張世豪，那葉馨，東嬌嬌，胡建華，薛金浩，高詩雯，楊柳

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）為莧科植物牛膝（AchyranthesbidentataBl.）的干燥根，味苦、甘、酸，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有填精補(bǔ)髓、益陰活血的功效，是傳統(tǒng)滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)健筋骨的中藥。臨床主要用于治療腰膝骨痛、四肢拘攣、筋骨無力以及痿痹等癥［1-2］。研究表明，牛膝具有多種藥理作用，包括免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗生育、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松和對心血管和神經(jīng)系統(tǒng)作用等［3-7］。

炮制可以改變藥性，提升療效，降低毒性。根據(jù)古籍記載，牛膝生用可散瘀血、消腫痛、引血下行，鹽炙后能引藥入腎，增強(qiáng)其補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用。牛膝經(jīng)不同炮制工藝炮制后，化學(xué)成分發(fā)生較大的變化，導(dǎo)致藥理作用改變?，F(xiàn)代牛膝常用的炮制方法為鹽炙、酒炙、炒炭等，如炮制后酒牛膝可增強(qiáng)活血通絡(luò)作用；鹽牛膝能引藥下行入腎，發(fā)揮補(bǔ)腎養(yǎng)精作用；牛膝炭主要發(fā)揮止血之功。2020 版《中華人民共和國藥典》中對于鹽炙藥材的描述均是加入定量食鹽（藥材100 g，鹽2 g），文火加熱，炒干。但牛膝鹽炙工藝的參數(shù)還不完善，加鹽量沒有針對性，炒制溫度和時間也不統(tǒng)一，使鹽炙品的內(nèi)在質(zhì)量難以得到有效控制，影響其臨床用藥的準(zhǔn)確性，很難將藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果和其物質(zhì)含量差異進(jìn)行聯(lián)系，也不能為解讀藥效學(xué)差異提供幫助。

道地藥材質(zhì)量與炮制方法密切相關(guān)，牛膝作為我國臨床常用的大宗藥材之一，建立統(tǒng)一的、質(zhì)量可控的、數(shù)字化炮制標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。因此，以課題組前期確定的牛膝補(bǔ)腎壯骨的有效成分——β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷R0及竹節(jié)參皂苷Ⅳa為評價指標(biāo)［8-9］，選取加鹽量、炒制溫度和炒制時間為考察因素，用單因素和Box-Behnken 設(shè)計方法優(yōu)化牛膝的鹽炙工藝。以期能夠得到最佳的炮制工藝，保證牛膝的臨床療效，并為牛膝的規(guī)范化鹽炙提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品：β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳa（批號：5289-74-7、34367-04-9、51415-02-2，天津西瑪科技有限公司）；甘草素（IS）（批號：578-86-9，中國成都亞德生物科技有限公司）；25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮（由本實(shí)驗(yàn)室從牛膝中分離純化，并經(jīng)NMR 和MS 譜等數(shù)據(jù)鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)準(zhǔn)品純度均 ≥ 98%）；牛膝藥材（河南省，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定）。

超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析儀（美國Thermo 公司）；超聲波清洗器（KQ-5000DB，昆山市超聲儀器有限公司）；送風(fēng)定溫干燥箱（WFO-410W，上海愛朗儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYEL4 OSB-2100，東京愛朗儀器有限公司）；高速粉碎機(jī)（800AD，永康市艾澤拉電器有限公司）；分析天平（NewClassicMF，Mettler Toledo Switzertand 公司）；電熱恒溫水浴鍋（HSS，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。乙腈（Thermo Fisher Scientific）、乙酸（Dikma）均為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40 ℃。流動相：乙腈（A%）和0.3%乙酸水（V/V，B%）。梯度洗脫條件見表1，總離子流圖見圖1。

表1 梯度洗脫條件

圖1 總離子流圖

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

配備有電噴霧離子源的三重四級桿質(zhì)譜儀，在SRM 模式下進(jìn)行負(fù)離子掃描。噴射電壓：-3 000 V；鞘氣：30 Arb；輔助氣：10 Arb；離子傳輸管溫度：325 ℃；蒸發(fā)器溫度：350 ℃；輔助器：2 L/min；全程通入氮?dú)狻? 種有效成分及內(nèi)標(biāo)化合物的檢測離子對及其質(zhì)譜參數(shù)見表2；5 種有效成分的代表質(zhì)譜圖見圖2。

