孟衛(wèi)芹，王金良*，吳信明，唐娜，李通，石競楠，董帥，沈志強

(1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；3. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；4. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000)

山羊痘是由山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)感染引起的發(fā)病急、熱性、高度接觸性傳染病，造成被感染山羊的皮膚、消化道黏膜和呼吸道出現(xiàn)痘疹等癥狀，是具有嚴(yán)重威脅的一種動物痘病[1]。山羊痘被世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)列為必須通報的動物疫病[2-6]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為二類傳染病。該病廣泛分布于世界各地，如非洲、中東、北歐各國等[7]，近幾年來，在我國多個地區(qū)也有相關(guān)報道[8-9]。該病的發(fā)病率和死亡率均較高，尤其羔羊感染后的死亡率最高可達100%[10]，給部分地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

GTPV基因組為線性雙股、兩端共價閉合的DNA，長度約為150 kb，編碼約150個蛋白[11]。P32蛋白是位于羊痘病毒膜表面的一種結(jié)構(gòu)蛋白，包含1個重要抗原決定簇，能誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的中和抗體[12]，可以用于建立血清學(xué)診斷技術(shù)。目前常用的血清學(xué)檢測方法有病毒中和試驗(VNT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、瓊脂擴散試驗(AGID)和間接免疫熒光(IFA)等[13-14]，這些方法存在費時費力、試驗步驟繁瑣、特異性和敏感性不高等缺點；PCR技術(shù)也可用于檢測山羊痘[15]，但需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員，不利于在基層推廣。熒光微球免疫學(xué)檢測技術(shù)(FMIA)是一種超敏免疫分析方法[16]，具有低背景、強特異性、高靈敏度等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、藥物、激素等的快速檢測分析[17]。

本研究將實驗室前期成功構(gòu)建的pET28a-P32重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)誘導(dǎo)表達及純化后得到重組P32蛋白，以鑭系元素銪(Eu)及其螯合物作為標(biāo)記物對重組蛋白進行偶聯(lián)標(biāo)記，成功建立了一種快速檢測GTPV抗體的熒光微球免疫層析方法，為山羊痘病毒抗體的現(xiàn)場快速檢測提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 血清

GTPV陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；GTPV陰性血清，山羊副流感病毒3型(CPIV3)，小反芻獸疫病毒(PPRV)，羊口瘡病毒(ORFV)陽性血清和兔抗山羊IgG多抗均由本實驗室保存；120份臨床血清樣品為內(nèi)蒙古、山東等地羊場送檢保存。

1.2 主要試劑和耗材

原核表達重組質(zhì)粒pET28a-P32由山東省濱州預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點實驗室保存，截取了P32蛋白抗原表位集中的N端2 ～ 141 aa區(qū)域進行表達；大腸桿菌BL21(DE3)、DNA Marker、低分子量蛋白Marker、DAB底物顯色液等購自寶生物(大連)工程有限公司；山羊痘病毒抗體ELISA檢測試劑盒購自山東綠都生物科技有限公司；Eu-熒光微球(粒徑為210 nm)購自南京微測生物科技有限公司；EDC[1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亞胺鹽酸鹽]購自Sigma公司；硝酸纖維素膜(NC膜)購自上海杰一生物有限公司；樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙、PVC板購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；其他試劑為國藥分析純。

1.3 主要儀器

超聲波細(xì)胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；試紙條噴點平臺購自美國BioDot公司；HGS201切條機購自杭州峰航科技有限公司；ZWYR-2102C恒溫?fù)u床購自上海智城分析儀器制造有限公司；MD-100干式熒光分析儀購自上海飛測生物科技有限公司。

1.4 P32重組蛋白的表達、純化與鑒定

將pET28a-P32重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h，收集菌體并超聲，離心取沉淀溶于8 mol/L尿素溶液中，復(fù)性后用鎳離子親和層析法純化目的蛋白。SDS-PAGE分析純化蛋白，通過半干轉(zhuǎn)印法將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶37 ℃封閉2 h，含0.5%吐溫-20的Tris-HCl緩沖液(TBST)洗滌，加入1∶100稀釋的GTPV抗體陽性兔血清4 ℃過夜，TBST洗滌后加入顯色液，室溫避光顯色30 min觀察鑒定結(jié)果。

1.5 試紙條的制備

1.5.1 微球標(biāo)記

取固體含量為1%的Eu-熒光微球分散液100 μL，加入400 μL pH=8.0的硼酸緩沖溶液(BBS)，再加入20 μL 10 mg/mL的EDC溶液，室溫活化30 min；12 000 r/min、4 ℃離心15 min，將沉淀洗滌1次，用500 μL BBS重懸；超聲分散后，加入0.1 mg P32蛋白，室溫孵育2 h，用終濃度1%的BSA在4 ℃過夜封閉；以12 000 r/min、4 ℃離心15 min，等體積復(fù)溶液(0.1%的BSA，BBS緩沖液)復(fù)溶，超聲分散后置于2 ～ 8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 NC膜劃線

