郭正晨,段 華

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院婦科微創(chuàng)中心,北京 100006)

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類在反向剪接過程中形成的具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA,區(qū)別于線性RNA,因其具有穩(wěn)定性、特異性、進(jìn)化保守性以及多種分子功能已成為研究熱點。隨著高通量測序技術(shù)和相關(guān)實驗技術(shù)的不斷發(fā)展,大量研究已證實circRNA在眾多病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,同時其在子宮內(nèi)膜良性病變發(fā)生發(fā)展中的關(guān)聯(lián)已得到初步探究。

1 CircRNA的分類與特征

CircRNA由非經(jīng)典剪接方式——反向剪接線性mRNA前體產(chǎn)生,形成連續(xù)的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)染色體位置來源和組成不同,circRNA主要分為三種類型,最常見的是外顯子環(huán)狀RNA(exonic circular RNA,ecircRNA),由外顯子組成,其他還包括內(nèi)含子環(huán)狀RNA(intronic circular RNA,ciRNA)(由內(nèi)含子組成)和外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA(exonic-intronic circRNA,eIciRNA)(由外顯子和內(nèi)含子共同組成)[1]。根據(jù)最新研究,circRNA具有以下顯著特征:(1)多樣性:不同基因能編碼不同的circRNA,而由于可變剪接,同一基因還能編碼具有不同外顯子和內(nèi)含子組合的circRNA,其中多數(shù)circRNA來源于外顯子,為ecircRNA,且多位于細(xì)胞質(zhì)[2];(2)豐度:由于反向拼接的效率遠(yuǎn)低于經(jīng)典拼接方式,導(dǎo)致細(xì)胞和組織中circRNA的豐度普遍較低,但在某些特定部位,如神經(jīng)系統(tǒng)中大量聚集,甚至遠(yuǎn)高于其同源線性mRNA[3-7];(3)穩(wěn)定性和保守性;(4)表達(dá)時間和組織特異性[8]。以上circRNA特征提示了其潛在的生物學(xué)功能。目前已知circRNA可直接或間接通過與RNA和蛋白質(zhì)的相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而影響細(xì)胞的各種生物學(xué)功能。

2 CircRNA的功能

CircRNA作為細(xì)胞活性調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用,主要通過以下四個方面。

2.1 miRNA海綿 miRNA在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中具有廣泛作用,包括細(xì)胞增殖、代謝、遷移、分化和凋亡[9]。作為miRNA的上游分子,circRNA因含有miRNA應(yīng)答元件,能結(jié)合各種miRNA并通過“miRNA分子海綿”機(jī)制抑制其活性[10-11]。如小腦變性相關(guān)蛋白1(cerebellar degeneration-related protein 1,CDR1)的反義轉(zhuǎn)錄本,又稱為CIRS-7,是研究者發(fā)現(xiàn)的首個具有miRNA海綿功能的circRNA,能負(fù)性調(diào)節(jié)miR-7[11]。最新研究證實,CIRS-7/miR-7在多種良惡性疾病中發(fā)揮促增殖轉(zhuǎn)移作用,如骨關(guān)節(jié)炎、胃癌、非小細(xì)胞肺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等[12-15]。此外,隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,目前已發(fā)現(xiàn)circPTN、circZNF532、circORC5、circWHSC1、circRNF20等多種circRNA的分子海綿作用。

2.2 與蛋白質(zhì)相互作用 RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)是一類參與RNA代謝調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì),如RNA的形成、運(yùn)輸、定位和翻譯[16]。CircRNA與RBP的結(jié)合具有雙向效應(yīng),既調(diào)節(jié)circRNA代謝,又影響RBP功能。Errichelli等[17]在體外小鼠運(yùn)動神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)FUS蛋白能通過結(jié)合反向拼接連接處側(cè)翼的內(nèi)含子調(diào)節(jié)多種circRNA的生物合成。CircRNA與RBP的結(jié)合還能影響RBP的功能。circ-Amotl1能與致癌轉(zhuǎn)錄因子c-Myc相互作用,促進(jìn)c-Myc在細(xì)胞核中的穩(wěn)定性并上調(diào)c-Myc靶點[18],還與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)相互作用以同樣的方式調(diào)節(jié)STAT3的生物功能[19]。circACTN4在肝內(nèi)膽管癌中高表達(dá),并且能與Y盒結(jié)合蛋白1(Y-Box binding protein 1,YBX1)相互作用,將YBX1募集到卷曲受體7(frizzled-7,FZD7)基因的啟動子區(qū)域,促進(jìn)作為Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的FZD7表達(dá),增強(qiáng)了腫瘤的增殖和侵襲能力[20]?？偟膩碚f,某一種circRNA能與不同的蛋白質(zhì)相互作用,而某一種RBP也可與不同的circRNA動態(tài)結(jié)合。但是鑒于分析RBP中circRNA的結(jié)合序列具有挑戰(zhàn)性,對circRNA與RBP相互作用的研究仍有限。