表2 5種有效成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件

圖2 有效成分的代表質(zhì)譜圖

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取5種有效成分適量，配置成混合對照品溶液。各成分的濃度分別為：β-蛻皮甾酮0.989 0 mg/mL、25R-牛膝甾酮0.981 0 mg/mL、25S-牛膝甾酮1.102 0 mg/mL、人參皂苷R00.997 0 mg/mL 以及竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.976 0 mg/mL。

2.1.4 供試品溶液的制備牛膝樣品均粉碎并篩分（60目）。取0.5 g樣品于燒瓶中，浸泡于50 mL 50%的甲醇溶劑中，然后在40 ℃水浴中超聲60 min，得供試品溶液，4 ℃保存待測。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（x），以對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999 3，這表明5 種有效成分均在其線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。5 種有效成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍結(jié)果見表3。

表3 5種有效成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.1.6 系統(tǒng)適應(yīng)性

精密度測試，精密吸取上述供試品溶液適量，24 h內(nèi)連續(xù)測6 次，連續(xù)測定3 d，計算相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果表明各有效成分的精密度RSD ＜ 1.32%，表明該方法精密度良好。

重復(fù)性測試，精密稱取同一批樣品，記錄5 種有效成分的色譜峰面積，并計算峰面積的RSD 值，考察方法的重現(xiàn)性。結(jié)果表明各有效成分的重復(fù)性RSD ＜2.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性測試，取同一批次的供試品溶液適量，分別于0、4、8、16、32、48 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，考察供試品溶液在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明各有效成分的穩(wěn)定性RSD ＜ 2.56%，表明該樣品48 h內(nèi)在4 ℃下穩(wěn)定。

利用加樣回收率試驗(yàn)對該方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行評價，樣品中加入了已知的低、中、高3 個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度測定3 份。日內(nèi)、日間精度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性的結(jié)果見表4。該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表4 5種有效成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

回收率（%）=（測定平均值-樣品值）/加入量×100%

2.2 鹽炙工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 炒制時間的單因素考察

牛膝原藥材切制成7～8 mm 小段，精密稱取6 份，每份100 g，放于保鮮盒中，加入2 g 食鹽配成的鹽水燜潤，炒制溫度為100 ℃，炒制時間分別為10、15、20、25、30 min，牛膝炒后粉碎過篩（60 目），樣品在甲醇濃度50%（V/V），料液比是1∶8（g/mL），提取時間為60 min，提取次數(shù)2 次的條件下分別進(jìn)樣分析。在炒制溫度和加鹽量一定的條件下，隨著炒制時間的延長，5 種有效成分的總含量先升高后下降，過長的加熱時間會導(dǎo)致有效成分遭到破壞致使有效成分的含量降低。當(dāng)炒制時間為20 min時，有效成分的含量最高，因此確定最佳炒制時間為20 min。見圖3。

圖3 不同因素對鹽炙效果的影響

2.2.2 炒制溫度的單因素考察

2 g 食鹽配成的鹽水燜潤，炒制時間為20 min，炒制溫度分別為80、90、100、110、120 ℃，牛膝炒后粉碎過篩（60 目），樣品在甲醇濃度50%（V/V），料液比為1∶8（g/mL），提取時間60 min，提取次數(shù)2 次的條件下分別進(jìn)樣分析。其中炒制溫度為100 ℃結(jié)果最佳。炒制時間和加鹽量一定的條件下，隨著炒制溫度的升高，5 種有效成分的總含量先升高后下降，過高的溫度會導(dǎo)致有效成分遭到破壞致使有效成分的含量降低。當(dāng)炒制溫度為100 ℃時，有效成分含量最高，因此確定最佳炒制溫度為100 ℃。見圖3。

