一、研究背景

靶向肌肉神經(jīng)重建(targeted muscle reinnervation, TMR)是截肢手術(shù)的一種神經(jīng)處置方法。其初始目的是控制生物電假體，但對(duì)截肢后疼痛和神經(jīng)瘤有作用。一項(xiàng)多中心隊(duì)列研究表明，在截肢后2周內(nèi)接受TMR 的病人中，49.2%完全無(wú)殘肢痛，45.3%無(wú)幻肢痛。而普通截肢（無(wú)TMR）病人中，無(wú)殘肢痛和幻肢痛的比例分別為19.5%和21.5%。此外，TMR 病人服用的阿片類藥物數(shù)量顯著較少，另外兩項(xiàng)研究也證明了類似的早期TMR 在緩解疼痛方面的療效。目前TMR 也越來(lái)越多地用于治療神經(jīng)病理性疼痛。

在TMR 中，神經(jīng)遠(yuǎn)端被切除，近端與小的運(yùn)動(dòng)分支吻合。例如，在肱骨截肢術(shù)中，正中神經(jīng)被包裹在肱骨的運(yùn)動(dòng)分支上。考慮到神經(jīng)修復(fù)和再生，預(yù)計(jì)TMR 手術(shù)可能導(dǎo)致神經(jīng)瘤形成和相關(guān)疼痛增加。TMR有意地將神經(jīng)與不匹配的大尺寸進(jìn)行匹配，而忽略了模態(tài)匹配，即大型混合運(yùn)動(dòng)感覺(jué)神經(jīng)與微小的肌內(nèi)運(yùn)動(dòng)分支相連。與神經(jīng)瘤切除(neuroma excision, NE)或NE 移位術(shù)相比，假設(shè)TMR 是有效果的，因?yàn)樗股窠?jīng)“有地方可去，有事可做”。然而，臨床研究提供的機(jī)會(huì)有限，無(wú)法探討TMR后截肢病人疼痛減輕的機(jī)制。并且在臨床應(yīng)用中，在截肢后6～12 周進(jìn)行的TMR 療效可能不如截肢時(shí)進(jìn)行TMR。因此，需要了解TMR 相關(guān)疼痛緩解的機(jī)制，以提高其緩解神經(jīng)損傷后疼痛的功效。

既往的TMR 動(dòng)物模型評(píng)估了截肢時(shí)神經(jīng)軸突組織形態(tài)計(jì)量學(xué)和皮質(zhì)的記錄。但沒(méi)有測(cè)量疼痛，因?yàn)榇蠖鄶?shù)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的動(dòng)物疼痛行為測(cè)量都需要存在受影響的肢體。在該研究中使用大鼠脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)切斷的保留性神經(jīng)損傷(spared nerve injury,SNI)模型不僅模擬截肢，而且模擬主要神經(jīng)切除和由此產(chǎn)生的神經(jīng)性疼痛的一般情況。此外，評(píng)估了TMR 手術(shù)時(shí)機(jī)對(duì)損傷的影響，這對(duì)臨床應(yīng)用具有關(guān)鍵意義。

二、研究方法

1.動(dòng)物分組

成年雄性SD 大鼠被隨機(jī)分配到不同的干預(yù)組。干預(yù)手術(shù)（即TMR、NE 或假手術(shù)）的時(shí)機(jī)因評(píng)估不同假設(shè)而有所不同。Sham 組：SNI 后3 周后進(jìn)行假TMR 手術(shù)；神經(jīng)瘤切除術(shù)-3 (NE-3)：SNI 術(shù)后3 周后NE；靶向肌肉神經(jīng)重建-3 (TMR-3)：SNI 術(shù)后3 周后TMR；神經(jīng)瘤切除術(shù)-12 (NE-12)：SNI 術(shù)后12 周后NE；靶向肌肉神經(jīng)重建-12 (TMR-12)：SNI 術(shù)后12 周后TMR；即刻靶向肌肉神經(jīng)重建(iTMR)：SNI 術(shù)后即刻TMR。

2.疼痛行為測(cè)量

將大鼠單獨(dú)置于1/4 英寸網(wǎng)格上的透明塑料圍欄 (13 cm×25 cm×25 cm) 中進(jìn)行測(cè)試。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)1 h。所有的行為測(cè)試均由一個(gè)對(duì)干預(yù)組不知情的研究人員進(jìn)行。所有刺激均應(yīng)用于手術(shù)的左外側(cè)足底和未手術(shù)的右外側(cè)足底。主要監(jiān)測(cè)的疼痛行為學(xué)指標(biāo)包括vonFrey 測(cè)試、針測(cè)試、動(dòng)態(tài)刷測(cè)試、Hargreaves 測(cè)試、丙酮測(cè)試。在SNI后1 周和干預(yù)前即刻進(jìn)行疼痛行為學(xué)評(píng)分。若大鼠的疼痛行為與基線水平相比無(wú)明顯變化，則排除其進(jìn)一步干預(yù)。

