孔德興，徐永清，楊 燕，韓瑛琪，賀付蒙，王 雪，馮艷忠，劉 娣，李鳳蘭

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

向日葵列當(dāng)(Orobanchecumana)為列當(dāng)科列當(dāng)屬植物，別名毒根草、兔子拐棍[1]，屬于寄生性雙子葉一年生草本植物，全球范圍內(nèi)均有分布，是危害最嚴(yán)重的寄生性雜草之一。向日葵列當(dāng)寄生于向日葵，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，一直以來(lái)都被當(dāng)作雜草防治防控。但向日葵列當(dāng)與草蓯蓉(Boschniakiarossica)、肉蓯蓉(Cistanchedeserticola)等名貴中草藥在化學(xué)成分、藥理作用上有很多相似之處，同時(shí)又具有資源豐富、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此，向日葵列當(dāng)可以作為藥用資源植物進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

列當(dāng)科植物中主要含有苯乙醇苷類(lèi)化合物、環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物、木脂素及其苷類(lèi)等多種化學(xué)成分，具有較高的藥用價(jià)值[2-3]。趙夢(mèng)霞[4]對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)成分、抗氧化活性和抗菌活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，證實(shí)向日葵列當(dāng)中的正丁醇段具有很好的抗氧化活性，乙酸乙酯段和正丁醇段均有較好的抗菌活性。毛蕊花糖苷(acteoside)又名類(lèi)葉升麻苷，為典型的苯乙醇苷類(lèi)化合物，廣泛存在于植物界[5]。曲正義等[6-7]從向日葵列當(dāng)中分離提取出6種單體化合物，篩選出抗氧化活性較強(qiáng)的苯乙醇苷類(lèi)化合物，利用RP-HPLC測(cè)定發(fā)現(xiàn)向日葵列當(dāng)中黃藥苷(crenatoside)和毛蕊花糖苷的總含量達(dá)到藥材質(zhì)量的1%左右?？渍鞯萚8]通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝，提高了毛蕊花糖苷的提取效率。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，毛蕊花糖苷具有抗氧化、抗炎殺菌、保護(hù)神經(jīng)、抗腫瘤、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶、抗病原微生物和保護(hù)皮膚等多種功能[9-14]。

向日葵列當(dāng)?shù)募?xì)胞壁堅(jiān)硬，是提取其有效藥用成分的主要障礙，采取破壁法提取其有效成分是解決該障礙的有效策略之一。且中藥材細(xì)胞破壁后具有良好的吸收性、溶解性和化學(xué)活性等，解決了使用復(fù)雜、耗時(shí)等問(wèn)題，甚至個(gè)別中藥的藥效可提高4～5倍[15]。利用靈芝和釀酒酵母發(fā)酵物對(duì)油菜花粉壁進(jìn)行破壁的研究表明，發(fā)酵物中含有木質(zhì)素酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶等，靈芝和釀酒酵母發(fā)酵物對(duì)油菜花粉的破壁率可高達(dá)85.08%和 88.30%[16]。尚德靜等[17]利用食用菌生長(zhǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)生的纖維素酶、果膠酶、蛋白酶對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行生化處理，最終提高了植物細(xì)胞壁破壁率，使植物內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能更好釋放。

對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行破壁處理主要是降解細(xì)胞壁組分中的纖維素和木質(zhì)素。本研究對(duì)木質(zhì)素降解菌和纖維素降解菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，建立混合菌系并用于向日葵列當(dāng)?shù)陌l(fā)酵破壁，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)探索復(fù)合菌劑的最佳破壁酵解條件，同時(shí)通過(guò)測(cè)定對(duì)OH·自由基、DPPH自由基和超氧陰離子的清除活性，評(píng)價(jià)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷的體外抗氧化活性，以期獲得一種高效提取向日葵列當(dāng)藥用成分的方法體系，為提高該植物的應(yīng)用價(jià)值和資源合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物和菌種

向日葵列當(dāng)全草于2019年采自新疆阿勒泰向日葵種植地。產(chǎn)纖維素酶菌株有真菌雷斯青霉(Penicilliumraistricki)(S1)、產(chǎn)紅青霉(Penicil-liumrubens)(S2)和霉菌(Fungalsp.)(S3)，產(chǎn)木質(zhì)素酶菌株有白腐菌(Phanerochaetcchrysosporium)(S4)和黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)(S5)，以上菌株均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物資源與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 復(fù)合菌拮抗試驗(yàn)