2.2.3 加鹽量的單因素考察

加入1%、2%、3%、4%、5%的10 mL 鹽水燜潤，炒制時間為20 min，炒制溫度100 ℃，甲醇濃度50%（V/V），料液比為1∶8（g/mL），提取時間60 min，提取次數(shù)2 次。在炒制時間和炒制溫度一定的條件下，隨著加鹽量的升高，5 種有效成分的總含量先升高后下降，加鹽量為2%時，有效成分的含量最高，因此確定最佳加鹽量為2%。見圖3。

2.3 鹽炙工藝的響應(yīng)面法

2.3.1 回歸方程的建立及結(jié)果

采用基于Box-Behnken設(shè)計法優(yōu)化牛膝鹽炙工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，鹽炙考察因素設(shè)定為炒制溫度，炒制時間，加鹽量。根據(jù)響應(yīng)面法設(shè)計，每個因素設(shè)3水平，分別以-1.00，0.00，1.00進(jìn)行編碼。代碼值所代表的實(shí)際操作物理量見表5，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素與水平

表6 鹽炙工藝BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計

2.3.2 牛膝最佳鹽炙工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.3.2.1 β-蛻皮甾酮

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到β-蛻皮甾酮含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 59.73 +7.74A - 3.21B + 0.54C - 1.26AB + 0.94AC - 0.12BC -19.49A2- 8.31B2- 0.38C2。方差分析結(jié)果見表7，模型決定系數(shù)R2= 0.957 6，表明該模型對實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是17.57和0.000 5，表明β-蛻皮甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AB 值最大，說明加鹽量和炒制溫度對β-蛻皮甾酮含量影響較大。

表7 β-蛻皮甾酮方差分析

2.3.2.2 25R-牛膝甾酮

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到25R-牛膝甾酮含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 2.09 +0.2A - 0.16B + 0.001 6C + 0.17AB - 0.038AC -0.006 3BC - 0.31A2- 0.12B2+ 0.096C2。方差分析結(jié)果見表8，模型決定系數(shù)R2= 0.916 8，表明該模型對實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差小；表中F值和P值分別是8.57和0.004 9，表明25R-牛膝甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AB值最大，說明加鹽量和炒制溫度對25R-牛膝甾酮含量影響較大。

2.3.2.3 25S-牛膝甾酮

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到25S-牛膝甾酮含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 3.06 +0.36A - 0.16B + 0.059C + 0.091AB - 0.16AC -0.33BC - 0.49A2- 0.74B2- 0.29C2。方差分析結(jié)果見表9，模型決定系數(shù)R2= 0.944 9，表明該模型對實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是13.34 和0.001 3，表明25S-牛膝甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，BC 值最大，說明炒制溫度和炒制時間對25S-牛膝甾酮含量影響較大。

表9 25S-牛膝甾酮方差分析

2.3.2.4 人參皂苷R0

采用Design-Expert軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到人參皂苷R0含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 6.55 + 0.21A +0.2B + 0.043C - 0.013AB + 0.23AC + 0.009 5BC -2.08A2- 1.62B2- 1.42C2。方差分析結(jié)果見表10，模型決定系數(shù)R2= 0.978 2，表明該模型對實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差?。槐碇蠪值和P值分別是34.82 和＜ 0.000 1，表明人參皂苷R0擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AC 值最大，說明加鹽量和炒制時間對人參皂苷R0含量影響較大。

表10 人參皂苷R0方差分析

2.3.2.5 竹節(jié)參皂苷Ⅳa

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到竹節(jié)參皂苷Ⅳa 含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 12.66 +1.02A - 0.59B + 0.035C - 0.56AB - 0.11AC + 0.29BC -2.92A2- 1.62B2- 0.19C2。方差分析結(jié)果見表11，模型決定系數(shù)R2= 0.970 4，表明該模型對實(shí)際值的模擬效果良好，試驗(yàn)誤差??；表中F值和P值分別是25.46和0.000 2，表明竹節(jié)參皂苷Ⅳa擬合模型顯著。其中，在交互項(xiàng)中，AB 值最大，說明加鹽量和炒制溫度對竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量影響較大。