3.神經(jīng)刺激

NE-3 組大鼠在NE 術(shù)后3～7 周觀察是否發(fā)生神經(jīng)再支配。暴露原結(jié)扎部位近端腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，對(duì)神經(jīng)分支進(jìn)行刺激。采用神經(jīng)刺激器(checkpoint surgical, cleveland, OH)分別刺激每條神經(jīng)，產(chǎn)生振幅為0.05 mA、持續(xù)時(shí)間為100 μs 的單個(gè)脈沖。以刺激腓腸神經(jīng)作為陰性對(duì)照。記錄肌顫的出現(xiàn)作為對(duì)刺激的反應(yīng)。

三、研究結(jié)果

1.TMR 可減輕已建立的創(chuàng)傷性神經(jīng)病理性疼痛

SNI 后3 周，大鼠被隨機(jī)分配接受TMR、假手術(shù)或NE，并在這些干預(yù)后1、3、6 和12 周進(jìn)行行為學(xué)比較。假手術(shù)組為暴露損傷坐骨神經(jīng)和切斷運(yùn)動(dòng)支的對(duì)照組。NE 組可以鑒別神經(jīng)瘤切除和運(yùn)動(dòng)支切斷的效果，與TMR 組比較，可以揭示TMR 對(duì)神經(jīng)吻合的具體效果。在SNI 后，3 組的機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏（針）、點(diǎn)狀機(jī)械過(guò)敏 (vonFrey)、動(dòng)態(tài)機(jī)械過(guò)敏（動(dòng)態(tài)刷）和冷過(guò)敏（丙酮）迅速發(fā)展到相當(dāng)?shù)乃?。在TMR-3 組中，痛覺(jué)過(guò)敏在干預(yù)后1 周迅速恢復(fù)至基線水平。同樣，vonFrey 閾值增加至基線水平，并在1、3、6 和12 周時(shí)顯著高于假手術(shù)組。動(dòng)態(tài)機(jī)械過(guò)敏（動(dòng)態(tài)刷）反應(yīng)在1 周時(shí)也迅速下降，與假手術(shù)組和NE 相比保持降低，直到6周后效果消退。TMR 組1 周后冷刺激反應(yīng)也下降了36%，且在干預(yù)后6 周仍較假手術(shù)組改善。相比之下，與假手術(shù)相比，NE 手術(shù)在干預(yù)后3 周和6 周僅在痛覺(jué)過(guò)敏方面減輕了疼痛行為。其他行為測(cè)量不受NE 的影響。SNI 不會(huì)產(chǎn)生任何熱過(guò)敏。這些發(fā)現(xiàn)表明，在SNI 后3 周進(jìn)行的TMR 快速逆轉(zhuǎn)了疼痛表型。與假手術(shù)組相比，NE 組的痛覺(jué)過(guò)敏有所改善，但在第3 周和第6 周時(shí)，痛覺(jué)過(guò)敏較基線時(shí)升高，在機(jī)械超敏和痛覺(jué)超敏方面，第3 周和第6 周時(shí)的情況與假手術(shù)組和基線時(shí)相似。

使用Dunnett 檢驗(yàn)進(jìn)行二次分析，比較每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的治療結(jié)果與前SNI 基線。結(jié)果表明，對(duì)于針和vonFrey 試驗(yàn)，只有TMR-3 使干預(yù)后所有時(shí)間點(diǎn)的疼痛行為恢復(fù)至基線水平。冷刺激測(cè)試中，只有TMR-3 在第6 周和第12 周時(shí)恢復(fù)至基線水平。NE 組vonFrey 閾值在12 周時(shí)恢復(fù)至基線水平，動(dòng)態(tài)刷測(cè)試在3 周和6 周時(shí)達(dá)到基線水平。對(duì)健側(cè)足部的分析顯示，疼痛行為與基線相比有微小變化。

2.術(shù)后神經(jīng)再生與疼痛行為改變相關(guān)

