王金夢(mèng)，孫春曉，吳勃，，王云龍，丁文濤，3，郭慶彬，3*，王昌祿，3*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.杭州保安康生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310014；3.天津科技大學(xué) 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

瓜爾膠（guar gum，GG），又名瓜爾豆膠，是一類天然的半乳甘露聚糖。瓜爾膠主鏈的甘露糖通過β-（1，4-）糖苷鍵連接，側(cè)鏈的半乳糖通過α-（1，6-）糖苷鍵連接在主鏈上，甘露糖和半乳糖的摩爾比約為2∶1。瓜爾膠的平均分子量為250～5 000 kDa，可用作食品添加劑、藥物載體、飼料黏合劑等。然而，將高分子量的天然瓜爾膠添加到動(dòng)物飼料中，可引起某些單胃動(dòng)物的不良反應(yīng)，這與胃腸中食糜黏度增加有關(guān)，限制了其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[1]。因此，需要對(duì)瓜爾膠進(jìn)行降解改性，提高實(shí)用價(jià)值。

瓜爾膠的降解改性主要有物理法、化學(xué)法和酶法3 種。物理法主要有熱處理[2]、微波[3]、輻照[4]和超聲降解[5]等方法。物理法對(duì)降解產(chǎn)物的成分和性質(zhì)的影響較小，但難以控制產(chǎn)物的聚合度，不能徹底降解，易造成原料浪費(fèi)。化學(xué)法主要包括氧化降解法和酸降解法[6]。氧化降解法多采用氧化劑，如過氧化氫、過硫酸鉀等進(jìn)行氧化降解。酸降解法通常采用硫酸、鹽酸等強(qiáng)酸進(jìn)行降解。降解過程中加入的試劑可能在產(chǎn)物中殘留，對(duì)產(chǎn)物的化學(xué)成分造成影響。酶法是指通過酶處理瓜爾膠，得到分子量較低的酶解產(chǎn)物，通常采用β-甘露聚糖酶對(duì)瓜爾膠進(jìn)行降解，使主鏈的β-（1，4-）糖苷鍵斷裂，得到瓜爾膠水解物（guar gum hydrolysate，GGH）。與天然GG 相比，GGH 的鏈長(zhǎng)縮短，分子量和黏度大大降低，可以作為膳食纖維加以利用。與物理和化學(xué)方法相比，酶法反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可控，且高效、特異性強(qiáng)，能耗低、無污染，是最常用的降解GG 的方法。

多糖的酵解特性與其分子量、溶解度和單糖組成等性質(zhì)有關(guān)。目前，關(guān)于分子量和酵解特性的研究報(bào)道相對(duì)較多。魔芋甘露聚糖經(jīng)β-甘露聚糖酶降解后，顯著提高了小鼠結(jié)腸內(nèi)的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）濃度，可能是較低分子量的魔芋甘露聚糖更易被結(jié)腸微生物酵解[7]。Ho 等[8]通過研究不同聚合度的低聚木糖和多聚木糖的體外酵解特性發(fā)現(xiàn)，低聚合度的低聚木糖/多聚木糖更能促進(jìn)有機(jī)酸的產(chǎn)生和雙歧桿菌的生長(zhǎng)。

本研究以GG 為原料，通過酶解法制備3 種不同分子量的GGH，采用豬結(jié)腸消化物構(gòu)建體外酵解模型，評(píng)價(jià)GG 和GGH 的酵解特性，探討分子量對(duì)GGH體外酵解特性的影響。通過細(xì)菌16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序分析技術(shù)，評(píng)估GG 和不同分子量的GGH 在酵解過程中對(duì)腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)的影響，以期為GGH 的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

瓜爾膠：北京瓜爾潤(rùn)科技有限公司；β-甘露聚糖酶（酶A，187.209 9 IU/g）：杭州保安康生物技術(shù)有限公司；β-甘露聚糖酶（酶B，117.1032 IU/g）：奕農(nóng)生物科技有限公司；豬結(jié)腸消化物：天津農(nóng)博養(yǎng)豬場(chǎng)。