將3株產(chǎn)纖維素酶和2株產(chǎn)木質(zhì)素酶的菌株分別組合接種到同一個(gè)PDA培養(yǎng)基平板中，觀察各培養(yǎng)基中的菌株生長(zhǎng)狀況，并觀察各菌株之間是否能生長(zhǎng)在一起，以及是否有明顯的分界線(xiàn)。能夠生長(zhǎng)在一起、無(wú)明顯分界線(xiàn)的菌株不具有拮抗性，可以復(fù)配進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；不能生長(zhǎng)在一起、有明顯分界線(xiàn)的菌株具有拮抗性，不進(jìn)行復(fù)配，應(yīng)單獨(dú)研究處理。

1.3 向日葵列當(dāng)藥用成分分析

1.3.1 向日葵列當(dāng)浸提膏的制備 向日葵列當(dāng)自然風(fēng)干后，粉碎過(guò)孔徑450 μm(40目)篩，室溫保存?zhèn)溆?。?0 g向日葵列當(dāng)粉末用10倍體積的90%(體積分?jǐn)?shù))乙醇振蕩浸提3次(20 ℃、140 r/min)，振蕩提取時(shí)間分別為72，48和24 h。合并3次浸提液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至15 mL，移裝至廣口瓶中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存、備用[18]。

1.3.2 GC-MS分析 通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)提取得到的向日葵列當(dāng)浸膏進(jìn)行組分分析鑒定。參考文獻(xiàn)[19]的方法設(shè)置參數(shù)：HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：起始溫度70 ℃，保持3 min；以5 ℃/min的升溫速率升至150 ℃，保持3 min；再以0.5 ℃/min的升溫速率升至154 ℃，保持2 min；最后以25 ℃/min的升溫速率升至240 ℃，保持4 min。GC-MS條件：電離能70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍(m/z)45～550。

1.4 向日葵列當(dāng)發(fā)酵用復(fù)合菌劑的篩選

分別用S4-S5、S4-S5-S2、S4-S5-S1和S4-S5-S1-S2組合成不同的復(fù)合菌劑對(duì)向日葵列當(dāng)進(jìn)行酵解，以未用任何菌酵解作為對(duì)照(CK),比較酵解液中毛蕊花糖苷含量，篩選適宜的發(fā)酵用復(fù)合菌劑。

1.5 毛蕊花糖苷酵解提取的單因素試驗(yàn)

預(yù)設(shè)酵解溫度40 ℃、pH值6、酵解時(shí)間2 d為單因素試驗(yàn)中的常規(guī)值，以不同酵解溫度(10，20，30，40和50 ℃)、pH值(5，6，7，8和9)和酵解時(shí)間(1，2，3，4和5 d) 3個(gè)單因素變量替換試驗(yàn)中的相應(yīng)常規(guī)值，測(cè)定向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷的含量，研究3個(gè)因素對(duì)毛蕊花糖苷提取效果的影響。

1.6 毛蕊花糖苷提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，選取酵解溫度(A)、酵解pH值(B)、酵解時(shí)間(C)為考察因素，以向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷含量(Y)為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)定3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)(表1)。

表1 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取工藝的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.7 酵解液中毛蕊花糖苷的HPLC檢測(cè)

各組發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)束后，將發(fā)酵液超聲(功率80 W)提取30 min后蒸干，用乙醇提取制成乙醇提取液，過(guò)孔徑0.22 μm有機(jī)溶劑濾膜，在高效液相色譜儀器上進(jìn)樣[20]。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動(dòng)相為乙腈/0.1%(體積分?jǐn)?shù))HAc水溶液，梯度洗脫(0～20 min，10%～20%乙腈；20～25 min，20%～30%乙腈)，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，柱溫為室溫(30 ℃)，進(jìn)樣量100 μL。

1.8 毛蕊花糖苷體外抗氧化活性的測(cè)定

采用梯度稀釋法將毛蕊花糖苷配制成0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg/mL的溶液，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，研究毛蕊花糖苷的體外抗氧化活性。

1.8.1 對(duì)OH·自由基的清除能力 將2 mL毛蕊花糖苷溶液加入到試管中，再加入2 mL FeSO4(2 mmol/L)和2 mL水楊酸(2 mmol/L)，充分混勻后加入2 mL H2O2(2 mmol/L)，在37 ℃水浴鍋中充分反應(yīng)30 min，冷卻至常溫，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。用蒸餾水代替H2O2溶液作為樣品背景，用蒸餾水代替毛蕊花糖苷溶液作為空白對(duì)照，計(jì)算OH·自由基清除率(D1)。

D1=[1-(As-As0)/A0]×100%。

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度值，As為毛蕊花糖苷的吸光度值，As0為樣品背景的吸光度值。