為了評(píng)估NE 組隨時(shí)間推移疼痛行為改善的可能因素，在其他亞組大鼠中，采用直接神經(jīng)刺激法，通過(guò)刺激切斷部位近端脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，確定其是否成功再生到遠(yuǎn)端斷端。在NE 后3～4 周 (n= 3)，3 條脛神經(jīng)和3 條腓總神經(jīng)中各有2 條出現(xiàn)肌肉收縮，表明功能神經(jīng)支配重建。對(duì)于所有大鼠，神經(jīng)刺激表明至少一條神經(jīng)是連續(xù)的。所有3 只大鼠的腓腸神經(jīng)刺激均未引起任何肌肉收縮，證實(shí)神經(jīng)被充分隔離以進(jìn)行單獨(dú)刺激。另一組中，在干預(yù)后6～7周的較晚時(shí)間點(diǎn) (n= 5)，刺激使5 條腓總神經(jīng)中的2 條和5 條脛神經(jīng)中的4 條產(chǎn)生了運(yùn)動(dòng)反應(yīng)。觀察到對(duì)刺激無(wú)反應(yīng)的神經(jīng)近端位于傷口內(nèi)，因此它們不指向切口遠(yuǎn)端。這些發(fā)現(xiàn)以及再生纖維的組織學(xué)證據(jù)表明，早在NE 術(shù)后3 周，神經(jīng)再生就足以與遠(yuǎn)端建立連續(xù)性，前提是神經(jīng)端彼此相對(duì)。NE 術(shù)后近端切口位置為未控制變量。并且NE-3 組的疼痛行為表現(xiàn)出隨時(shí)間推移而改善的趨勢(shì)，甚至在12周時(shí)的vonFrey 閾值以及3 周和6 周時(shí)的動(dòng)態(tài)刷測(cè)試中恢復(fù)基線水平。

TMR-3 組于術(shù)后3～4 周進(jìn)行神經(jīng)刺激，7 例脛神經(jīng)吻合中5 例出現(xiàn)股二頭肌神經(jīng)再生，7 例腓總神經(jīng)吻合中6 例出現(xiàn)半膜肌收縮。相比之下，在TMR-12 組中均沒(méi)有出現(xiàn)收縮。在干預(yù)后3～4 周，對(duì)TMR-3 和TMR-12 對(duì)合的免疫組織化學(xué)分析顯示，軸突跨越對(duì)合（β-tubulin III 染色），沒(méi)有大體神經(jīng)瘤形成，并存在再生標(biāo)志物Gap43。定性分析顯示，與TMR-12 組相比，TMR-3 組的β-tubulin III和Gap43 染色較多，這證實(shí)了神經(jīng)刺激的結(jié)果，即TMR-12 組的神經(jīng)再支配減少。

3.即刻TMR 可防止除冷超敏反應(yīng)外的疼痛行為發(fā)展

接下來(lái)，進(jìn)一步探討了TMR 在其他兩種臨床相關(guān)情況下是否有效：在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生之前受傷時(shí)進(jìn)行的TMR，以及TMR 應(yīng)用于已確定的慢性神經(jīng)病理性疼痛。為了回答這個(gè)問(wèn)題，評(píng)估另外兩組大鼠：在SNI 時(shí)進(jìn)行的TMR（即刻TMR，iTMR）和在SNI 后12 周進(jìn)行的TMR (TMR-12)。將這些干預(yù)措施與SNI 后3 周進(jìn)行的TMR (TMR-3)進(jìn)行比較。iTMR 防止了痛覺(jué)過(guò)敏和機(jī)械超敏反應(yīng)的發(fā)生。與基線相比，12 周時(shí)iTMR 組的動(dòng)態(tài)機(jī)械超敏反應(yīng)增加，但與TMR-3 無(wú)差異。在1 周和6 周時(shí)，iTMR 的冷超敏反應(yīng)比基線增加，但與TMR-3 相比無(wú)顯著差異。TMR-12 組在所有評(píng)估中均未顯示疼痛行為減少，但動(dòng)態(tài)機(jī)械超敏反應(yīng)在6周時(shí)間點(diǎn)與基線和TMR-3 相似。這些數(shù)據(jù)表明，即刻和早期（損傷后3 周）干預(yù)均可預(yù)防或減輕疼痛行為。相比之下，受傷后12 周的干預(yù)效果微乎其微。此外，在iTMR 和TMR-12 組中，對(duì)側(cè)足部相對(duì)于基線的變化較小。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SNI 后延遲 12 周的神經(jīng)瘤切除對(duì)疼痛行為沒(méi)有影響。