1.1.2 試劑

乙醇、碳酸鈉、氯化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅：天津市江天化工試劑公司；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑、氯化鈷、VB1、VB2、VB6、煙酰胺、泛酸鈣、對(duì)氨基苯甲酸、VH、VB12、葉酸、L-鹽酸半胱氨酸、刃天青：北京索萊寶科技有限公司；硫酸、鹽酸：天津市化學(xué)試劑一廠；硝酸鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；甘露糖、脂肪酸標(biāo)品、2-乙基丁酸：美國(guó)Sigma 公司。除甘露糖純度為優(yōu)級(jí)純外，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器（LP Vortex Mixer）：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；傅里葉紅外光譜儀（IS50）：廣州尼高利科學(xué)儀器有限公司；示差高效液相色譜儀（LC-20A）、熱脫附氣相色譜儀（GC2010 Plus）：日本島津公司；搖床（ZWY-103B）：上海智城分析儀器制造有限公司；快速冷凍干燥機(jī)（Alpha 2-4 LD plus）：德國(guó)CHRIST 公司；冷凍離心機(jī)（Avanti J-26 XP）：北京吉艾姆科技有限公司；高壓滅菌鍋（LDZH-200KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠；厭氧培養(yǎng)箱（YOX-II）：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pH 計(jì)（PB-10）：德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GGH 制備

將10 g 瓜爾膠邊攪拌邊加入到100 mL 預(yù)熱至50 ℃、含有40 IU/g 的β-甘露聚糖酶溶液中，持續(xù)攪拌反應(yīng)3 h，沸水浴15 min，滅酶活，離心（4 000 r/min，20 min），分離沉淀和上清液，在上清液中加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置12 h，離心（4 000 r/min，20 min），分離沉淀和上清液，濃縮上清液，凍干，得到GGH。根據(jù)分子量大小將GGH 分別命名為GGH-1（32.41 kDa）、GGH-2（10.15 kDa）和GGH-3（5.89 kDa），其中GGH-1 為酶A 處理得到的樣品，GGH-2 為酶A和酶B 按照3∶1 體積比混合處理得到的樣品，GGH-3為酶B 處理得到的樣品。

1.3.2 樣品分子量測(cè)定

將GG 配制成3 mg/mL 的溶液，酶解得到的不同分子量的GGH 配制成10 mg/mL 的溶液，過0.22μm 濾膜，采用示差高效液相色譜儀進(jìn)行分子量測(cè)定。以不同分子量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTMDP 120A column（分子量測(cè)定范圍10～400 kDa）和UltrahydrogelTM500 column（分子量測(cè)定范圍0.1～5 kDa）水溶性凝膠柱串聯(lián)；保護(hù)柱為UltrahydrogelTMDP guard column；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為0.1 mol/L 硝酸鈉溶液；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量20μL。

1.3.3 豬結(jié)腸消化物的制備

新鮮的豬結(jié)腸消化物取自6 只健康大豬供體，大豬在近6 個(gè)月內(nèi)未有抗生素治療史。將收集到的豬結(jié)腸消化物等量混合，保存在-80 ℃冰箱待用。

1.3.4 厭氧培養(yǎng)基的配制

根據(jù)表1 制備厭氧培養(yǎng)基。

先將成分1 溶于995 mL 超純水中，用5 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為6.8，將溶液轉(zhuǎn)移至1 L 棕色瓶中，超聲除氣泡。超聲結(jié)束后，充入氮?dú)猓?21 ℃滅菌20 min。再將成分2 溶于5 mL 超純水中，過0.22μm 無菌濾膜除菌，充入氮?dú)?。最后，在厭氧箱中將成? 和成分2 溶液混合。

1.3.5 體外模擬腸道酵解

在體外酵解體系中，將GG 及不同分子量的GGH樣品、豬結(jié)腸消化物與厭氧培養(yǎng)基混合。GG 及不同分子量的GGH 樣品作為碳源，濃度為1%（g/mL），豬結(jié)腸消化物濃度為10%（g/mL）。參考Ding 等[9]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體如下：在離心管中分別稱取GG 和不同分子量的GGH 樣品各0.06 g，加入6 mL 厭氧培養(yǎng)基，溶解，獲得樣品溶液。在厭氧箱中，稱取0.6 g 豬結(jié)腸消化物于離心管中，加入樣品溶液，并充分混勻。空白組（negative control，NC）只添加0.6 g 豬結(jié)腸消化物和6 mL 厭氧培養(yǎng)基，無碳源。

