劉登堂

東營市現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東東營 257091

0 引言

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖過程中的常見病，不僅造成產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)降低，還使發(fā)情期延緩，因此防止奶牛乳房炎發(fā)生和發(fā)展是當(dāng)前我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注重點[1]。奶牛乳房炎的產(chǎn)生原因主要有養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生不整潔、擠奶不科學(xué)、管理不當(dāng)、乳房受到碰撞和擠壓、疾病誘發(fā)和干奶期預(yù)防工作不到位等，其中細(xì)菌感染是主要原因之一。引起奶牛乳房炎的細(xì)菌主要包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和腸道產(chǎn)氣桿菌等，其中金黃葡萄球菌是最主要的病原菌，因此尋找和發(fā)現(xiàn)抗金黃色葡萄球菌的藥物十分重要[2，3]。目前，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)中防治由金黃色葡萄球菌引起奶牛乳房炎的藥物主要以傳統(tǒng)抗生素為主，但抗生素的大量使用甚至濫用不僅造成細(xì)菌耐藥，還引發(fā)藥物殘留、毒副作用。尋找一種能防治由金黃色葡萄球菌引起奶牛乳房炎的“替抗”藥物，成為當(dāng)前研究重點[4，5]。中藥作為我國傳統(tǒng)藥物，不僅歷史悠久，還具有價格低、來源廣、無藥物殘留、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等特點[6]。因此，本試驗以山東省某奶牛場患乳房炎奶牛乳樣中分離和保存的金黃色葡萄球菌為對象，研究蒲公英、連翹、通草和黃芩等17 味中藥及其復(fù)方對奶牛乳房炎金黃色葡萄球的體外抑菌效果，以期篩選出具有抗金黃色葡萄球菌的潛力中藥，也為抗奶牛乳房炎中藥及其制劑的研究和開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

本試驗于2023年4—6月進(jìn)行。金黃色葡萄球菌分離自山東省東營市某奶牛場患乳房炎奶牛的奶樣，由山東省東營市動物疫病預(yù)防控制中心微生物實驗室進(jìn)行鑒定、保存。

1.2 試驗中藥

蒲公英、連翹、通草、黃芩、大黃、菊花、芙蓉葉、金銀花、絲瓜絡(luò)、魚腥草、桔梗、白頭翁、板藍(lán)根、蘆薈、五倍子、知母和苦參共17 味中藥均購自山東省東營市本草堂中藥診所。

1.3 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂平板（9 cm）均購自于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

JY5002型電子天平，購自上海上天精密儀器有限公司；DH4000II型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司；HRCJ-ID型超凈工作臺，購自青島海爾特種電器有限公司；YHZ-112B型全溫恒溫?fù)u床，購自蘇州市國飛實驗室儀器有限公司；YXQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-203F/A型海信冰箱，購自海信（北京）電器有限公司；101-EBS型電熱鼓風(fēng)干燥箱，購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.5 菌種活化、增殖和計數(shù)

將分離冷凍保存的金黃色葡萄球菌置于胰蛋白胨大豆肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用接種環(huán)將活化后的金黃色葡萄球菌接種到甘露醇氯化鈉瓊脂平板（9 cm）上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑選單一菌落接種到10 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)18 h。參照葉建新等[7]的研究方法，確定金黃色葡萄球菌的對數(shù)生長期。用平板計數(shù)法測定菌液濃度，并用胰蛋白胨大豆肉湯將菌液濃度調(diào)至2.0×108CFU/mL。

1.6 中藥制備

分別稱取17 味中藥各50 g置于17 個燒杯中，每個燒杯加入500 mL超純水，浸泡60 min后，武火加熱煮沸后文火煎煮60 min，紗布過濾，向濾渣中再加入500 mL超純水，武火加熱煮沸后文火煎煮60 min，紗布過濾，合并濃縮兩次濾液至50 mL，使中藥水煎液的生藥濃度為1 g/mL，流通蒸汽滅菌后，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 藥敏片制備

分別取17 味中藥水煎液5 mL置于無菌干燥試管中，并向每個試管中加入5 片藥敏片，浸泡24 h后，置于37 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥后，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 抑菌試驗

取40 mL濃度為2.0×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液，均勻涂布在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，并分別將藥敏片置于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上后，將上述處理后的甘露醇氯化鈉瓊脂平板置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，量取抑菌圈直徑。每味中藥3 個重復(fù)。抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＞15 mm時判定為高度敏感；10 mm≤抑菌圈直徑≤15 mm時判定為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm時判定為低度敏感；無抑菌圈時判定為不敏感。

1.9 MIC 和MBC 測定

采用試管二倍稀釋法測定17 味中藥對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC。取無菌試管12 支，編號1～12 號，分別向所用試管中加入2 mL胰蛋白胨大豆肉湯，在1號試管中加入中藥水煎液2 mL，混合均勻，從1號試管中取2 mL，加入2號試管中，以此類推，直到10號試管中取出2 mL丟棄，使1～10號試管的藥物濃度分別為500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.813 mg/mL、3.906 mg/mL、1.953 mg/mL和0.977 mg/mL；11號試管為空白對照，不做任何處理；12號試管為陽性對照，不使用任何藥物；分別向1～10號試管和12號試管中添加10 μL菌液濃度為2.0×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液后，將1～12號試管置于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，觀察試管渾濁變化。以不發(fā)生渾濁變化的最小藥物濃度作為中藥對金黃色葡萄球菌的MIC。然后分別從不發(fā)生渾濁變化試管中取液體40 μL接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板，每種藥物3 個重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以菌落數(shù)小于5相對應(yīng)的最小藥物濃度作為中藥對金黃色葡萄球菌的MBC。