2.3 調(diào)節(jié)基因表達(dá) CircRNA能通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)。首先,circRNA能影響親本基因的轉(zhuǎn)錄。在U1核小RNA的幫助下,細(xì)胞核內(nèi)的外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA EIciPAIP2和EIciEIF3J能通過RNA-RNA相互作用影響RNA聚合酶Ⅱ的活性,調(diào)節(jié)其親本基因的轉(zhuǎn)錄[21]。其次,circRNA還可從翻譯水平影響基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),circVAMP3在應(yīng)激條件下可抑制原癌基因c-MYC的翻譯從而降低c-Myc蛋白的表達(dá)水平[22]。Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein,Yap)是Hippo通路的關(guān)鍵組成部分,抑制Yap活性可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制增殖和轉(zhuǎn)移。circYap能與翻譯相關(guān)蛋白PABP、eIF4G結(jié)合,阻止其對Yap mRNA的翻譯起始作用,使Yap蛋白表達(dá)水平下降從而抑制腫瘤生長[23]。再次,circRNA還可能通過改變DNA修飾影響基因表達(dá)。弗氏白血病病毒整合蛋白1(friend leukemia virus integration 1,FLI1)是紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化特異性轉(zhuǎn)錄因子家族成員,在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中起致癌驅(qū)動作用,并促進(jìn)實體瘤生長。在乳腺癌中,circRNA FECR1可降低甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)并將去甲基化酶TET1募集至FLI1的啟動子處,導(dǎo)致FLI1基因啟動子區(qū)的去甲基化,提高了FLI1表達(dá)水平,促進(jìn)腫瘤生長[24]。綜上,circRNA可以不同的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá),但尚未發(fā)現(xiàn)circRNA對DNA復(fù)制的影響。

2.4 作為翻譯模板編碼蛋白 早期研究認(rèn)為,circRNA因缺乏5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端多聚A尾結(jié)構(gòu)而無法進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯,屬于非編碼RNA。但是,近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn),circRNA序列中因含有某些特殊序列而具有直接翻譯潛能,包括含有編碼蛋白質(zhì)潛能的開放閱讀框序列(open reading frame,ORF),該序列能引導(dǎo)核糖體進(jìn)入RNA的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(internal ribosomal entry sites,IRES),還可觸發(fā)不依賴帽子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄過程的m6A修飾的核苷酸序列[25]。多項研究已證實了circRNA的翻譯活性。如circPPP1R12A來源于蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞單位12A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A,PPP1R12A)的前體mRNA。研究發(fā)現(xiàn),circPPP1R12A序列中包含ORF,可編碼一種新的多肽,命名為circPPR12A-73aa,這種多肽可激活Hippo-YAP信號通路,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[26]。另有發(fā)現(xiàn)circ_022705由F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含7(F-box and WD repeat domain containing 7,FBXW7)基因的外顯子產(chǎn)生,稱為circFBXW7。circFBXW7在三陰性乳腺癌組織中下調(diào),并由IRES介導(dǎo)翻譯編碼FBXW7-185aa,該蛋白可通過增加FBXW7的豐度和誘導(dǎo)c-Myc降解來抑制三陰性乳腺癌癥進(jìn)展[27]。

目前已知大多數(shù)circRNA發(fā)揮分子海綿作用,通過miRNA調(diào)節(jié)蛋白水平,少部分circRNA起到與RBP結(jié)合、調(diào)節(jié)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)翻譯作用,且相關(guān)研究仍正在不斷增加。多數(shù)circRNA發(fā)揮單一功能,也存在circRNA同時進(jìn)行多種功能影響細(xì)胞活性。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn),circSEMA4B既可編碼一種新的蛋白質(zhì)SEMA4B-11aa,抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,又可發(fā)揮海綿作用,通過miR-330-3p/程序性細(xì)胞死亡因子4通路抑制Akt的磷酸化,負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt信號通路,抑制乳腺癌組織生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)circRNA存在表觀修飾。研究者在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)m6A修飾的circCCDC134穩(wěn)定性增加,作為miR-503-5p海綿,刺激低氧誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)宮頸癌生長和轉(zhuǎn)移[29]。CircRNA功能及其調(diào)節(jié)仍有待研究,明確其在疾病中的作用至關(guān)重要。

