曹雅嵐，李淑坤，黃一平，顧曉娜，張鵬?

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210023； 2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028）

慢性咽炎（chronic pharyngitis，CP）是咽部黏膜、黏膜下組織和淋巴樣組織的慢性炎癥［1-2］，臨床表現(xiàn)為咽喉癢、干、痛，咳嗽，有異物感以及喉部梗阻［3-4］。中國CP患者占耳鼻喉科門診就診患者總數(shù)的1/3。CP的發(fā)生與環(huán)境污染、微生物污染和吸煙等因素相關(guān)［5］，研究表明，空氣污染物的增加與CP 的發(fā)生呈正相關(guān)，特別對于15 歲以下的患者［6］。CP 的病因可分為感染性因素和非感染性因素，病毒、細(xì)菌和真菌是常見的感染因素，其中化膿性鏈球菌A 群鏈球菌（GAS）是兒童和成人細(xì)菌性咽炎最常見的病因［7］；長期飲酒和吸煙是常見的非傳染性因素［8］。

目前，CP 病理機(jī)制尚不清楚，由于反復(fù)發(fā)病和病程長，CP 患者承受了相當(dāng)大的身心負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥治療CP 的方法多種多樣，包括煎、茶、湯、針灸、放血和按摩等［9］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常用抗生素、氣霧劑、扁桃體切除術(shù)等治療方法，但抗生素具有副作用且會增加耐藥性，從而加重感染性咽炎。此外，使用抗生素治療真菌和其他非感染性因素引起的CP是無效的。扁桃體切除術(shù)常用于治療兒童咽炎，但缺乏足夠的循證研究證實(shí)這種治療的有效性［5，8，10］。因此，需要更安全、有效、可靠的治療方法。中醫(yī)藥對CP 具有獨(dú)特的治療優(yōu)勢，利咽方（LYF）由半夏厚樸湯發(fā)展演變而來，主要由桔梗、厚樸、生姜、茯苓、甘草、青果和紫蘇葉等中藥組成，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，對慢性呼吸道疾病癥狀，如干咳、喘息、喉嚨發(fā)炎和聲音嘶啞等有較好治療效果。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)的新興學(xué)科［11］，其利用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)生物學(xué)，選擇特定的信號節(jié)點(diǎn)來定義藥物分子的多個靶點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為病人是一個整體，不治療疾病的癥狀，它采取分析方法，檢查病因機(jī)制以解釋與疾病相關(guān)的變化，并提供適當(dāng)?shù)闹委煟?］。正是由于中醫(yī)和中藥化合物的概念與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相似性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被認(rèn)為是研究中藥有效成分和靶點(diǎn)的重要工具。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索LYF 治療CP的關(guān)鍵靶點(diǎn)、分子過程和信號通路，能為LYF 臨床治療CP提供參考。

1 材料及試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD 大鼠由江蘇省中醫(yī)藥研究院動物中心提供，48 只，SPF 級，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，動物許可證號：SYXK（蘇）2021 - 0025，飼養(yǎng)于溫度18～25 ℃，濕度為40%～60%的潔凈環(huán)境，飲用無菌水，食用常規(guī)飼料，12 h 晝夜交替照明。實(shí)驗(yàn)動物所有操作均符合江蘇省動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)，倫理編號：AEWC -20220323 - 196。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、材料及試劑

