熊艷敏，周琳娜

（河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，河南 洛陽 471000）

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）為一種妊娠期常見并發(fā)癥，此類患者臨床多伴有皮膚瘙癢、黃疸等典型癥狀，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查可見其血清膽汁酸水平異常升高［1］。目前臨床尚未明確ICP 的具體發(fā)病原因，但考慮與家族遺傳、既往病史、孕期體內(nèi)激素水平紊亂等因素密切相關(guān)，同時(shí)，若孕婦自身年齡≥35 歲或伴人工受精等輔助生殖技術(shù)治療史、慢性肝膽性疾病時(shí)，發(fā)病ICP 的風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)較高［2］。ICP 患者的臨床癥狀及體征一般可在分娩結(jié)束后自行恢復(fù)，但也有部分患者可因血清膽汁酸水平控制不佳而出現(xiàn)羊水污染、早產(chǎn)、圍產(chǎn)兒窒息等多種不良妊娠結(jié)局，可對(duì)母體本身及新生兒生命安全造成嚴(yán)重威脅［3-4］。目前針對(duì)此病臨床尚未提出絕對(duì)理想的治療方法，一般以對(duì)癥治療、緩解臨床癥狀為主要治療原則［5］。近年國外有研究指出［6］，轉(zhuǎn)運(yùn)編碼基因ABCB4突變可參與ICP 疾病的發(fā)生，且ABCB4 蛋白高表達(dá)可增加新生兒不良預(yù)后發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。為進(jìn)一步明確ICP 發(fā)病機(jī)制并指導(dǎo)臨床治療，本研究旨在分析分析胎盤組織中ABCB4基因表達(dá)情況與ICP 患者血液指標(biāo)及妊娠結(jié)局的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文為回顧性研究，病例納入時(shí)間為2021 年1 月至2022 年12 月，研究對(duì)象為河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院112 例ICP 患者，根據(jù)臨床妊娠結(jié)局不同，將入組患者分為預(yù)后不良組（60 例）和預(yù)后良好組（52 例）。預(yù)后不良組中患者年齡23～35 歲，平均（28.44±5.17）歲；孕周36～40 周，平均（38.25±5.18）周；孕期體重指數(shù)（BMI）23.00～28.00 kg/m2，平均（25.58±5.13）kg/m2；產(chǎn)次：40 例為初產(chǎn)婦，20 例為經(jīng)產(chǎn)婦。預(yù)后良好組中患者年齡24～34 歲，平均（29.22±5.33）歲；孕周37～39 周，平均（38.23±5.21）周；孕期BMI 23.50～27.00 kg/m2，平 均（25.62±5.25）kg/m2；產(chǎn)次：35 例為初產(chǎn)婦，17 例為經(jīng)產(chǎn)婦。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本次研究已獲得河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)（33929）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①入組患者均符合ICP 診斷要點(diǎn)［7］；②均為單胎、足月妊娠；③年齡均≤35 歲；④均知悉此次亞努就試驗(yàn)?zāi)康募皟?nèi)容，同意獲取并公開既往臨床資料。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病等［8-9］合并癥者；②伴有其他心肺、肝腎功能異常者；③惡性腫瘤者；④伴免疫功能障礙或其他感染性疾病者；⑤臨床資料缺失者。