3 CircRNA與子宮內(nèi)膜異位癥

3.1 促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞的增殖侵襲能力 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)過程已在子宮內(nèi)膜異位癥中得到廣泛研究,被證實能促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和遷移[30]。Circ_0004712在子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶中高表達(dá),并作為miRNA海綿大幅下調(diào)miR-488-3p水平,上調(diào)Rho相關(guān)卷曲螺旋包含蛋白激酶1(rho associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1)的活性,激活RhoA/ROCK1/2通路,增強(qiáng)雌激素/雌激素受體α/ERK信號通路介導(dǎo)的EMT過程,最終促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位上皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[31]。circZFPM2可通過miR-205-5p/鋅指E盒結(jié)合同源盒1信號通路誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖、遷移和侵襲級聯(lián)反應(yīng)[32]。以上研究表明,circRNA對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞活性的調(diào)控主要通過發(fā)揮海綿作用調(diào)節(jié)EMT過程。

3.2 作為子宮內(nèi)膜異位癥的診斷標(biāo)志物 迄今為止,子宮內(nèi)膜異位癥研究眾多,但仍無有效的診斷標(biāo)志物或治療方法。有研究通過對來自子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜和正?；颊叩淖訉m內(nèi)膜進(jìn)行circRNA測序研究篩選出了circ_0004712和circ_0002198[33]。兩種circRNA在疾病組表達(dá)升高,并且通過計算受試者工作特征曲線下面積得出circ_0004712診斷子宮內(nèi)膜異位癥的靈敏度為0.704,circ_0002198診斷靈敏度為0.846,初步證實了其作為新型標(biāo)志物的診斷潛能。

3.3 參與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)不孕 不孕是子宮內(nèi)膜異位癥最主要的臨床表現(xiàn)之一,其機(jī)制尚不明確。已有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡發(fā)育異常,而卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞的發(fā)育中起著不可或缺的作用,卵丘細(xì)胞圍繞著卵母細(xì)胞,并通過縫隙連接和旁分泌因子與卵母細(xì)胞建立雙向功能相互作用。Wu等[34]通過提取子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕患者卵丘細(xì)胞的RNA進(jìn)行circRNA測序研究,發(fā)現(xiàn)與對照組卵丘細(xì)胞相比,96種circRNA差異表達(dá)并且其功能與細(xì)胞生長和分化密切相關(guān),涉及Rap1信號通路、MAPK信號通路和Hippo信號通路。

CircRNA在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究仍集中于表達(dá)以及miRNA海綿以發(fā)揮調(diào)控作用,并初步在內(nèi)膜細(xì)胞活性、診斷性標(biāo)記物以及不孕等方面得到探索。而是否存在circRNA其他功能以及對子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)雌激素異常、疼痛以及月經(jīng)改變的影響需進(jìn)一步研究。

4 CircRNA與子宮腺肌病

子宮腺肌病是一種常見的良性和難治性婦科疾病,其特征是痛經(jīng)、月經(jīng)過多和生育能力低下。盡管受到高度關(guān)注,仍缺乏對其發(fā)病機(jī)制的充分了解。目前子宮腺肌病相關(guān)circRNA研究極少。研究發(fā)現(xiàn),circPVT1的高表達(dá)與子宮腺肌病患者的痛經(jīng)、月經(jīng)過多和子宮增大的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。細(xì)胞實驗證實circPVT1的敲除抑制了子宮腺肌病在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲[35]。研究發(fā)現(xiàn),子宮腺肌病患者中circ_0061140表達(dá)上調(diào),下調(diào)circ_0061140可抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的活性、增殖、侵襲和遷移,并引發(fā)了細(xì)胞凋亡,還可減少對miR-141-3p的吸收,提高miR-141-3p水平,由此增加對lin-28同系物B(lin-28 homolog B,LIN28B)的表達(dá)抑制,降低細(xì)胞活性[36]。CircRNA與子宮腺肌病的相關(guān)研究僅局限于對子宮內(nèi)膜細(xì)胞功能的影響,對于子宮腺肌病其他病理機(jī)制,如免疫炎癥、血管生成和EMT以及對子宮腺肌病特殊結(jié)構(gòu)內(nèi)膜-肌層交界區(qū)的影響尚待研究。

