萬亭君

(西南民族大學(xué)民族學(xué)博士后科研流動(dòng)站,成都 610041;新華文軒出版?zhèn)髅焦煞萦邢薰静┦亢罂蒲泄ぷ髡?成都 610036)

0 引言

羌活NotopterygiuminchumTing ex H,T- Chang是一種傘形科植物的干燥根莖和根,又名護(hù)羌使者、羌青、胡王使者、退風(fēng)使者等,在《中國(guó)藥典》中記載其味辛、苦,性溫,歸膀胱、腎經(jīng),具有解表散寒、祛風(fēng)除濕、止痛的功效[1]。羌活傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)主要是藏族、羌族和其他少數(shù)民族聚居的高寒山區(qū)[2],是中、藏、羌醫(yī)藥體系常用藥物,具有悠久的藥用歷史和廣泛的應(yīng)用范圍?，F(xiàn)代藥理研究表明,羌活具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛等作用,對(duì)心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)有顯著影響[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥研究帶來了新的技術(shù)與方法,推進(jìn)了藥物發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和治療機(jī)制的理解過程,其系統(tǒng)性、整體性的研究理念與中藥復(fù)方多組分、多功效、協(xié)同作用等特點(diǎn)不謀而合,在中藥藥理機(jī)制研究、新藥發(fā)現(xiàn)及不良反應(yīng)研究等方面取得了良好成效[4]。本研究為拓展羌活的現(xiàn)代藥理學(xué)內(nèi)涵,選用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其藥理成分進(jìn)行篩選、分析,以期為更有針對(duì)性地深入探索其藥理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)庫的選擇

中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction、通用蛋白質(zhì)知識(shí)庫(Uniprot)、String 11.5、DAVID 6.8生物信息學(xué)資源。

1.2 優(yōu)效化合物的篩選

通過TCMSP檢索羌活的所有化學(xué)成分,設(shè)置化合物口服生物利用度(OB)閾值為≥30%,設(shè)定化合物類藥性(DL)閾值為≥0.18,獲得羌活的優(yōu)效化合物。

1.3 化合物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

將羌活的優(yōu)效化合物分別輸入TCMSP、BATMAN-TCM、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction檢索成分靶點(diǎn),合并、刪除重復(fù)靶點(diǎn),再應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換靶點(diǎn)蛋白名為基因名。

1.4 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.9.1將篩選出的優(yōu)效化合物和預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)基因進(jìn)行可視化呈現(xiàn),構(gòu)建化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白質(zhì)間相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在String 11.5數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入篩選所得的優(yōu)效化合物對(duì)應(yīng)的靶基因,設(shè)置最低相互作用分?jǐn)?shù)要求為0.900,獲得靶點(diǎn)間的相互作用網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步應(yīng)用CytoHubba分析獲得排名前10的核心基因。

1.6 基因本體論(GO)功能富集分析

將篩選出來的靶基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)效化合物的篩選

通過TCMSP檢索羌活的所有化學(xué)成分,共得到185個(gè)化學(xué)成分,閾值設(shè)定OB≥30%,DL≥0.18,結(jié)果共篩選出羌活優(yōu)效化合物15個(gè)(表1)。

表1 羌活優(yōu)效化合物篩選

2.2 化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過TCMSP檢索獲得相關(guān)靶點(diǎn),合并上述優(yōu)效化合物輸入至BATMAN-TCM、STITCH、SwissTargetPrediction獲得的靶點(diǎn),共檢索得到170個(gè)靶點(diǎn)蛋白,通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換基因后應(yīng)用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)(圖1)。圖中共有183個(gè)節(jié)點(diǎn),包含13個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、170個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)、246條連接線。圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),菱形節(jié)點(diǎn)代表化合物,連接線代表化合物-靶點(diǎn)的相互作用。圖中可見有多處同一靶點(diǎn)與不同化合物之間存在關(guān)聯(lián),進(jìn)一步印證了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖1 羌活優(yōu)效化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Notopterygiuminchum compound-target action network

2.3 羌活靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因的獲得

以“置信分?jǐn)?shù)≥0.900”作為條件構(gòu)建羌活靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。圖中有128個(gè)節(jié)點(diǎn)、560條邊,其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),邊表示靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。應(yīng)用Cytoscape 3.9.1將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化呈現(xiàn),進(jìn)一步采用MCODE模塊,以“score cutoff =0.2、 k core=2、 maximum depth = 100和degree cutoff=2”為條件進(jìn)行聚類分析,共獲得9個(gè)子網(wǎng)絡(luò),取分值最高的前5個(gè)聚類(圖3)。應(yīng)用Cytohubba對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排名,通過MCC的拓?fù)鋵W(xué)分析方法獲得排名前10的核心基因網(wǎng)絡(luò)(圖4)。