采用封口膜將離心管封口，裝入?yún)捬醮?，?7 ℃、250 r/min 厭氧培養(yǎng)箱中發(fā)酵0、6、12、24、48 h，依次取樣。發(fā)酵后的樣品在11 000 r/min、4 ℃下離心20 min，分離沉淀和上清液。上清液過0.45μm 無菌濾膜，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)pH 值、總糖含量、還原糖含量、分子量、短鏈脂肪酸濃度等指標(biāo)的測(cè)定，沉淀用于腸道菌群的測(cè)定。

1.3.6 酵解液分子量測(cè)定

酵解液過0.22μm 濾膜后，采用示差高效液相色譜儀進(jìn)行分子量測(cè)定。色譜條件同1.3.2。

1.3.7 酵解液糖含量測(cè)定

參考Yin 等[7]的方法，采用苯酚-硫酸法測(cè)定酵解液總糖含量。采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑盒測(cè)定酵解液還原糖含量。

1.3.8 酵解液pH 值測(cè)定

取1～2 mL 上清液于10 mL 離心管中，采用pH 計(jì)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間酵解液的pH 值。

1.3.9 短鏈脂肪酸濃度測(cè)定

參考Wang 等[10]的方法對(duì)酵解液進(jìn)行處理，利用熱脫附氣相色譜儀對(duì)短鏈脂肪酸濃度進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜柱為NukolTMFused Silica Capillary Column（60 cm×0.25 mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度200 ℃；火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度250 ℃；H2流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min；進(jìn)樣量1μL。

1.3.10 酵解物腸道菌群檢測(cè)

將GG 和3 種不同分子量的GGH 的體外模擬腸道酵解液在11 000 r/min、4 ℃下離心20 min，得到菌體沉淀送檢，進(jìn)行16S rDNA 宏基因組測(cè)序，進(jìn)行腸道菌群分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 和Duncan 方法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重測(cè)試分析，P＜0.05 時(shí)表示處理的結(jié)果存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 GG 和GGH 的分子量

根據(jù)1.3.2 的方法測(cè)定GGH 和GG 的分子量，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 GG 和3 種GGH 的HPSEC 譜圖Fig.1 HPSEC spectra of GG and three GGHs

由圖1 可知，通過GG 和GGH 的保留時(shí)間，計(jì)算得到GG 的分子量為790.25 kDa，而GGH-1、GGH-2 和GGH-3 的分子量分別為32.41、10.15、5.89 kDa。與GG相比，GGH 的分子量大幅降低，這是由于β-甘露聚糖酶使瓜爾膠主鏈斷裂，鏈長(zhǎng)縮短，聚合度降低，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。

2.2 酵解過程中分子量的變化

對(duì)GG 和3 種不同分子量的GGH 接種豬結(jié)腸消化物后的酵解特性進(jìn)行了對(duì)比。酵解過程中樣品的分子量變化如圖2 所示。

圖2 酵解過程中分子量的變化Fig.2 Changes of molecular weight during fermentation in vitro

圖2 中34.9 min 處的峰來自于豬結(jié)腸消化物和厭氧培養(yǎng)基中的物質(zhì)，出峰時(shí)間晚于樣品，因此，不影響酵解過程中樣品分子量的檢測(cè)。由圖2（b）可知，酵解到6 h 時(shí)，GG 的分子量由最初的790.25 kDa 降至96.8 kDa。3 種GGH 也被快速發(fā)酵，到12 h 時(shí)，其分子量分別為8.5、4.7、4.2 kDa。酵解進(jìn)行到24 h 時(shí)，樣品分子量進(jìn)一步降低，且樣品峰的比例持續(xù)降低，表明在體外模擬酵解過程中，腸道微生物可以持續(xù)利用GG和不同分子量的GGH 作為碳源進(jìn)行酵解。酵解48 h時(shí)，樣品分子量變化很小，說明樣品基本完成酵解。在體外酵解模型中，GG 和不同分子量的GGH 可以被腸道菌群酵解利用，生成小分子的代謝產(chǎn)物。其他的多糖，如阿拉伯木聚糖[12]、羅望子多糖[13]、雪菊多糖[14]等也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。多糖的酵解特性與溶解度、單糖組成等理化特性有關(guān)。溶解度高、聚合度低的多糖發(fā)酵速率高，主要在結(jié)腸近端發(fā)酵，而不溶性和高聚合度的多糖發(fā)酵速率較低，在結(jié)腸遠(yuǎn)端發(fā)酵[15]。因此，為了延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，需要進(jìn)一步研究多糖的酵解特性，以確定最有利的理化特性。

