在臨床中主要分離到的毒株類型是NCP型BVDV[8-9]。BVDV各基因型與基因亞型毒株在抗原性、毒力和致病性等方面存在一定的差異[10]，且僅存在部分交叉保護(hù)。隨著國際貿(mào)易的增加，牛頻繁調(diào)運(yùn)，BVDV毒株持續(xù)變異，新的基因亞型不斷出現(xiàn)。

BVDV感染動(dòng)物模型的建立一直備受關(guān)注，多位學(xué)者分別通過不同的感染途徑感染新西蘭白兔、BALB/c小鼠，探索了BVDV感染的動(dòng)物模型，證實(shí)BVDV可感染新西蘭白兔和BALB/c小鼠，可引起病毒血癥，均無明顯癥狀[11-14]。不同BVDV基因型之間的致病性差異尚不清楚，本研究利用腹腔注射的方式，分別用本試驗(yàn)分離株JS2201與參考株C24V、C1602建立BALB/c小鼠感染模型，系統(tǒng)地比較了BVDV-1型和BVDV-2型之間的致病性差異，并對目前華東地區(qū)分離的流行株致病性進(jìn)行了分析，為BVDV疫苗的開發(fā)以及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

MDBK細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，經(jīng)檢測BVDV、支原體陰性。BVDV-1型Oregon C24V株和BVDV-2型C1602株均由本實(shí)驗(yàn)室保存，JS2201株(GenBank：OP856581)為本實(shí)驗(yàn)室2022年從江蘇病死牛的肺臟中分離到的毒株，為BVDV-1b亞型。SPF級雌性BALB/c小鼠(體重18～22 g)購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FPS)為Gibco公司產(chǎn)品，經(jīng)檢測BVDV、支原體病原陰性，BVDV抗體陰性。TRIzol購自TaKaRa公司。一步法qRT-PCR試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 BVDV病毒液制備

將生長良好的MDBK單層細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入PBS至細(xì)胞瓶，輕輕搖晃，倒掉細(xì)胞瓶中液體，重復(fù)操作3次，按1%的比例分別加入純化后的BVDV-1型分離株JS2201株、BVDV-2型分離株C1602和標(biāo)準(zhǔn)株Oregon C24V，加入2 mL制備的細(xì)胞維持溶液(2%胎牛血清DMEM)，輕輕搖晃細(xì)胞瓶中的維持溶液，直到細(xì)胞瓶完全覆蓋，并將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中2 h后，丟棄細(xì)胞瓶中的液體，用移液管吸收剩余的液體，然后加入10 mL相同濃度的維持溶液，并將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。攻毒完成后，每天通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況。培養(yǎng)2～3 d后，當(dāng)細(xì)胞損傷約80%時(shí)收獲病毒溶液。將細(xì)胞培養(yǎng)物置于-80 ℃冷凍。重復(fù)冷凍和解凍3次后，收獲病毒溶液20 mL，分裝保存于-80 ℃冰箱。

1.4 半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(TCID50)的測定

將生長良好的單層MDBK細(xì)胞，用胰酶消化制備成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞量達(dá)到2×105～3×105個(gè)/mL，將其加入至96孔細(xì)胞板，每孔100 μL，將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的3株BVDV進(jìn)行RT-PCR鑒定后[13]，分別用無抗無血清的DMEM將病毒液按照10倍倍比稀釋，從10-1稀釋到10-8，將稀釋好的病毒液加入到細(xì)胞長至80%左右的96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)置陰性對照孔(加入100 μL無抗無血清DMEM)，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中；接毒1 h后，棄掉病毒液，每孔加入100 μL含2% FBS的DMEM維持液，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h；通過觀察并記錄細(xì)胞病變孔或者間接免疫熒光記錄細(xì)胞感染孔，按照Reed-Muench法分別計(jì)算Oregon C24V、JS2201、C1602株BVDV的TCID50。

1.5 BALB/c小鼠的致病性試驗(yàn)

將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別為JS2201組、C1602組、C24V組和對照組，每組6只。適應(yīng)3 d消除應(yīng)激后，JS2201組、C1602組、C24V組小鼠每只經(jīng)腹腔注射1 mL相應(yīng)病毒液，濃度分別為104.5/0.1 mL，104.33/0.1 mL和103.5/0.1 mL進(jìn)行攻毒，對照組每只注射1 mL MDBK細(xì)胞上清液，每天觀察記錄小鼠的臨床癥狀，及時(shí)剖檢死亡小鼠，并觀察記錄剖檢病變情況，及時(shí)采取樣品。

分別于感染0、3、7和10 d測定小鼠體重，感染后3、7和10 d每組各隨機(jī)選擇3只小鼠，通過眼眶采集EDTA抗凝血，用于病毒血癥和血常規(guī)檢測。于感染后的7、10 d，各取3只小鼠的肺、脾、腎、肝等臟器組織，分別測定器官指數(shù)和病毒載量，并將肺臟和脾臟用4%多聚甲醛溶液固定后用于病理組織切片制作。