1.2 方法

胎盤ABCB4 檢測方法：①檢測樣本：于剖宮產(chǎn)術(shù)胎盤娩出后15 min 內(nèi)，在母體面中央?yún)^(qū)域剪取1 cm3大小胎盤組織，加入濃度為10%的甲醛溶液（上海溶劑廠，H31020858，規(guī)格：500 g）進(jìn)行固定后備用。②ABCB4 陽性表達(dá)率檢測：經(jīng)免疫組化法觀察ABCB4 的陽性表達(dá)率，對(duì)胎盤組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理，后加入0.01 mmol/L 的檸檬酸鈉緩沖溶液修復(fù)切片組織中抗原；加入濃度為3%的過氧化氫溶液（海德潤制藥，H11021382，規(guī)格：3%）后于室溫下孵育10 min，并將內(nèi)源性過氧化氫酶進(jìn)行封閉；應(yīng)用磷酸鹽緩沖液對(duì)樣本進(jìn)行反復(fù)沖洗，后加入1∶10 的ABCB4 單抗稀釋后孵育120 min；再次應(yīng)用磷酸鹽緩沖液（北京生物制品研究所，S10850002）反復(fù)沖洗并加入ABCB4 單抗后再孵育30 min；經(jīng)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行第三次反復(fù)沖洗后加入二氨基聯(lián)苯胺［北京沃凱生物科技有限公司，滬食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013 第1401615 號(hào)］進(jìn)行原位雜交顯色反應(yīng)并依次采用蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明并應(yīng)用中性樹膠予以封片后，于顯微鏡下隨機(jī)觀察3 個(gè)400 倍視野，評(píng)估陽性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度。③ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測：經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測ABCB4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，于冷凍的胎盤組織樣本中加入生理鹽水洗滌至無血色后，將其剪碎并置于勻漿器中；通過Trizol 法提取ABCB4 蛋白的RNA，于260 nm 條件下測定并記錄吸光度，以此計(jì)算ABCB4 蛋白的RNA 純度及含量；取2 μg總RNA 實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，獲取PCR 產(chǎn)物后在95℃下予以5 min 預(yù)變性，后予以3 s 變性并在58℃下進(jìn)行40 s 退火，在72℃下進(jìn)行30 s 延伸，以此重復(fù)40 次；測定ABCB4 蛋白灰度，并參考β-actin 灰度記錄ABCB4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)

①記錄并對(duì)比兩組患者的胎盤ABCB4 陽性表達(dá)率、ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量；②檢測并對(duì)比兩組患者的血液指標(biāo)，統(tǒng)一采集外周靜脈血作抗凝處理，后按轉(zhuǎn)速3 000 r/min，半徑10 cm 離心5 min 后將血清樣本送入AU5800 全自動(dòng)生化分析儀［美國，貝克曼庫爾特公司，國食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2010 第2402510 號(hào)］中分別檢測兩組患者的膽汁酸水平、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平，其中膽汁酸檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，AST、ALT 檢測方法為放射免疫法。③經(jīng)Spearman 相關(guān)性系數(shù)檢驗(yàn)ABCB4 陽性表達(dá)率及mRNA 相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性［10］。④通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析外泌體ABCB4 陽性表達(dá)率及mRNA 相對(duì)表達(dá)量與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性，當(dāng)曲線下面積（AUC）＞0.85 時(shí)認(rèn)為二者顯著相關(guān)［11］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS 22.0 處理，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表 示，用t檢 驗(yàn)；經(jīng)Spearman 相關(guān)性系數(shù)檢驗(yàn)ABCB4 陽性表達(dá)率及mRNA 相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性；通過繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析外泌體ABCB4 陽性表達(dá)率及mRNA 相對(duì)表達(dá)量與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的ABCB4 表達(dá)情況比較

經(jīng)檢測，預(yù)后不良組的ABCB4 陽性表達(dá)率高于預(yù)后良好組，ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者的ABCB4 表達(dá)情況比較

2.2 兩組患者的血液指標(biāo)比較

經(jīng)檢測，預(yù)后不良組患者的膽汁酸水平、AST、ALT 均高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者的血液指標(biāo)比較（）

表2 兩組患者的血液指標(biāo)比較（）

2.3 ABCB4 表達(dá)與血液指標(biāo)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman 相關(guān)性系數(shù)檢驗(yàn)，胎盤ABCB4 陽性表達(dá)率與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平正相關(guān)，ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 ABCB4 表達(dá)與血液指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 ABCB4 表達(dá)對(duì)不良妊娠結(jié)局的預(yù)測效能

經(jīng)ROC 曲線驗(yàn)證，ICP 患者不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)會(huì)隨ABCB4 陽性表達(dá)率升高、ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低而不斷上升（AUC均＞0.85），見表4、圖1。