2.3 酵解過程中糖含量的變化

腸道微生物可以產(chǎn)生糖苷水解酶來破壞碳水化合物中相應(yīng)的糖苷鍵，并逐漸利用產(chǎn)生的寡糖，從而導(dǎo)致酵解體系中總糖含量降低，因此，可以通過糖含量的變化來確定碳水化合物的發(fā)酵程度。體外酵解過程中總糖和還原糖含量的變化如圖3 所示。

圖3 酵解過程中糖含量的變化Fig.3 Changes of sugar content during fermentation in vitro

由圖3（a）可知，在酵解過程中，空白組總糖含量幾乎無變化，而實(shí)驗(yàn)組的總糖含量隨酵解時(shí)間延長(zhǎng)均呈快速下降趨勢(shì)。到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，GG 由最初的（4.55±0.29）mg/mL 降至（0.18±0.02）mg/mL；GGH-1、GGH-2和GGH-3 則分別由（6.14±0.13）、（6.44±0.19）和（6.13±0.11）mg/mL 降至（0.72±0.05）、（0.86±0.01）和（0.68±0.03）mg/mL?？偺呛拷档?，說明GG 和不同分子量的GGH 可以作為碳源供腸道微生物酵解利用。

從圖3（b）可知，在整個(gè)酵解過程中，除空白組的還原糖含量幾乎無變化外，實(shí)驗(yàn)組的還原糖含量均呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，均在酵解12 h 時(shí)達(dá)到峰值，說明微生物可以酵解利用GG 和不同分子量的GGH，導(dǎo)致其分子中的糖苷鍵斷裂，生成小分子糖，并進(jìn)一步利用小分子糖，產(chǎn)生代謝物質(zhì)。其中GGH-3 在12 h 時(shí)還原糖含量達(dá)到最大值（1.50±0.08）mg/mL，與GGH-1、GGH-2 接近，顯著高于GG 處理組（P＜0.05）。12～48 h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組還原糖含量迅速降低，可能是由于樣品本身含有的還原糖以及酵解過程中產(chǎn)生的還原糖被微生物利用。鐵皮石斛多糖在體外酵解過程中糖含量也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)，多糖不斷被結(jié)腸微生物酵解，總糖含量逐漸降低，還原糖含量先增后減，說明多糖可以作為碳源被腸道微生物利用[16]。

2.4 酵解過程中pH 值的變化

pH 值可以作為體外酵解實(shí)驗(yàn)中的重要指標(biāo)，反映酵解體系中碳水化合物的利用和有機(jī)酸的產(chǎn)生情況。圖4 展示了酵解過程中pH 值的變化。

圖4 酵解過程中pH 值的變化Fig.4 Changes of pH during fermentation in vitro

由圖4 可知，各組初始pH 值均在8.00 以上。隨著酵解的進(jìn)行，空白組pH 值略降低，從最初的8.13±0.03降至7.38±0.05。GG 和不同分子量的GGH 在0～24 h內(nèi)，pH 值顯著降低（P＜0.05）。其中6～12 h 內(nèi)，pH 值的降低速率最快，說明在6～12 h 內(nèi)微生物酵解GG 和不同分子量的GGH，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的代謝活動(dòng)最為活躍。酵解到48 h 時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的pH 值變化趨于平穩(wěn)，說明GG 和不同分子量的GGH 基本被微生物完全酵解利用，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的速度減緩，因此，pH 值基本保持不變。同時(shí)，除發(fā)酵初始外，實(shí)驗(yàn)組pH 值均顯著低于空白組（P＜0.05），這與Paesani 等[12]研究結(jié)果一致。降低結(jié)腸和糞便的pH 值，可能對(duì)結(jié)腸環(huán)境有益。酸性環(huán)境可以抑制某些致病菌的增殖，從而刺激有益細(xì)菌，如雙歧桿菌、丁酸和乳酸發(fā)酵細(xì)菌的增殖[15]。