1.6 小鼠血常規(guī)檢測與病理組織學(xué)觀察

采集的小鼠血液送南京金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行血常規(guī)檢測，主要包括白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血小板等血細(xì)胞計(jì)數(shù)。小鼠各組織樣品經(jīng)4%多聚甲醛固后送南京爍樸生物科技有限公司進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.7 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

各組織樣品經(jīng)研磨、反復(fù)凍融后，12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用TRIzol法提取血液及各臟器組織懸液中的RNA，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-qPCR方法檢測各樣品中的BVDV載量。BVDV-F：5′-GTGGTGAGTTCGTTGGATGG-3′，BVDV-R：5′-GGCTGTATTCGTAGCAGTTGAT-3′。反應(yīng)程序：50 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，測定病毒載量(用Ct值換算出拷貝數(shù))。用GraphPad Prism 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖及統(tǒng)計(jì)分析，并對檢測結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 BVDV鑒定及其TCID50測定

通過BVDV 5′UTR片段特異性引物對3種毒株進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果在288 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖1)，大小與預(yù)期相符。進(jìn)一步對擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收、克隆至T載體并進(jìn)行測序，確定所用毒株均為BVDV。通過測定，JS2201、C1602和Oregon C24V株的TCID50分別為10-4.5/0.1 mL、10-4.33/0.1 mL和10-3.5/0.1 mL。

1. JS2201株；2. C1602株；3. Oregon C24V株；4. 陰性對照；M.DL2000 DNA Marker。

2.2 小鼠的體重變化以及臨床癥狀

通過腹腔注射分別感染3種毒株的小鼠以及對照組小鼠均未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀。在感染后0～10 d，攻毒組小鼠與對照組小鼠相比體重差異不顯著(圖2)，表明BVDV感染對小鼠體重?zé)o明顯影響。

圖2 攻毒后BALB/c小鼠體重變化

2.3 攻毒后外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞檢測

分別于攻毒后的第3、7和10天采集血液進(jìn)行血常規(guī)測定，結(jié)果顯示：小鼠血液中白細(xì)胞數(shù)量，在攻毒后第3天 C24V組比對照組高，但差異不顯著(P>0.05)；JS2201組與C1602組均比對照組低，但差異不顯著(P>0.05)；JS2201組則顯著低于C24V組(P<0.05)。在攻毒后第7天，3組攻毒小鼠白細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)下降，且攻毒組均顯著低于對照組(P<0.05)。攻毒后第10天，3組攻毒小鼠白細(xì)胞數(shù)量均有所恢復(fù)，但仍低于對照組，差異不顯著(P>0.05)(圖3A)。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同。

血液中的淋巴細(xì)胞數(shù)量在攻毒后第3天，C1602、C24V組高于對照組；JS2201組低于對照組，但差異均不顯著(P>0.05)；C1602組顯著高于JS2201組(P<0.05)。在攻毒后第7天，3組攻毒小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量降低，并低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。攻毒后第10天，JS2201組與C24V組淋巴細(xì)胞數(shù)量仍低于對照組，C1602組高于對照組，但差異均不顯著(P>0.05)(圖3B)。

小鼠淋巴細(xì)胞百分比在攻毒后第3天，3個(gè)攻毒組均顯著高于對照組(P<0.05)。在攻毒后第7天和第10天，攻毒組淋巴細(xì)胞百分比持續(xù)下降，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖3C)。

2.4 剖檢病變及病理組織學(xué)變化

在攻毒后第7、10天，每組分別隨機(jī)安樂死3只小鼠，觀察各組織器官病變情況。JS2201、C1602、C24V組小鼠在攻毒后第7、10天肺臟均出現(xiàn)輕微的實(shí)變和充血，病變程度無明顯差異，脾臟均無明顯剖檢病變，陰性對照組肺臟與脾臟均未觀察到明顯病變(如圖4)。

圖4 攻毒后BALB/c小鼠肺臟、脾臟的剖檢病變

組織病理學(xué)分析顯示，JS2201、C1602、C24V株組小鼠在攻毒后第7、10天肺臟可見明顯間質(zhì)性肺炎病變，肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁及支氣管周圍可見以淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁毛細(xì)血管充血。其中BVDV-2型C1602株攻毒組小鼠肺臟(圖5B、F)相較于JS2201組(圖5A、E)和C24V組(圖5C、G)表現(xiàn)為更為嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎，JS2201組和C24V組小鼠肺泡壁毛細(xì)血管則表現(xiàn)為較為嚴(yán)重的充血變化，而JS2201與C24V株組小鼠肺臟病變差異不明顯；對照組小鼠肺臟無明顯病理變化(圖5D、H)。