1.8.2 對(duì)DPPH自由基的清除能力 將2 mL毛蕊花糖苷溶液加入到試管中，再加入無(wú)水乙醇配制的2 mL DPPH(0.017 8 mmol/L)溶液，充分混勻后在室溫下避光反應(yīng)10 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值。用無(wú)水乙醇代替DPPH溶液作為樣品背景，用無(wú)水乙醇代替毛蕊花糖苷溶液作為空白對(duì)照，計(jì)算DPPH自由基清除率(D2)。

D2=[1-(A-As)/A0]×100%。

式中：A為毛蕊花糖苷的吸光度值，As為樣品背景的吸光度值，A0為空白對(duì)照的吸光度值。

1.8.3 對(duì)超氧陰離子的清除能力 在試管中分別加入4.5 mL Tris-HCl(50 mmol/L)緩沖液和1 mL 毛蕊花糖苷溶液，在37 ℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)25 min后加入0.5 mL鄰苯三酚(3 mmol/L)，迅速振蕩搖勻，加入到比色皿中，在325 nm波長(zhǎng)處每隔30 s測(cè)定吸光度值。用蒸餾水代替毛蕊花糖苷溶液作為空白對(duì)照，計(jì)算超氧陰離子自由基清除率(D3)。

D3=(ΔA0-ΔAs)/ΔA0×100%。

式中：ΔAs為毛蕊花糖苷的吸光度值，ΔA0為空白對(duì)照的吸光度值。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用3次生物學(xué)重復(fù)或3次技術(shù)重復(fù)的平均值，用Microsoft Excel分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪圖。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本進(jìn)行GraphPad Prism 5差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵解向日葵列當(dāng)?shù)膹?fù)合菌之間的拮抗作用

酵解向日葵列當(dāng)?shù)膹?fù)合菌間的拮抗結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.S3和S4菌株復(fù)配正面；B.S3和S4菌株復(fù)配背面；C.S3和S5菌株復(fù)配正面；D.S3和S5菌株復(fù)配背面；E.S4和S5菌株復(fù)配正面；F.S4和S1菌株復(fù)配正面；G.S5和S1菌株復(fù)配正面；H.S4和S2菌株復(fù)配正面；I.S5和S2菌株復(fù)配正面

如圖1所示，在5種菌株之間，霉菌(S3)與白腐菌(S4)、黃孢原毛平革菌(S5)(圖1-A-D)復(fù)配均產(chǎn)生抑菌圈，相互拮抗，不適合進(jìn)行混合復(fù)配；其余菌種復(fù)配均無(wú)分界線(xiàn)產(chǎn)生，菌絲混合生長(zhǎng)在一起，無(wú)拮抗現(xiàn)象，具有良好的兼容性。因此，真菌雷斯青霉(S1)、產(chǎn)紅青霉(S2)、白腐菌(S4)和黃孢原毛平革菌(S5)菌株可以建立復(fù)合菌系，可用于研究單獨(dú)菌株和混合菌株的降解效果。

2.2 向日葵列當(dāng)中的藥用成分

經(jīng)GC-MS全組分分析，從向日葵列當(dāng)濃縮浸膏中共檢測(cè)出207種化學(xué)物質(zhì),其中相對(duì)含量較高的40種組分見(jiàn)表2。

表2 向日葵列當(dāng)中相對(duì)含量居前40的組分信息

表2列出的40種組分中酸類(lèi)化合物有9種，酯類(lèi)化合物有9種，多醇類(lèi)化合物有2種，醛類(lèi)化合物有2種，烷烴類(lèi)化合物有3種，烯烴和炔烴類(lèi)化合物有2種，芳香烴類(lèi)化合物有6種，苯乙醇苷類(lèi)化合物有1種，萜類(lèi)化合物有1種，其他化合物有5種。除此之外檢測(cè)到具有藥效成分的5-羥甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural)、亞麻酸(Linoleic acid ethyl ester)、別香橙烯(Alloaromadendrene)、2-吡啶(2-Fluoropyridine)、3-正十七醇(3-Heptanecanol)、鄰苯二甲酸二壬酯(Dinonyl-phthalate)、原兒茶醛(Protocatechual-dehyde)和(Z)-8,11,12,Trihydroxy-9-ocatdecenoic acid等組分。通過(guò)化學(xué)文摘社CAS(Chemical Abstracts Service)登錄號(hào)查詢(xún)化學(xué)名稱(chēng)并結(jié)合峰圖出峰時(shí)間(圖2)發(fā)現(xiàn)，還檢測(cè)到重要藥效成分苯乙醇苷類(lèi)物質(zhì)毛蕊花糖苷。《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定名貴中藥材肉蓯蓉中主要藥效成分毛蕊花糖苷的總量不得少于0.3%，而向日葵列當(dāng)中其含量高達(dá)2.470%。