2.5 酵解過程中SCFAs 濃度的變化

SCFAs 是微生物酵解多糖產(chǎn)生的主要產(chǎn)物，是重要的能量和信號(hào)分子[17]，多糖的理化特性與腸道菌群的酵解代謝有關(guān)，從而影響SCFAs 的生成[18]。圖5 展示了體外酵解過程中酵解液的總SCFAs、乙酸、丙酸和丁酸的濃度變化。

圖5 酵解過程中SCFAs 含量的變化Fig.5 Changes of SCFAs content during fermentation in vitro

由圖5 可知，隨著酵解時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的總SCFAs 濃度均呈現(xiàn)出逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，說明微生物可以持續(xù)利用GG 和不同分子量的GGH，產(chǎn)生低分子量的寡糖或單糖，進(jìn)而生成SCFAs。酵解6 h 時(shí)，GGH-1的總SCFAs 濃度最高，其次是GGH-3 和GGH-2。繼續(xù)酵解至12 h，GG 的總SCFAs 濃度迅速升高，為（16.45±3.10）mmol/L，僅次于GGH-1。24 h 時(shí)，GGH-2的總SCFAs 濃度從12 h 的（8.91±0.64）mmol/L 增加至（18.60±5.86）mmol/L。酵解結(jié)束時(shí)，各處理組總SCFAs 濃度均達(dá)到峰值。其中，GGH-1 的濃度最高，為（33.46±4.42）mmol/L；隨后依次是GG、GGH-3 和GGH-2，其總SCFAs 濃度分別是空白組的3.04、2.93 倍和2.32 倍。

在體外酵解過程中，乙酸是腸道微生物酵解利用碳水化合物產(chǎn)生的主要產(chǎn)物。GGH-1 的乙酸濃度最高，在48 h 時(shí)達(dá)到峰值。在酵解過程中，實(shí)驗(yàn)組的乙酸濃度變化趨勢(shì)與總SCFAs 濃度變化趨勢(shì)基本一致，Reichardt 等[19]研究也證實(shí)，半乳甘露聚糖在酵解過程中乙酸形成的動(dòng)力學(xué)與總SCFAs 相似。丙酸濃度也在48 h 時(shí)達(dá)到最大值，其中，GG 和GGH-3 的丙酸濃度較高。酵解到12 h 時(shí)，GG、GGH-1 和GGH-3 的丁酸濃度達(dá)到最大值。其中，GGH-1 的產(chǎn)丁酸效果最好，丁酸濃度從發(fā)酵初始的（0.35±0.07）mmol/L 增加到（2.91±0.67）mmol/L。

腸道微生物酵解利用多糖產(chǎn)生的SCFAs 對(duì)宿主健康有益。在本研究中，產(chǎn)生的SCFAs 以乙酸為主，乙酸不僅可以為心臟、大腦和肌肉供能，而且在糖異生、脂肪生成和膽固醇合成中也起著重要作用[20]。丙酸可以增加葡萄糖攝取和脂肪生成，對(duì)脂肪組織有直接的有益作用[21]。丁酸是腸上皮細(xì)胞主要的能量來源，在調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞、T 細(xì)胞增殖和腸道免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[22]。

2.6 腸道微生物的測(cè)定

2.6.1 Alpha 多樣性分析

由2.5 的結(jié)果可知，添加GG 和不同分子量的GGH 后，酵解體系中的乙酸、丙酸、丁酸等代謝產(chǎn)物濃度增加，由此推測(cè)，在GG 和不同分子量GGH 的酵解過程中，腸道菌群發(fā)生了明顯變化，因此，對(duì)酵解物進(jìn)行腸道菌群檢測(cè)和對(duì)比分析。圖6 為樣品的稀釋性曲線，表2 為各組樣本的Shannon 指數(shù)。