注：黃色箭頭為巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤、肺泡間隔變寬；綠色箭頭為肺泡壁毛細(xì)血管充血。

2.5 攻毒后BALB/c小鼠病毒血癥以及各組織器官病毒載量檢測

在攻毒后第3、7和10天分別采集各組小鼠血液，在攻毒后第7、10天采集肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、血液等組織器官樣品進(jìn)行病毒載量的檢測。結(jié)果顯示，對照組各組織器官樣品都未檢測到病毒；各感染組在感染后第3天均出現(xiàn)病毒血癥，且持續(xù)到第10天仍能檢測到；JS2201組小鼠在攻毒后第7、10天血液中病毒含量顯著高于C1602組和C24V組(P<0.05)(圖6A)。在攻毒后第7、10天，攻毒組小鼠肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中均能檢測到病毒，在攻毒后第7天，JS2201組小鼠脾臟病毒載量顯著高于C24V組(P<0.05)，其余各組織病毒載量差異不顯著(P>0.05)(圖6B)；在感染后第10天，JS2201組肝臟、脾臟病毒載量顯著高于C1602組(P<0.05)，肺臟、腎臟中病毒載量差異不顯著(P>0.05)(圖6C)。

A.攻毒后各組小鼠病毒血癥情況；B、C.攻毒后7、10 d各組小鼠組織器官病毒載量。

3 討論

健康牛與其他持續(xù)感染牛之間的直接或間接接觸被認(rèn)為是BVDV原發(fā)感染或繼發(fā)感染的主要來源，由于其引起免疫抑制，在養(yǎng)牛生產(chǎn)中已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。用小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立發(fā)病模型是研究牛病的重要手段。前期研究表明通過腹腔注射小鼠感染BVDV的成功率高于其他途徑，因此，本研究選用腹腔注射方法進(jìn)行感染。先前有研究報(bào)道，感染BVDV的小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀[15]，但病毒血癥的存在提供了小鼠感染BVDV的證據(jù)。在本次研究中，BALB/c小鼠通過腹腔注射感染了BVDV-1型分離株、BVDV-2型分離株和Oregon C24V標(biāo)準(zhǔn)毒株，小鼠也未觀察到臨床癥狀，但都出現(xiàn)了病毒血癥，結(jié)果與之相似。在感染后第7、10天，小鼠剖檢可觀察到肺臟均出現(xiàn)輕微的實(shí)變和充血，不同毒株間病變程度無明顯差異，脾臟均無明顯剖檢病變，陰性對照組肺臟與脾臟均未觀察到明顯病變，初步證明BVDV能夠感染BALB/c小鼠，且能致其組織出現(xiàn)相應(yīng)病變，但各毒株之間造成的肺臟剖檢病變無明顯差異。1型、2型BVDV均可成功感染BALB/c小鼠，均可形成病毒血癥，且均可以在肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中有效復(fù)制，但BVDV JS2201分離株在小鼠體內(nèi)復(fù)制能力明顯強(qiáng)于C1602株和Oregon C24V株。有研究報(bào)道，通過免疫組織化學(xué)方法在感染小鼠的脾臟中檢測到BVDV抗原[15]，本研究采用RT-qPCR方法檢測感染小鼠各組織中病毒載量，結(jié)果顯示在肺、脾臟器中的病毒載量最高，與報(bào)道結(jié)果一致。

有研究表明，細(xì)胞病變型和非細(xì)胞病變型BVDV感染小鼠會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞耗竭和脾臟中巨核細(xì)胞數(shù)量增加，以及血小板減少癥和淋巴細(xì)胞減少癥[16-17]，本研究結(jié)果與之相似；血常規(guī)結(jié)果顯示，在感染后第7天時(shí)，與對照組相比，攻毒組白細(xì)胞顯著下降，攻毒組淋巴細(xì)胞與對照組相比下降，但差異不顯著；在感染后第10天時(shí)白細(xì)胞有所升高，但仍低于對照組；C1602組淋巴細(xì)胞上升，高于對照組，JS2201和C24V組仍低于對照組。

以上研究結(jié)果表明，BVDV-1型和BVDV-2型分離株和參考株感染BALB/c小鼠后均可在其組織臟器中檢測到BVDV，且均能致其肺組織出現(xiàn)一定的病理損傷，與吳陳華等[18]結(jié)果相似?？傊?，本研究通過腹腔注射的方式將1型、2型和參考株BVDV感染BALB/c小鼠，根據(jù)臨床癥狀和病理變化，血常規(guī)、病毒載量等結(jié)果，建立了不同亞型BVDV急性感染的小鼠模型，為進(jìn)一步對BVDV的疫苗研制和致病機(jī)理等研究奠定了基礎(chǔ)。