以0.05 mol/L硼酸緩沖液為包被液，用點膜儀以50 mm/s的速度、5 μL/cm的劑量將稀釋后的兔抗山羊IgG多抗、P32蛋白分別噴在NC膜的質(zhì)控線(C線)、檢測線(T線)位置，37 ℃烘箱中烘干2～3 h后密封備用。

1.5.3 結(jié)合墊的制備

將熒光微球標(biāo)記的P32蛋白稀釋成系列濃度，均勻的噴在結(jié)合墊上，37 ℃烘箱中烘干2～3 h后密封備用。

1.5.4 試紙條的組裝

將NC膜、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊依次貼于PVC底板上，用切條機切成4 mm寬的試紙條，裝入卡殼，置于含干燥劑的鋁箔袋內(nèi)密封備用。

1.5.5 結(jié)果判定

將待檢血清用pH=8.0的Tris-HCl溶液稀釋100倍，吸取80 μL樣品滴加到試紙條樣品孔中，反應(yīng)結(jié)束后在熒光分析儀上讀取信噪比值(T/C)。參照標(biāo)準(zhǔn)[18]，當(dāng)T/C<0.1時，判定為陰性；當(dāng)T/C≥0.1時，判定為陽性。

1.6 試紙條反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.6.1 劃線濃度的優(yōu)化

C線濃度設(shè)定為0.5 mg/mL，將T線劃線濃度稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。檢測GTPV陰性、陽性血清樣本，通過熒光分析儀讀取T/C，根據(jù)陽性血清(P)和陰性血清(N)比值，即P/N值篩選最佳劃線濃度。

1.6.2 熒光微球復(fù)溶稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

熒光微球按照50、100、200、400倍復(fù)溶，分別檢測陰性、陽性血清樣本，讀取T/C值，根據(jù)P/N值確定合適的復(fù)溶稀釋倍數(shù)。

1.6.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

加樣后分別在5、10、15、20、25 min時讀取數(shù)據(jù)，以T/C值穩(wěn)定、P/N值最大且時間最短為最佳反應(yīng)時間。

1.7 性能評價

1.7.1 特異性

用制備的熒光微球試紙條檢測GTPV、CPIV3、PPRV、ORFV陽性血清及GTPV陰性血清，每份血清樣本做3個重復(fù)，讀取T/C值，以評價試紙條的特異性。

1.7.2 敏感性

將GTPV陽性血清參照品按2倍倍比稀釋(1∶50～1∶1 600)，各取80 μL滴加于試紙條樣品孔中，讀取T/C值，以評價該試紙條的敏感性。

1.7.3 重復(fù)性

取同一批次和不同批次制備的熒光微球試紙條，分別對6份臨床血清樣品進行檢測，每份血清做3個重復(fù)，讀取T/C值，計算批內(nèi)與批間變異系數(shù)(CV)。

1.7.4 穩(wěn)定性

將同批次制備的試紙條干燥密封后置于37 ℃條件下進行加速老化試驗，每天隨機取出1組檢測陰性、陽性血清，每組3個平行，讀取T/C值。

1.8 臨床樣本的檢測

采用優(yōu)化后的試紙條對120份臨床山羊血清進行檢測，將檢測結(jié)果與山東綠都ELISA試劑盒檢測方法作對比，計算2種檢測方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 P32蛋白的表達、純化與鑒定

經(jīng)SDS-PAGE顯示在大約16 kDa處可見目的條帶(圖1A)，使用鎳離子親和層析法純化得到P32蛋白，質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL；Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白可以與GTPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B)，表明具有良好的反應(yīng)原性。

M1. 蛋白Marker；1. 誘導(dǎo)后上清液；2. 誘導(dǎo)后沉淀；3. 純化蛋白；M2. 預(yù)染蛋白Marker；4. 純化蛋白與陽性血清反應(yīng)。

2.2 試紙條反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 劃線濃度的優(yōu)化

由圖2中可知，當(dāng)T線劃線濃度為0.2 mg/mL時，P/N值最大，因此選擇C線0.5 mg/mL、T線0.2 mg/mL為最佳劃線濃度。

圖2 T線最佳劃線濃度確定

2.2.2 熒光微球復(fù)溶稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

從圖3中可知，當(dāng)熒光微球按照200倍稀釋復(fù)溶時，陽性血清T/C值較高，P/N值最大，因此選擇200倍為最佳復(fù)溶稀釋倍數(shù)。

圖3 熒光微球最佳復(fù)溶稀釋倍數(shù)確定

2.2.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

從圖4可以看出，15 min后T/C值較穩(wěn)定，P/N值最大，因此選擇在反應(yīng)時間為15 min時讀取結(jié)果。

圖4 最佳反應(yīng)時間確定

2.3 性能評價

2.3.1 特異性

用制備的試紙條對CPIV3、PPRV、ORFV、GTPV陽性血清及GTPV陰性血清進行檢測。結(jié)果顯示，只有GTPV陽性血清檢測結(jié)果T/C值大于0.1，其余均為陰性(表1)，表明該試紙條特異性良好。