圖6 各組樣本的稀釋性曲線Fig.6 Rarefaction curve in various groups

表2 各組樣本的Shannon 指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Shannon index statistics of intestinal microbiota

稀釋性曲線可以反映數(shù)據(jù)的合理性和連續(xù)抽樣條件下新特征出現(xiàn)的速率。從圖6 中可以看出，隨著測(cè)序條數(shù)的不斷增加，發(fā)現(xiàn)的物種逐漸增多，稀釋性曲線逐漸趨于平緩，說明樣品序列充分，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，能夠反映樣本的腸道菌群分布狀況，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。此外，Shannon 指數(shù)與腸道菌群多樣性呈正相關(guān)。在本研究中，空白組的Shannon 指數(shù)顯著高于實(shí)驗(yàn)組，可能是由于體外酵解模型缺乏宿主對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[23]，某些菌種在相對(duì)匱乏的營(yíng)養(yǎng)條件下，在對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，因此，這些菌種的增殖受到影響，導(dǎo)致腸道菌群多樣性降低。

2.6.2 主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）

PCoA 可以反映主成分對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)值，或?qū)θ郝錁颖镜慕忉尪?。酵?4 h 后的腸道菌群樣本基于bray-curtis 算法的PCoA 如圖7 所示。

圖7 各組樣本基于bray-curtis 的主坐標(biāo)分析Fig.7 Principal co-ordinates analysis（PCoA）based on bray-curtis distance in various groups

由圖7 可知，各組內(nèi)樣本間距離較近，說明組內(nèi)3 個(gè)平行間微生物群落結(jié)構(gòu)相似，平行效果較好。酵解24 h后，實(shí)驗(yàn)組與空白組距離較遠(yuǎn)，說明實(shí)驗(yàn)組與空白組的物種組成存在差異。而且，GG 和不同分子量的GGH對(duì)于微生物群落結(jié)構(gòu)造成的影響是不同的。與3 種GGH 相比，GG 與空白組之間的距離更近，說明添加瓜爾膠的結(jié)腸消化物的菌落結(jié)構(gòu)與空白組更接近，3 種不同分子量的GGH 對(duì)菌落結(jié)構(gòu)的影響更大。

2.6.3 門分類水平的物種分布

物種分布柱狀圖可以顯示不同物種在腸道菌群中所占的比例，圖8 為GG 和不同分子量的GGH 酵解24 h 時(shí)，對(duì)厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）的影響。

圖8 GG 和GGH 酵解24 h 后門水平物種分布的變化Fig.8 Changes of flora on the phylum level after 24 h fermentation of GG and GGH

由圖8 中可知，各組樣品中厚壁菌門和變形菌門的數(shù)量占比較高，在90%以上，其中，厚壁菌門的相對(duì)豐度最高，均在40% 以上。與空白組相比，酵解24 h后，不同分子量GGH 處理組的厚壁菌門相對(duì)豐度減少（P＜0.05），而變形菌門相對(duì)豐度大幅增加（P＜0.05）；GG 處理組厚壁菌門相對(duì)豐度與空白組相似，變形菌門的相對(duì)豐度略增加，但效果不顯著（P＞0.05）。此外，GG 與GGH 處理組的擬桿門豐度均顯著低于空白組（P＜0.05）。

2.6.4 屬分類水平的物種分布

圖9 為GG 和不同分子量的GGH 酵解24 h 時(shí)在屬分類水平上對(duì)腸道菌群的影響，圖中展示了相對(duì)豐度前10 的物種。

圖9 GG 和GGH 酵解24 h 后屬水平物種分布的變化Fig.9 Changes of flora on the genus level after 24 h fermentation of GG and GGH