表11 竹節(jié)參皂苷Ⅳa方差分析

2.3.3 響應(yīng)面分析因素間的相互作用

加鹽量和炒制時間的交互作用與五種有效成分含量的關(guān)系的三維曲面圖見圖4。隨著加鹽量和鹽炙時間逐漸增大，5 種有效成分的含量也逐漸增大；當(dāng)增大到一定水平時，5 種有效成分的含量卻逐漸下降，說明加鹽量和炒制時間兩因素的交互作用明顯。當(dāng)加鹽量較大時，5 種有效成分含量隨著炒制溫度的增大逐漸減小，見圖5。當(dāng)炒制時間一定時，5 種有效成分含量隨著炒制溫度的增大逐漸減小，見圖6。綜上所述，鹽炙因素對有效成分的含量的影響由大到小依次為：加鹽量 ＞ 炒制溫度 ＞ 炒制時間。

圖5 加鹽量和炒制溫度對有效活性成分的含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

圖6 炒制時間和炒制溫度對有效活性成分的含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

2.4 鹽炙工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)合Design-Expert，綜合分析與實(shí)驗(yàn)可操作性等有關(guān)的各因素，分析認(rèn)為最佳鹽炙工藝為2%加鹽量，炒制溫度100 ℃，炒制時間20 min。采用上述最優(yōu)鹽炙工藝進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測得的主要成分的總含量較高，結(jié)果見表12。說明鹽炙工藝的穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

表12 鹽灸工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果/（mg/g）

3 討論

牛膝始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行之功效，用于腰膝酸痛、筋骨無力、經(jīng)閉癥瘕、肝陽眩暈等。牛膝中含有皂苷類、甾酮類、多糖類、甜菜堿和多種微量元素等，其中以齊墩果酸型三萜皂苷、蛻皮甾酮和多糖類為其主要活性成分［10］。鹽炙理論雖論述頗多，但仍以“入鹽走腎”的理論為核心，臨床上凡是歸腎經(jīng)的藥物多進(jìn)行鹽炙［11］。歷代中藥鹽炙方法有14 種，分別為鹽水制、鹽水潤、鹽水炙、鹽水浸炒、鹽水淹、鹽水炒、鹽水煮、鹽水浸、鹽水拌、鹽水曝干、鹽水煮、鹽水拌炒、鹽水蒸、鹽水拌蒸［12］?，F(xiàn)代炮制方法主要以鹽炙、鹽蒸等為主［13］。牛膝經(jīng)鹽炙后能夠增強(qiáng)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效［14］，而藥理研究證實(shí)牛膝中甾酮類物質(zhì)（主要包括β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮等）有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用［15］，牛膝中皂苷類物質(zhì)（主要包括竹節(jié)參皂苷Ⅳa、人參皂苷R0等）有抑制破骨細(xì)胞以及保護(hù)損傷軟骨細(xì)胞的作用［16-17］，這與鹽牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之效相吻合。因此本實(shí)驗(yàn)以課題組前期確定的牛膝補(bǔ)腎壯骨的5 種有效成分——β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮，人參皂苷R0及竹節(jié)參皂苷Ⅳa 為評價指標(biāo)進(jìn)行鹽炙工藝研究。

在炮制工藝設(shè)計方面，相關(guān)的研究多是采用正交實(shí)驗(yàn)法和Box-Behnken響應(yīng)面法［18-22］。正交實(shí)驗(yàn)同時考慮幾種相關(guān)因素，尋找最佳因素水平組合，但是不能給出整個區(qū)域因素和響應(yīng)值之間的一個明確函數(shù)表達(dá)式，從而無法找到最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。而Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)采用多元二次方程來擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題［22］。因此，本研究采用Box-Behnken 響應(yīng)面法對牛膝的鹽炙工藝進(jìn)行設(shè)計。

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷R0及竹節(jié)參皂苷Ⅳa 為評價指標(biāo)，采用單因素及Box-Behnken 設(shè)計方法，優(yōu)化牛膝的鹽炙工藝。最終確定牛膝的最佳鹽炙工藝為2%加鹽量，炒制溫度100 ℃，炒制時間20 min。本文建立的牛膝鹽炙工藝穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價值，有利于提高牛膝鹽炙品的質(zhì)量均一性，保證臨床用藥的有效性，為中藥飲片的標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化提供依據(jù)。