表1 特異性試驗結(jié)果

2.3.2 敏感性

將GTPV陽性血清按2倍倍比稀釋(1∶50～1∶1 600)，稀釋800倍時，T/C值仍大于0.1，為陽性，說明該試紙條的敏感性較高。

2.3.3 重復(fù)性

用同一批次與不同批次的試紙條對6份臨床山羊血清檢測，表2結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間變異系數(shù)小于15%，說明該試紙條重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果(n=6)

2.3.4 穩(wěn)定性

在37 ℃條件下進行加速老化試驗，測得試紙條T/C值變化相對穩(wěn)定(圖5)，在7 d時仍可準(zhǔn)確讀出陰性、陽性血清。表明在37 ℃條件下至少可保存7 d，該試紙條穩(wěn)定性較好。

圖5 37 ℃條件加速老化試驗

2.4 臨床樣品的檢測

試紙條與ELISA試劑盒檢測對比結(jié)果見表3，經(jīng)ELISA方法檢測的70份陽性血清中檢出5份陰性，陽性符合率為92.86%；50份陰性血清中檢測出4份陽性，陰性符合率為92%；總體符合率為92.5%，說明試紙條準(zhǔn)確性較高。

表3 試紙條與ELISA檢測結(jié)果

3 討論

我國對山羊痘的控制主要通過接種疫苗來完成，羊痘弱毒疫苗在羊痘防控過程中發(fā)揮了巨大作用。由于該疫苗有效接種途徑為尾部皮內(nèi)注射，具有一定的接種難度，因操作失誤等原因可導(dǎo)致疫苗免疫失敗，使羊具有感染羊痘病毒的風(fēng)險。國內(nèi)外已建立了多種GTPV檢測方法，常規(guī)的病毒中和試驗應(yīng)用表達熒光蛋白的重組羊痘病毒，使檢測時間大大縮短[15]；有學(xué)者針對GTPV建立了快速、靈敏的PCR診斷技術(shù)，并已經(jīng)研究出可同時識別山羊痘病毒和羊口瘡病毒的PCR檢測方法[19]；程汝佳等[20]選取ORF068基因保守區(qū)域設(shè)計引物，建立了GTPV環(huán)介導(dǎo)等溫快速檢測方法，與實時熒光PCR方法符合率達100%。趙宏吉等[21]以G9蛋白作為包被抗原建立的GTPV間接ELISA方法，證實與P32蛋白作為包被抗原建立的 ELISA方法的檢測效果相似。

疫苗免疫抗體水平的現(xiàn)場快速監(jiān)測對于成功預(yù)防羊痘具有重要意義，目前已有商品化的羊痘病毒ELISA抗體檢測試劑盒，但因其對檢測平臺具有一定的要求，不適用于現(xiàn)場的快速檢測。1983年，Soini等[22]首次提出將稀土離子為標(biāo)記物引入到免疫分析領(lǐng)域，為FMIA檢測方法的開創(chuàng)奠定了基礎(chǔ)。該技術(shù)利用鑭系元素Eu微球共價偶聯(lián)標(biāo)記抗原或抗體，比物理偶聯(lián)更加牢固[23]。微球包裹及葡聚糖修飾技術(shù)確保了熒光離子不泄露、不受外界干擾，光穩(wěn)定性好，而且Eu離子Stoke位移大，具有時間分辨功能，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度[24]。若能同時結(jié)合便攜式熒光分析儀，操作簡便，適于在基層推廣應(yīng)用。

GTPV抗體檢測的靶蛋白中，P32蛋白是目前世界各國分離鑒定的毒株所共有的、特異性很強的結(jié)構(gòu)蛋白[25]。其中，2～141 aa區(qū)域是P32蛋白的優(yōu)勢抗原區(qū)，本試驗前期將該區(qū)域在大腸桿菌中進行截短表達、純化獲得重組P32蛋白，為熒光微球快速檢測方法的建立提供了抗原基礎(chǔ)。以熒光微球為標(biāo)記材料對P32蛋白進行標(biāo)記，以純化的多抗IgG和P32蛋白分別包被試紙條的C線與T線，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了GTPV抗體熒光微球免疫層析試紙條，豐富了GTPV快速檢測方法。經(jīng)評價，該試紙條只與GTPV陽性血清反應(yīng)，與CPIV3、PPRV、ORFV的陽性血清均無交叉反應(yīng)，特異性較強；陽性血清稀釋至800倍仍能檢出陽性，敏感性較高；隨著時間的延長，信號強度會有所減弱，但T/C值相對穩(wěn)定，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間變異系數(shù)小于15%；與ELISA檢測方法對比的總符合率為92.5%。

綜上所述，本研究建立的基于P32蛋白的GTPV抗體熒光微球快速檢測方法具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、無需大型昂貴的儀器、操作簡便等優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于羊場中GTPV抗體的監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。