利咽方處方藥液采用相應(yīng)中藥提取物按處方比例混勻后水溶的方法配制，中藥提取物為：桔梗提取物C100402 - 01、紫蘇葉提取物C121101 - 01、青果提取物C082202 - 02、甘草提取物C050501 - 05、茯苓提取物C090401 - 05、厚樸提取物C092101 - 02、生姜提取物C050603 - 10（廣東青云山藥業(yè)有限公司，批號：20210301、20210901、20211201Z、20211102、20210901、20220301Z、20220301Z）；無蔗糖型慢嚴(yán)舒檸清喉利咽顆粒（桂龍藥業(yè)安徽有限公司，批號：2110051）；氨水（南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號：20200108）；TNF - α、IL - 1β 和IL - 6ELISA 試劑盒（中國武漢Elabscience 公司，批號：EL - R2856c、EL - R0015c、EL - R0012c）；抗體GAPDH（Proteintech 公司，貨號：10494 - 1 - AP）；TLR4（Proteintech 公司，貨號：66350 - 1 - Ig）；IκBα（CST公司，貨號：4812）；p - IκBα（CST 公司，貨號：2859）；NF - κB（CST 公司，貨號：8242）；p - NF - κB（CST 公司，貨號：3033）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（CST 公司，貨號：7074）；ECL 發(fā)光液（上海碧云天生物科技有限公司，貨號：P0018AS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司，型號：Ⅸ - 73）；電子天平（蘇測電子科技有限公司，型號：BY - 101）；微型垂直電泳槽（上海天能生命科學(xué)有限公司，型號：Tanon VE - 180）；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司，型號：Tanon 5200）。

2 方法

2.1 篩選利咽方中的有效成分及作用靶點(diǎn)

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中收集LYF 中厚樸、紫蘇、茯苓、生姜、桔梗、青果和甘草等藥的所有化學(xué)成分，以口服利用度（OB） ≥ 30%和類藥性（DL） ≥ 0.18 作為條件篩選主要有效成分并收集其靶點(diǎn)，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中將收集的靶點(diǎn)名稱校正為其官方名稱。

2.2 篩選慢性咽炎的靶點(diǎn)

通過GeneCards 人類基因數(shù)據(jù)庫獲得慢性咽炎相關(guān)靶點(diǎn)，篩選相關(guān)性得分（Relevance score） ≥ 0.8 的相關(guān)靶點(diǎn)，作為疾病靶點(diǎn)。

2.3 構(gòu)建和分析利咽方治療慢性咽炎的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

將“2.1”項(xiàng)下獲得的藥物靶點(diǎn)與“2.2”項(xiàng)下獲得的疾病靶點(diǎn)輸入Venny網(wǎng)站獲得交集靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置種類為“homo sapiens”，置信度蛋白參數(shù)評分 ≥ 0.9，隱藏孤立靶點(diǎn)后，下載TSV格式的蛋白互作關(guān)系文件并導(dǎo)入Cytoscape軟件，以構(gòu)建蛋白靶點(diǎn)互作（PPI）關(guān)系網(wǎng)，然后利用軟件中的Cytohabba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得到MCC值排名前10的靶點(diǎn)。

冠心病的發(fā)生還可能與患者的體內(nèi)雌激素水平[7]、體內(nèi)的瘦素水平[8]、胰島素抵抗[9]、精神心理狀態(tài)[10-11]等多種因素有關(guān)。

2.4 對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG富集分析

將上述得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascepa數(shù)據(jù)庫，設(shè)置閾值P＜ 0.01、minimum count = 3、enrichment factor ＞ 1.5等參數(shù)，經(jīng)GO注釋分析分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）和KEGG通路分析后再將結(jié)果在Cytoscape中進(jìn)行可視化。

2.5 慢性咽炎動物模型實(shí)驗(yàn)

2.5.1 分組、造模及給藥

48 只SPF 級SD 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組（Control 組）、模型組（Model組）、利咽方低劑量組（LYF - L 組）、利咽方中劑量組（LYF - M 組）、利咽方高劑量組（LYF - H 組）、陽性藥組（MYSN組），每組8只（雌雄各半）。在旋轉(zhuǎn)象鼻噴霧瓶中裝入新配制的濃度為2.5%的氨水［12］，除空白組外，其余各組大鼠用氨水噴咽，連續(xù)噴20 d，每天噴一次，每次噴2撳；空白組大鼠用無菌水噴咽部。