最后，將NE-12 與TMR-12 進(jìn)行比較，以確定神經(jīng)瘤在12 周后持續(xù)疼痛行為中的任何相對(duì)作用。這表明不同干預(yù)措施之間無(wú)顯著差異。Dunnett 檢驗(yàn)進(jìn)行二次分析表明，在針、vonFrey 閾值和丙酮測(cè)試的所有時(shí)間點(diǎn)，兩種治療均未能逆轉(zhuǎn)SNI 誘導(dǎo)的疼痛行為。

四、討論

該研究測(cè)試了TMR 對(duì)嚙齒類動(dòng)物主要神經(jīng)損傷后頑固性疼痛表型的鎮(zhèn)痛效果。研究結(jié)果表明，在傷后即刻或傷后3 周進(jìn)行TMR 可逆轉(zhuǎn)或顯著降低點(diǎn)狀機(jī)械過(guò)敏、痛覺(jué)過(guò)敏和冷過(guò)敏。這些疼痛行為的變化發(fā)生迅速，且影響至少持續(xù)12 周。然而，當(dāng)TMR 延遲至SNI 術(shù)后12 周時(shí)，機(jī)械超敏反應(yīng)和冷超敏反應(yīng)仍較基線升高，反映了TMR 對(duì)慢性截肢病人的效果較差。這些發(fā)現(xiàn)有助于驗(yàn)證該模型是一個(gè)合適的平臺(tái)，可用于對(duì)TMR 導(dǎo)致的傷害性通路變化進(jìn)行機(jī)制探索。此外，該模型將有助于評(píng)估干預(yù)措施的改進(jìn)，從而擴(kuò)大其臨床適用性和療效。

以假手術(shù)和NE 作為TMR 的對(duì)照。首先，考慮到肌肉反應(yīng)的變化，因?yàn)榉蛛x用于縫合的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)會(huì)影響對(duì)刺激的運(yùn)動(dòng)反應(yīng)。第二，切斷結(jié)扎和神經(jīng)瘤可以消除任何壓迫型損傷，因此TMR 組和NE組之間的唯一區(qū)別是切斷的近端神經(jīng)是否直接吻合。與運(yùn)動(dòng)支的吻合提供了直接的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生靶點(diǎn)，并能立即接觸到對(duì)再生至關(guān)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。NE 組切斷的神經(jīng)能再生，但未接觸到神經(jīng)再生的靶點(diǎn)。然而，近端刺激顯示，NE 組的許多神經(jīng)最終找到了遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端，并成功地再支配了遠(yuǎn)端肌肉。在NE-3 組中，神經(jīng)再支配的時(shí)間與痛覺(jué)超敏和機(jī)械超敏的輕度改善相關(guān)。這些結(jié)果表明，在iTMR 和TMR-3 組中，神經(jīng)瘤切除并不是觀察到的疼痛行為快速變化的重要組成部分。

相比之下，NE 組疼痛行為的后期減少突出了神經(jīng)再支配與疼痛行為減少之間的聯(lián)系。神經(jīng)再支配與再生的作用已在神經(jīng)病理性疼痛模型中得到了很好的研究。SNI 后，再生過(guò)程在近端切斷神經(jīng)中繼續(xù)，導(dǎo)致神經(jīng)瘤紊亂和與疼痛行為相關(guān)的自發(fā)傳入纖維活動(dòng)。如果SNI 后通過(guò)用Sema-3A 治療神經(jīng)來(lái)阻斷再生和自發(fā)傳入，則機(jī)械超敏反應(yīng)和異常性疼痛得到改善；而冷超敏反應(yīng)仍不能恢復(fù)正常。同樣，在既有紊亂的神經(jīng)瘤再生又有部分神經(jīng)再支配的結(jié)扎模型中，阻斷再生也會(huì)減少疼痛行為。這些觀察結(jié)果表明，無(wú)神經(jīng)支配的再生在一定程度上驅(qū)動(dòng)了機(jī)械超敏反應(yīng)和超敏痛覺(jué)類型的疼痛行為，而另一個(gè)過(guò)程可能維持冷超敏反應(yīng)。

TMR 會(huì)產(chǎn)生較差的感覺(jué)再生環(huán)境，其次是顯著的大小不匹配和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)不匹配。神經(jīng)大小的不匹配會(huì)影響到運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)纖維束逃逸，而混合的運(yùn)動(dòng)或感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)吻合明顯有利于運(yùn)動(dòng)再生。對(duì)運(yùn)動(dòng)再生和神經(jīng)再生的支持與TMR 的最初目的是一致的，即產(chǎn)生與假體通信的強(qiáng)運(yùn)動(dòng)信號(hào)。事實(shí)上，研究中的活體內(nèi)神經(jīng)刺激證實(shí)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生的發(fā)生。在NE 組中，感覺(jué)-感覺(jué)匹配是可能的，這進(jìn)一步支持了影響TMR 和NE 疼痛行為的不同機(jī)制。在TMR 中，有運(yùn)動(dòng)再生和神經(jīng)再生，但感覺(jué)纖維和神經(jīng)元發(fā)生了什么尚不清楚，這將是研究的關(guān)鍵組成部分。