圖1 ABCB4 表達(dá)對(duì)不良妊娠結(jié)局預(yù)測ROC 圖

表4 ABCB4 表達(dá)對(duì)不良妊娠結(jié)局的預(yù)測效能

3 討論

ICP 為一種好發(fā)于妊娠中晚期的常見疾病，為一種可導(dǎo)致多種不良妊娠結(jié)局并嚴(yán)重威脅母嬰生命安全的妊娠期并發(fā)癥，目前認(rèn)為，此病多見于自身合并非酒精性肝硬化、胰腺炎、膽囊炎、膽結(jié)石等多種慢性肝膽系統(tǒng)疾病患者，其發(fā)病考慮與孕期體內(nèi)激素水平紊亂或個(gè)人遺傳、環(huán)境因素等密切相關(guān)［12］。因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)階段臨床仍缺乏治療ICP 的特殊方法，將膽汁酸水平下調(diào)至40 mmol/L 及以下并緩解臨床癥狀為ICP 患者的主要治療原則［13］。近年隨遺傳基因和分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們逐步認(rèn)識(shí)到可參與膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌的多種基因載體在ICP 發(fā)病機(jī)制中產(chǎn)生的重要作用，也有研究證實(shí)［14］，ABCB4基因突變可導(dǎo)致DME3 蛋白缺乏并抑制膽汁磷脂分泌或促使膽堿游離，隨膽管細(xì)胞凋亡或壞死，孕婦膽道系統(tǒng)內(nèi)可有大量膽汁預(yù)計(jì)并聚集為高濃度膽汁酸。

若胎盤組織中膽汁酸水平過高則會(huì)導(dǎo)致胎盤內(nèi)血流因絨毛膜血管收縮不足而減少，進(jìn)而影響胎盤的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)［15］。高水平膽汁酸不僅會(huì)增加羊水污染風(fēng)險(xiǎn)，還可直接損傷胎兒細(xì)胞及組織，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窘迫或新生兒窒息［16］。研究表明［17］，ABCB4 為染色7q21.1 的重要載體，為肝臟毛細(xì)膽管膜磷脂的主要輸出泵，可有效保護(hù)膽管細(xì)胞免于膽汁鹽損傷。本研究中，伴不良妊娠結(jié)局的預(yù)后不良組內(nèi)患者的ABCB4 陽性表達(dá)率高于預(yù)后良好組，ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于預(yù)后良好組，提示ABCB4 表達(dá)情況與ICP 患者預(yù)后情況有緊密聯(lián)系。趙臨瀟等［18］研究表明，ICP 孕婦的ABCB4基因表達(dá)水平下降可增加不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，該研究中，ICP 組內(nèi)患者的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，與本研究結(jié)果一致。國外相關(guān)研究指出［19］，ABCB4 與膽汁淤積有密切關(guān)聯(lián)。ABCB4基因突變可導(dǎo)致DMR3 蛋白匱乏、磷脂分泌減少，膽石癥、AST 活性增強(qiáng)所致肝膽疾病均可導(dǎo)致膽汁淤積，上述患者的ABCB4基因突變率為26.8%～44.4%不等。而本研究中，預(yù)后不良組患者的膽汁酸水平、AST、ALT 均高于預(yù)后良好組，提示膽汁淤積程度越嚴(yán)重，ICP 患者的膽汁酸水平及肝功能損傷程度更高。經(jīng)Spearman 相關(guān)性系數(shù)驗(yàn)證得知，胎盤ABCB4 陽性表達(dá)率與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平正相關(guān)，ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與ICP 患者的膽汁酸、AST、ALT 水平負(fù)相關(guān)。且經(jīng)ROC 曲線驗(yàn)證后得知，ICP 患者不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)會(huì)隨ABCB4 陽性表達(dá)率升高、ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低而不斷上升，提示通過檢測ABCB4 陽性表達(dá)率及mRNA 相對(duì)表達(dá)量或可實(shí)現(xiàn)對(duì)ICP 患者不良妊娠結(jié)局的有效預(yù)測。宇海燕等［20］也表示，ABCB4 表達(dá)水平越低，ICP 患者不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率越高，ABCB4 表達(dá)或可成為預(yù)測患者妊娠結(jié)局的重要指標(biāo)。與本研究結(jié)論具有一致性。

綜上所述，ABCB4 陽性表達(dá)率會(huì)隨ICP 膽汁酸水平、AST、ALT 水平升高而上升，但I(xiàn)CP 不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與ABCB4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量負(fù)相關(guān)。