按照陽性藥說明書，MYSN組給藥0.97 g/kg。根據(jù)LYF 的日劑量，LYF - L 組給藥劑量為2.484 g/kg，LYF - M組給藥劑量為12.42 g/kg，LYL - H組給藥劑量為24.84 g/kg。LYF - L組劑量組藥液制備：精密稱取提取物粉末（厚樸0.15 g、生姜0.625 g、茯苓0.25 g、桔梗0.75 g、甘草0.35 g、青果0.625 g、紫蘇葉0.85 g）共3.6 g，混勻后溶解于25.6 mL純化水中，制得0.14 g提取物/mL的利咽方藥液，用于實(shí)驗(yàn)動物給藥。LYF - H和LYF - M組藥液制備：精密稱取提取物粉末（厚樸0.6 g、生姜2.5 g、茯苓1.0 g、桔梗3.0 g、甘草1.4 g、青果2.5 g、紫蘇葉3.4 g）共14.4 g，混勻后溶解于17.4 mL純化水中，制得0.83 g提取物/mL的利咽方藥液，用于實(shí)驗(yàn)動物給藥。

各給藥組每天灌胃1 次，連續(xù)給藥14 d，模型組每天給予等量無菌水。給藥結(jié)束后，取眼眶靜脈叢血，切除咽黏膜組織。咽部黏膜組織一部分用4%多聚甲醛固定，另外一部分 - 80 ℃冷凍待測。

2.5.2 檢測指標(biāo)

2.5.2.1 ELISA檢測

血液樣品在室溫（25 ℃）靜止2 h 后，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，然后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF - α、IL - 6和IL - 1β水平。

2.5.2.2 HE染色

大鼠的咽部組織浸泡在固定液（4%甲醛水溶液）中24 h，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫水，包蠟，切片，染色，得到大鼠咽部的切片，然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.5.2.3 Western blot檢測

提取咽部組織的蛋白，然后制備10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（GAPDH、TLR4、IκBα、p - IκBα、NF - κB、p - NF - κB），抗體與封閉液配制比例分別為1∶1 000，4 ℃過夜，TBST 洗膜 3 次，每次10 min；次日洗膜后加入二抗（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔，與封閉液配制比例1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜 3 次，每次15 min，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫印跡對目的條帶進(jìn)行圖像采集，采用ImageJ 1.53 軟件對條帶進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2. 軟件對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LYF中的有效成分與作用靶點(diǎn)收集

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中得到有效成分141 個，收集并篩選有效靶點(diǎn)205 個。圖中藍(lán)色圓圈代表藥物成分，橙色方塊代表藥物靶點(diǎn)，藥味 - 成分 - 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中330節(jié)點(diǎn)和1 426條邊。見圖1。

圖1 利咽方藥物 - 靶點(diǎn)

3.2 交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用（PPI）及分析

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫一共收集到符合篩選條件的疾病靶點(diǎn)1 950個，將LYF的潛在靶點(diǎn)和CP相關(guān)靶點(diǎn)基因取交集，共獲得112個重疊靶點(diǎn)，在Venny網(wǎng)站對數(shù)據(jù)進(jìn)行形象化處理，結(jié)果見圖2。將上述112個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 網(wǎng)站獲得交集靶點(diǎn)的PPI 文件并在Cytoscape中將其可視化，以度值大小調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺，獲得交集靶點(diǎn)的PPI圖，見圖3。根據(jù)MCC值大小篩選出排名前10的蛋白，顏色越深表明蛋白越重要，其中以IL - 6、TNF和IL - 1β蛋白的顏色較深，見圖4。

圖2 交集靶點(diǎn)Venny圖

圖3 交集靶點(diǎn)PPI圖

圖4 MCC值排名前10的蛋白圖

3.3 KEGG通路分析和GO富集分析

對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，選取P值排名靠前的10個結(jié)果進(jìn)行展示，見圖5。結(jié)果表明，利咽方的治療途徑的生物過程主要涉及無機(jī)物反應(yīng)、對異種刺激的反應(yīng)及對脂多糖的反應(yīng)等方面；細(xì)胞組分主要涉及膜筏、細(xì)胞器外膜、囊腔等位置；分子功能主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等功能。而KEGG 結(jié)果表示LYF可能通過癌癥、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化及乙型肝炎等相關(guān)通路發(fā)揮作用，見圖6。

圖5 GO分析結(jié)果圖

圖6 KEGG氣泡圖

3.4 血清TNF - α、IL - 1β、IL - 6水平

與Control 組比較，Model 組血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平明顯升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與Model 組比較，各治療組（MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H組）血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），且與LYF的劑量呈負(fù)相關(guān)。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平比較（±s，pg/mL）