5 CircRNA與子宮內(nèi)膜炎

子宮內(nèi)膜炎是一種婦科常見的感染性和炎癥性子宮內(nèi)膜疾病。子宮內(nèi)膜抵御微生物感染和組織損傷的初始防御依賴于固有免疫系統(tǒng)[37]。感染時,子宮內(nèi)膜組織屏障的完整性破壞,抗炎能力持續(xù)下降。

5.1 通過TGF-β信號通路發(fā)揮抗炎作用 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SMAD2/3在炎癥中發(fā)揮重要作用,TGF-β1可通過激活SMAD3調(diào)節(jié)miRNA表達(dá),從而抑制炎癥的發(fā)生[38]。有研究使用大腸桿菌成功地建立了小鼠子宮內(nèi)膜炎癥模型,通過circRNA測序和實驗驗證篩選出子宮內(nèi)膜炎小鼠組織中差異表達(dá)的circRNA,功能/通路富集分析發(fā)現(xiàn)circRNA主要參與RNA聚合酶POL Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程及TGF-β信號通路。研究通過逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗進(jìn)一步驗證了小鼠子宮內(nèi)膜炎組織中TGF-β1和SMAD3的mRNA上調(diào)和磷酸化的SMAD3水平顯著降低[39]。這項研究表明circRNA在子宮內(nèi)膜炎中發(fā)揮抗炎作用,為circRNA治療子宮內(nèi)膜炎提供新思路。

5.2 抑制炎癥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 子宮內(nèi)膜炎癥改變促使上皮細(xì)胞凋亡[40]。研究發(fā)現(xiàn)circFADS2和成熟miR-643在子宮內(nèi)膜炎組織中表達(dá)升高,且兩者表達(dá)呈正相關(guān),提示circFADS2并非發(fā)揮分子海綿作用于miR-643。細(xì)胞實驗進(jìn)一步證實circFADS2過表達(dá)能增加成熟miR-643水平,同時兩者能減少發(fā)生炎癥反應(yīng)細(xì)胞的凋亡[41]。由此可知,circRNA可能是抑制子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的重要靶點。

6 CircRNA與宮腔粘連

6.1 發(fā)揮抗纖維化作用 宮腔粘連發(fā)生的最主要病理改變是多種原因造成子宮內(nèi)膜基底層損傷,子宮內(nèi)膜發(fā)生粘連或纖維化。有研究通過RNA測序及實驗研究在宮腔粘連組織中發(fā)現(xiàn)了多種差異表達(dá)的circRNA,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)宮腔粘連子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中circPlekha7顯著上調(diào),并且其過度表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞生存能力,同時抑制了細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白α平滑肌肌動蛋白、I型膠原蛋白和SMAD3的表達(dá);而circPlekha7的敲除顯示出相反的結(jié)果[42]。該研究結(jié)果表明circRNA在宮腔粘連中發(fā)揮了抗纖維化作用,并可能作為宮腔粘連患者的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。

6.2 在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療宮腔粘連中發(fā)揮促內(nèi)膜修復(fù)作用 人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù),改善其功能,已有臨床研究證明基于該細(xì)胞治療宮腔粘連的有效性和安全性[43]。CircRNA在人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)并影響子宮內(nèi)膜修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn),circPTP4A2在人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞中升高,并通過miR-330-5p/丙酮酸脫氫酶激酶2信號通路穩(wěn)定線粒體代謝,有助于人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞減少宮腔粘連小鼠模型的纖維化同時增加腺體生長[44]。研究提示,circRNA在人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞中可增強(qiáng)其子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用,促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)和生長。

7 總結(jié)與展望

CircRNA功能復(fù)雜多樣且受到表觀遺傳的調(diào)控,在子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜炎和宮腔粘連等子宮內(nèi)膜良性病變中主要發(fā)揮分子海綿作用參與發(fā)病機(jī)制和病理過程的生物調(diào)節(jié),但在子宮內(nèi)膜息肉以及子宮內(nèi)膜單純性增生中尚無相關(guān)研究。因此,circRNA在子宮內(nèi)膜良性疾病中的研究仍處于初期,能否成為診療靶點尚需進(jìn)一步驗證,circRNA的蛋白翻譯功能、直接調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)以及其與蛋白的相互作用是否在這些疾病中發(fā)揮作用仍有待研究。在未來,隨著RNA研究技術(shù)的發(fā)展,將發(fā)現(xiàn)更多的circRNA及其編碼蛋白,這些RNA及新型蛋白質(zhì)在子宮內(nèi)膜良性病變甚至是婦科疾病中的重要性也將日趨凸顯。