1.10 雙聯(lián)中藥復(fù)方FIC 的測定

選擇對金黃色葡萄球菌高度敏感的中藥進(jìn)行兩兩組合制成雙聯(lián)中藥復(fù)方。采用微量肉湯稀釋棋盤法測定雙聯(lián)中藥復(fù)方對金黃色葡萄球菌的MIC，并計算雙聯(lián)中藥復(fù)方的FIC。計算公式如下：FIC＝（甲藥聯(lián)用MIC/甲藥單用MIC）＋（乙藥聯(lián)用MIC/乙藥單用MIC）。雙聯(lián)中藥復(fù)方相關(guān)作用判讀標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)FIC≤0.5時判定為協(xié)同作用；當(dāng)0.5＜FIC≤1.0時判定為相加作用；當(dāng)1.0＜FIC指數(shù)≤2.0時判定為無關(guān)作用；當(dāng)FIC指數(shù)＞2.0時判定為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 每味中藥抑菌試驗

由表1可知，黃芩、連翹和五倍子3 味中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑＞15 mm，判定為高度敏感；板藍(lán)根對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在10～15 mm之間，判定為中度敏感；蒲公英、通草、金銀花、絲瓜絡(luò)和苦參5 味中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑＜10 mm，判定為低度敏感；大黃、菊花、芙蓉葉、魚腥草、桔梗、白頭翁、蘆薈和知母8味中藥無抑菌圈。

表1 17 味中藥對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗結(jié)果單位：mm

2.2 每味中藥MIC 和MBC 測定

由表2可知，不同中藥對金黃色葡萄球菌MIC和MBC的檢測結(jié)果分別為：黃芩7.813 mg/mL和15.625 mg/mL；連翹和五倍子相同，均為15.625 mg/mL和31.250 mg/mL；蒲公英、金銀花和苦參3 味中藥均為62.5 mg/mL和125.0 mg/mL；通草和絲瓜絡(luò)2味中藥均為125 mg/mL和250 mg/mL；板藍(lán)根最大，為250 mg/mL和500 mg/mL?？梢婞S芩對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳。

表2 不同中藥對金黃色葡萄球菌MIC 和MBC 的測定結(jié)果 單位：mg/mL

2.3 雙聯(lián)中藥復(fù)方FIC 測定

由表3可知，黃芩+連翹、黃芩+五倍子、連翹+五倍子雙聯(lián)中藥復(fù)方對金黃色葡萄球菌MIC的檢測結(jié)果均為15.625 mg/mL，F(xiàn)IC檢測結(jié)果分別為1.50、1.50、2.00，判定黃芩和連翹、黃芩和五倍子、連翹和五倍子均無相關(guān)作用。

表3 雙聯(lián)中藥復(fù)方FIC 指數(shù)的測定結(jié)果

3 討論

目前，抗生素是防治金黃色葡萄球菌引發(fā)奶牛乳房炎的常用方法。研究表明，氟喹諾酮類抗生素能進(jìn)入金黃色葡萄球菌體內(nèi)，抑制DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，阻斷金黃色葡萄球菌遺傳物質(zhì)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)抗菌作用[8]。但長期使用抗生素不僅產(chǎn)生耐藥性，降低治療效果，還在體內(nèi)大量殘留，影響奶牛生產(chǎn)，而且殘留藥物會隨乳汁流向餐桌，威脅食品安全。

中藥作為我國傳統(tǒng)防治奶牛乳房炎的藥物選擇之一，不易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留，有廣闊的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，公英散組分復(fù)方注射液對奶牛隱性乳房炎的治愈率、有效率分別為50.00%、77.78%[9]。但中藥成分復(fù)雜，一味中藥具有多種抗菌機(jī)理，或多味中藥具有一種抗菌機(jī)理。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、連翹、五倍子、板藍(lán)根、蒲公英、通草、金銀花、絲瓜絡(luò)和苦參9 味中藥對金黃色葡萄球菌均有抗菌作用，其中黃芩的抗菌作用最佳，其次為連翹和五倍子。黃芩的主要抗菌成分為黃芩苷和黃芩素等黃酮類化合物；連翹的主要抗菌成分為黃酮類、苷類和酚酸類化合物；五倍子的主要抗菌成分為沒食子酸和糅質(zhì)等化合物[10～12]。本研究發(fā)現(xiàn)，雙聯(lián)中藥復(fù)方體外抑菌效果與單味中藥的抑菌效果接近，雙聯(lián)中藥間均無相關(guān)作用。究其原因：一是中藥產(chǎn)地和提取工藝可能對有效成分的含量造成影響，需進(jìn)一步研究。二是不同菌株可能對中藥的敏感性不同。三是多味中藥配伍可能產(chǎn)生更好的抗菌效果。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，17 味中藥中黃芩的抗菌作用最佳， 3 種雙聯(lián)中藥復(fù)方與單味中藥對奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的抑菌效果接近，F(xiàn)IC分析顯示無關(guān)作用。