在TMR-12 組中觀察到無(wú)變化的疼痛行為反映了在截肢后較久才進(jìn)行TMR 的臨床觀察結(jié)果，且神經(jīng)損傷在減輕或預(yù)防截肢相關(guān)疼痛方面效果較差，其機(jī)制可能與神經(jīng)再生減少有關(guān)。Holmes 等的研究發(fā)現(xiàn)，將結(jié)扎12 個(gè)月的坐骨神經(jīng)分支修復(fù)為健康神經(jīng)時(shí)，僅再生35%的運(yùn)動(dòng)單位?？紤]到TMR 的大小不匹配，如果在12 周時(shí)進(jìn)行干預(yù)，可能有一定比例的纖維必須實(shí)現(xiàn)神經(jīng)再生，并且不再達(dá)到閾值。另一個(gè)關(guān)鍵因素是隨著時(shí)間的推移，疼痛逐漸集中，可能會(huì)降低任何外周干預(yù)的療效。在復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征的大鼠模型中，早期外周給予傷害性受體拮抗劑時(shí)，對(duì)疼痛的改善有效，但在后期不再有效。隨著時(shí)間的推移，作為自發(fā)傳入活動(dòng)的關(guān)鍵發(fā)生器的外周神經(jīng)可能向背根神經(jīng)節(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)變。需要開展更多工作來(lái)確定療效喪失背后的機(jī)制。

更驚人的發(fā)現(xiàn)之一是TMR 后疼痛行為減輕的速度。TMR 后1 周內(nèi)，大鼠疼痛行為恢復(fù)至SNI前基線水平。相比之下，NE 組未出現(xiàn)相同的快速反應(yīng)。因此，建立對(duì)合有助于快速反應(yīng)，而不僅僅是切除神經(jīng)瘤。相比之下，慢性疾病完全缺乏這種快速反應(yīng)，且隨著受傷時(shí)間的推移，自發(fā)活動(dòng)和疼痛不再相關(guān)。在慢性壓迫性神經(jīng)損傷后早期阻斷自發(fā)活動(dòng)，可使其余神經(jīng)損傷的自發(fā)活動(dòng)降低至正常水平，并且在阻斷失去作用后仍能保持正常水平。然而，傷后10 天應(yīng)用阻斷劑僅降低了阻斷期間的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持早期干預(yù)的關(guān)鍵性，并與12 周后應(yīng)用TMR 時(shí)療效喪失相關(guān)。

自發(fā)傳入活動(dòng)可由外周損傷和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元敏化引起。早期阻斷神經(jīng)損傷部位的自發(fā)活動(dòng)可防止神經(jīng)元敏化。預(yù)防致敏可能是TMR 早期應(yīng)用的另一個(gè)重要組成部分。一旦神經(jīng)元過(guò)度興奮，TMR 對(duì)其外周軸突的作用可能對(duì)維持自發(fā)活動(dòng)和相關(guān)疼痛無(wú)關(guān)。

該模型的局限性：在將其應(yīng)用于截肢相關(guān)疼痛時(shí)，與截肢相關(guān)的變化（如皮膚變薄和殘端炎癥）也可能導(dǎo)致截肢病人的疼痛，但在模型中沒(méi)有出現(xiàn)；另外，神經(jīng)必須結(jié)扎，這除了造成軸突切斷外，還會(huì)造成壓迫損傷。在手指截肢的情況下，燒灼和牽引神經(jīng)切除術(shù)已經(jīng)足夠，但通常的做法是在截肢前結(jié)扎較大的神經(jīng)，因?yàn)樗鼈兊纳窠?jīng)周圍血管系統(tǒng)會(huì)帶來(lái)血腫風(fēng)險(xiǎn)。

未來(lái)的工作需要研究TMR 在外周和中樞誘導(dǎo)的傷害性過(guò)程變化。使用SNI 和早期TMR 建立的模型顯示了對(duì)疼痛行為發(fā)展的預(yù)防。一個(gè)特別的挑戰(zhàn)是，在臨床和該模型中觀察到，延遲TMR不能逆轉(zhuǎn)疼痛行為，因此該模型可用于確定克服這一局限性的因素，以擴(kuò)大可能從TMR 獲益的臨床人群。