圖2 羌活優(yōu)效化合物靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Notopterygiuminchum compound target PPI network

圖3 聚類分值前5的子網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Subnetworks of top 5 cluster

圖4 排名前10的核心基因網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Top 10 core gene networks

圖3a～圖3e依次為分值降序的聚類子網(wǎng)絡(luò)。

2.4 羌活靶點(diǎn)的GO分析

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫,對(duì)羌活靶點(diǎn)的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能進(jìn)行富集分析,按照顯著性程度P<0.01獲得了GO條目333條,靶點(diǎn)涉及的生物過程條目有200條,細(xì)胞成分43條,分子功能90條。其中,生物過程主要富集在對(duì)藥物的反應(yīng)、外源代謝過程及對(duì)外源刺激的反應(yīng)等;分子功能主要富集在RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性、配體活化序列特異性DNA結(jié)合、血紅素結(jié)合及細(xì)胞色素-c氧化酶活性等;細(xì)胞成分主要富集在線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ、線粒體和大分子復(fù)合體等。

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),羌活具有抗心律失常、抗腫瘤、抗缺血缺氧、抗血栓、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌及抗病毒等作用[5]。為進(jìn)一步闡釋羌活的藥理作用機(jī)制,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,基于篩選出的羌活的優(yōu)效化合物構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體的功能注釋,為羌活優(yōu)效化合物的多靶點(diǎn)、多功效藥理作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

研究證實(shí),香豆素糖苷、達(dá)萵瑟苷、羌活酚等香豆素類化合物是羌活發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷等作用的有效成分[6]。羌活的甾體類化合物,如谷甾醇、β-谷甾醇也表現(xiàn)出廣泛的藥理活性,如抗炎、降血脂、抗腫瘤、抗血栓[7]等。此外,香葉木素等羌活的黃酮類化合物被證實(shí)有強(qiáng)烈的抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病及調(diào)節(jié)免疫作用[8]。

香豆素類化合物是羌活中主要的非揮發(fā)性成分,也是發(fā)現(xiàn)最早、最多的一類成分[9],該結(jié)論與TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出來的分子靶標(biāo)基本一致,說明通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的羌活主要分子靶標(biāo)的準(zhǔn)確性較高。

研究共預(yù)測(cè)得到羌活優(yōu)效化合物的靶點(diǎn)183個(gè),進(jìn)一步將其進(jìn)行PPI分析得到排名前10的核心基因,從化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可以推測(cè),羌活對(duì)疾病的治療或調(diào)節(jié)作用可能通過優(yōu)效化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用而發(fā)揮。

這10個(gè)核心基因均為細(xì)胞色素c氧化酶的組分,驅(qū)動(dòng)氧化磷酸化[10]。研究顯示,COX6B1具有增強(qiáng)能量消耗、抑制脂肪生成的作用[11]。COX7C對(duì)線粒體蛋白質(zhì)組的維持和線粒體功能的穩(wěn)定至關(guān)重要[12]。COX6C表達(dá)的變化在心血管疾病、腎臟疾病、腦損傷和腫瘤中都廣泛存在[13]。COX5A具有減少心肌細(xì)胞死亡并促進(jìn)心臟恢復(fù)的作用[14],具有保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元受到缺血缺氧損傷的作用[15]。COX4I1具有預(yù)防短暫性局灶性腦缺血損傷的作用[16],并與肥胖和2型糖尿病相關(guān)[17]。MT-CO1與腫瘤[18]、發(fā)生新心血管事件風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[19]。COX5B通過自噬途徑協(xié)調(diào)以平衡抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)活性[20],與膿毒癥有著顯著關(guān)聯(lián)[21]。研究證實(shí),其與年齡依賴性肥胖相關(guān)[22]。MT-CO2的表達(dá)與腫瘤預(yù)后[23]、冠狀動(dòng)脈性疾病[24]相關(guān)。COX7B與癌癥的化學(xué)敏感性和耐藥性相關(guān)[25]。COX8A與脂質(zhì)代謝[26]、腫瘤相關(guān)[27]。

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探索了羌活的優(yōu)效化合物、關(guān)鍵靶點(diǎn)、核心基因等,既驗(yàn)證了羌活的傳統(tǒng)藥理學(xué)作用,又有助于羌活潛在藥理作用和作用靶點(diǎn)等的挖掘,下一步還可對(duì)羌活的優(yōu)效單體成分進(jìn)行深入研究,為新藥開發(fā)、成藥優(yōu)化、臨床闡釋等提供數(shù)據(jù)支持和研究基礎(chǔ)。