由圖9 可知，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組均顯著提高了乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐度（P＜0.05），GGH-2 和GGH-3 中乳桿菌屬占總種群的比例最大。乳桿菌屬是常見的益生菌，酵解后可產(chǎn)生乙酸、乳酸等酸類物質(zhì)，在健康機(jī)體的腸道中大量存在，不僅可以維持腸道正常生理功能，抑制病原菌生長(zhǎng)，而且具有降血壓、降血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能，有利于機(jī)體健康[24]。此外，實(shí)驗(yàn)組的梭菌屬（Clostridiumsensustricto1）均有所增加，其中GGH-1 組與其他處理組相比差異顯著，這與Fu 等[25]關(guān)于瓜爾膠及其不同分子量水解物體外酵解的研究結(jié)果一致。Clostridiumsensustricto1是厭氧菌，可以在厭氧條件下利用碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的鏈球菌屬（Streptococcus）均顯著降低（P＜0.05），這可能是導(dǎo)致厚壁菌門相對(duì)豐度降低的主要原因。鏈球菌屬中某些菌種對(duì)人致病，可引發(fā)化膿性炎癥，因此，鏈球菌屬降低是有益的。GG 和GGH-2 處理組的土孢桿菌屬（Terrisporobacter）顯著增加（P＜0.05），GGH-1 和GGH-3 處理組中的Terrisporobacter豐度較低。GG 酵解后腸桿菌屬豐度略減少，但效果不顯著，同時(shí)，志賀氏菌屬增加。GGH-1 處理組的志賀氏菌屬（EscherichiaShigella）相對(duì)降低，但腸桿菌屬和腸球菌屬顯著增加（P＜0.05）可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。

總體來說，添加GG 和不同分子量的GGH 可以不同程度地改變腸道菌群的組成，增加腸道有益菌，如乳桿菌屬和梭菌屬的相對(duì)豐度，抑制鏈球菌屬的增殖，其中，GGH-3 對(duì)腸道菌群組成的改善效果最好。添加不同分子量的GGH 均可促進(jìn)酵解體系中乳桿菌屬相對(duì)豐度的增加，其中，GGH-3 促進(jìn)乳桿菌屬增殖的效果最好，可能與其分子量較小有關(guān)。碳水化合物的分子量較大時(shí)，不易被腸道微生物利用，而當(dāng)其分子量降低時(shí)，微生物利用率提高，使得某些可以利用碳水化合物的菌種，如乳桿菌屬參與發(fā)酵，并產(chǎn)生SCFAs，降低酵解體系的pH 值，抑制某些對(duì)酸敏感的微生物的增殖，從而鞏固乳桿菌屬的優(yōu)勢(shì)地位，提高其相對(duì)豐度。李雄[26]通過研究不同分子量的脆江蘺低聚糖體外酵解特性發(fā)現(xiàn)，與分子量＞10 kDa 和介于5～10 kDa 的脆江蘺低聚糖相比，分子量＜5 kDa 的脆江蘺低聚糖更能促進(jìn)腸道有益菌相對(duì)豐度的增加。李煜[23]關(guān)于不同分子量魔芋甘露聚糖益生效果的研究結(jié)果表明，不同分子量的魔芋甘露聚糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群組成，在添加不同分子量魔芋甘露聚糖的酵解體系內(nèi)，乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著增加，而且魔芋甘露聚糖的分子量越低，促進(jìn)乳桿菌屬增殖的效果越好。

3 結(jié)論

以瓜爾膠為原料，通過酶解法得到了3 種不同分子量的GGH（GGH-1、GGH-2、GGH-3），采用豬結(jié)腸消化物構(gòu)建體外酵解模型，對(duì)GG 和3 種不同分子量GGH 的體外酵解特性進(jìn)行了研究，評(píng)估了其在體外酵解過程中對(duì)腸道菌群組成和比例的影響。結(jié)果表明：在酵解過程中，GG 和3 種GGH 的分子量逐漸降低，總糖含量隨酵解時(shí)間的延長(zhǎng)呈快速下降趨勢(shì)，還原糖含量先增加后減少。酵解體系的pH 值均顯著降低（P＜0.05），GGH-1 顯著促進(jìn)了總SCFAs、乙酸、丁酸的生成，GGH-3 顯著促進(jìn)了丙酸的生成。GG 和不同分子量的GGH 均提高了乳桿菌屬和梭菌屬的相對(duì)豐度，抑制鏈球菌屬的增長(zhǎng)，其中，GGH-3 對(duì)腸道菌群的影響最為顯著。后續(xù)可以進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其作為益生元進(jìn)行開發(fā)利用的潛力。