表1 各組大鼠血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平比較（±s，pg/mL）

注：與Control組比較，#P ＜ 0.05；與Model組比較，*P ＜ 0.05。

IL - 1β 101.54 ± 8.18 186.51 ± 5.37#117.63 ± 5.63*162.99 ± 4.24*144.10 ± 6.49*113.75 ± 7.89*組別Control組Model組MYSN組LYF - L組LYF - M組LYF - H組n6 6 6 6 6 6 TNF - α 61.09 ± 4.33 145.18 ± 5.63#72.09 ± 6.39*129.33 ± 7.06*99.02 ± 6.33*73.20 ± 4.88*IL - 6 73.86 ± 4.26 145.44 ± 6.33#93.29 ± 6.79*131.56 ± 3.02*101.36 ± 6.24*86.11 ± 5.00*

3.5 組織病理學(xué)結(jié)果

Control 組上皮未見壞死和脫落，固有層含有大量緊密結(jié)締組織，炎癥細(xì)胞浸潤極少；Model 組黏膜下層結(jié)締組織疏松，含有各種結(jié)構(gòu)異常、增生的混合腺體，這些腺體突破固有層，破壞喉咽黏膜，炎癥細(xì)胞的根尖浸潤明顯，符合CP 的病理特征。各治療組切片顯示黏膜上皮角質(zhì)化、部分壞死和脫落，發(fā)生層增生細(xì)胞數(shù)量較多，炎性細(xì)胞持續(xù)浸潤，與Model 組比較，咽黏膜恢復(fù)增強(qiáng)，炎癥減輕。見圖7。

圖7 大鼠咽部組織HE切片圖（ × 200）

3.6 Western blot 檢測組織蛋白TLR4、pI - κBα、I -κBα、NF - κB的表達(dá)

與Model 組比較，MYSN 組和LYF - H 組TLR4 蛋白表達(dá)降低，MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H 組I -κBα 蛋白表達(dá)下降，pI - κBα 蛋白MYSN、LYF - H 和LYF - M 組表達(dá)下降，且MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H 組中磷酸化NF - κBp65 蛋白與p65 蛋白的比值與模型組相比也下降。具體結(jié)果見表2和圖8。

表2 各組大鼠咽部組織中蛋白TLR4、pI - κB α、I - κB α、NF - κB的表達(dá)（±s）

表2 各組大鼠咽部組織中蛋白TLR4、pI - κB α、I - κB α、NF - κB的表達(dá)（±s）

注：與Control組比較，#P ＜ 0.05；與Model組比較，*P ＜ 0.05。

NF - κB 0.62 ± 0.02 1.31 ± 0.09#0.77 ± 0.07*1.13 ± 0.04*0.93 ± 0.06*0.90 ± 0.01*組別Control組Model組MYSN組LYF - L組LYF - M組LYF - H組TLR4 0.22 ± 0.04 0.69 ± 0.03#0.34 ± 0.07*0.62 ± 0.09 0.52 ± 0.08 0.44 ± 0.06*I - κBα 0.88 ± 0.02 0.26 ± 0.08#0.70 ± 0.05*0.46 ± 0.03*0.53 ± 0.02*0.67 ± 0.02*pI - κBα 0.13 ± 0.01 0.72 ± 0.18#0.27 ± 0.06*0.56 ± 0.10 0.45 ± 0.09*0.29 ± 0.08*

4 討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，從LYF中鑒定出205個活性化合物，這些成分已被證明在免疫和炎癥中具有調(diào)節(jié)作用。例如，厚樸中的酚類化合物可以抑制NF - κB通路中I - κBα 和p65的磷酸化，從而抑制炎癥反應(yīng)［13-15］。青果可抑制炎癥細(xì)胞因子IL - 1β 和TNF - α 的表達(dá)［16-17］。此外，LYF 中其他化學(xué)成分，如紫蘇中的揮發(fā)油成分［18-20］，姜中的姜辣素［21-23］和桔梗中的桔梗皂苷D［24-25］可以調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫以及腸道免疫反應(yīng)，具有增強(qiáng)免疫力的作用；茯苓中的三萜和多糖［26-28］以及甘草中的甘草酸［29-32］不僅可以增強(qiáng)免疫力，還可以通過抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和產(chǎn)生起到抗炎作用。通過對交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治龅玫搅溯^為重要的靶點(diǎn)為IL - 6、TNF、IL - β，而動物實(shí)驗(yàn)證明了LYF能夠降低大鼠血清中TNF - α、IL - 6、IL - 1β 水平，且與LYF劑量呈正相關(guān)。綜上所述，LYF治療慢性咽炎可能通過調(diào)節(jié)TNF、IL - 6、IL - 1β等因子發(fā)揮抗炎作用。

KEGG 通路分析結(jié)果顯示，LYF 治療CP 的作用機(jī)制可能與抑制NF - κB 通路有關(guān)。核因子 - κB（NF -κB）轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)節(jié)免疫發(fā)育、免疫反應(yīng)、炎癥和癌癥中發(fā)揮著重要作用［33］。NF - κB 家族［34］包括NF -κB1 p50、NF - κB2 p52、RELA（也稱為p65）、RELB 和c - REL，它們通過典型和非典型NF - κB 信號通路發(fā)生。前者主要由NF - κB1 p50、RELA和c - REL介導(dǎo)，后者主要激活p100 隔離的NF - κB 成員，主要是NF -κB2 p52 和RELB（也稱為非典型NF - κB 家族成員）。在靜息狀態(tài)下［35］，NF - κB 與κB 抑制劑（I - κB）結(jié)合，如主要受I - κBα 調(diào)控的典型p50/p65 異源二聚體，一旦受到刺激，I - κB 被磷酸化降解，釋放的NF - κB 進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)基因表達(dá)，最終導(dǎo)致炎癥。動物實(shí)驗(yàn)用Western blot 測定大鼠咽部組織中蛋白TLR4、I - κBα、NF - κBp65的表達(dá)，結(jié)果顯示，LYF治療后的大鼠咽部組織中磷酸化I - κBα蛋白水平低于模型組，且呈劑量依賴性，p65/p65 蛋白比例低于模型組，說明LYF 能夠抑制p65蛋白的磷酸化，從而抑制炎癥的發(fā)生。

此外，筆者發(fā)現(xiàn)高劑量LYF 組可以抑制Toll 樣受體4（TLR4）蛋白的表達(dá)。TLR4 屬于模式識別受體（PRR）家族，是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分［36］。當(dāng)受到細(xì)菌脂多糖以及病理?xiàng)l件下產(chǎn)生的其他病原體衍生成分或內(nèi)源性分子的刺激時，TLR4可觸發(fā)兩種主要的信號級聯(lián)反應(yīng)；其中包括髓樣分化因子88（MyD88）依賴級聯(lián)，以及Toll/白細(xì)胞介素1 受體域誘導(dǎo)的干擾素β（TRIF）依賴級聯(lián)［37］。MyD88依賴通路始于細(xì)胞質(zhì)TIR結(jié)構(gòu)域，MyD88激活觸發(fā)IL - 1受體相關(guān)激酶（IRAK），即IRAK1 和IRAK4 的自磷酸化，并進(jìn)一步與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）相互作用［38］。IRAK 和TRAF6 的激活最終導(dǎo)致I - κBα 的磷酸化和降解［39-40］。在本研究中LYF - H 組大鼠咽部組織中TLR4 的表達(dá)下降，說明此劑量下的LYF 能夠抑制TLR4 蛋白的表達(dá)。因此，LYF 治療CP 的效果還可能與抑制TLR4啟動的免疫反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，揭示了LYF 通過的多組分、多靶點(diǎn)、多途徑治療CP 的潛在機(jī)制。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LYF 可以降低血清中TNF -α、IL - 6、IL - 1β 水平，抑制咽部組織中TLR4 表達(dá)和NF - κB活化。LYF對CP的治療作用可能是通過抑制TLR4/NF - κB 通路和下調(diào)炎性細(xì)胞因子水平，從而抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，本研究成果可為今后LYF 的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。