圖2 向日葵列當(dāng)全組分(A)和毛蕊花糖苷(B)的GC-MS分析

2.3 向日葵列當(dāng)發(fā)酵用復(fù)合菌劑的篩選

由圖3可以看出，經(jīng)復(fù)合菌S4-S5、S4-S5-S2、S4-S5-S1、S4-S5-S1-S2發(fā)酵后，毛蕊花糖苷含量分別為441，643，1 074和1 191 μg/mL，以S4-S5-S1、S4-S5-S1-S2復(fù)合菌劑破壁發(fā)酵向日葵列當(dāng)?shù)男Ч麨榧?。與CK相比，S4-S5-S1、S4-S5-S1-S2復(fù)合菌劑分別可將毛蕊花糖苷含量提升約2.44倍和2.70倍。組合菌劑S4-S5-S1-S2的效果與組合S4-S5-S1無(wú)顯著差異(P>0.05)，但組合S4-S5-S1以3種菌復(fù)合而成，成本和培養(yǎng)技術(shù)要求較低，因此該組合是向日葵列當(dāng)破壁發(fā)酵的最優(yōu)選擇。

CK.未用菌處理；EG1.復(fù)合菌S4-S5；EG2.復(fù)合菌S4-S5-S2；EG3.復(fù)合菌S4-S5-S1；EG4.復(fù)合菌S4-S5-S1-S2。

2.4 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 酵解溫度 如圖4-A所示，隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量呈先上升后逐漸下降的趨勢(shì)，在30 ℃左右時(shí)達(dá)最高，說(shuō)明酵解溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低提取效率。綜合比較確定向日葵列當(dāng)破壁發(fā)酵的響應(yīng)面試驗(yàn)溫度宜為20～40 ℃。

2.4.2 酵解pH值 由圖4-B可知，向日葵列當(dāng)中毛蕊花糖苷提取量隨著pH上升而升高， pH為7時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸下降。這是因?yàn)樵谧钸mpH范圍內(nèi)酶活性最大，酸性過(guò)大或堿性過(guò)大的環(huán)境都會(huì)降低酶活性。故酵解pH值應(yīng)在6～8。

2.4.3 酵解時(shí)間 由圖4-C可以看出，隨著酵解時(shí)間的延長(zhǎng)，向日葵列當(dāng)中毛蕊花糖苷提取量逐漸升高，酵解3 d左右達(dá)最大值，之后逐漸降低。故確定以酵解2～4 d進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖4 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷含量的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程的建立 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert V8.0.6軟件，以毛蕊花糖苷提取量為響應(yīng)值(Y)，以酵解溫度(A)、酵解pH值(B)和酵解時(shí)間(C)為自變量，進(jìn)行3因素3水平酵解條件響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到毛蕊花糖苷提取量對(duì)3因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=1 343.6-53.87A+5B+38.38C+1.75AB-25.5AC+10.25BC-96.1A2-21.855B2-48.1C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，該響應(yīng)面模型具有顯著性，回歸極顯著(P<0.000 1)，方程相關(guān)系數(shù)R2為0.976 7，校正決定系數(shù)Radj=0.949 6，說(shuō)明該模型與實(shí)際結(jié)果擬合良好，試驗(yàn)方法可靠；失擬項(xiàng)不顯著(P=0.122 7)，進(jìn)一步說(shuō)明該方程與實(shí)際結(jié)果擬合較好，可用于向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取的分析與計(jì)算；變異系數(shù)(1.35%)低，證明該模型可靠性高。從各項(xiàng) 的F值可以看出，影響向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量的因素依次為：A>C>B，即酵解溫度>酵解時(shí)間>酵解pH值。

表3 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

表4 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取回歸模型的方差分析

2.5.2 酵解溫度與酵解時(shí)間的交互作用 酵解溫度與酵解時(shí)間的交互作用對(duì)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量的影響結(jié)果如圖5所示，其等高線(xiàn)圖為橢圓形，說(shuō)明這兩個(gè)因素交互作用對(duì)結(jié)果的影響顯著；同時(shí)，從響應(yīng)面圖可以看出，毛蕊花糖苷提取量隨酵解溫度上升的幅度比酵解時(shí)間稍大，說(shuō)明酵解溫度對(duì)毛蕊花糖苷提取量的影響更強(qiáng)。毛蕊花糖苷提取量最大值出現(xiàn)在酵解溫度25～35 ℃、培養(yǎng)時(shí)間2.5～3.5 d時(shí)。

圖5 酵解溫度與酵解時(shí)間對(duì)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖

2.5.3 酵解溫度與酵解pH值的交互作用 酵解溫度與酵解pH值的交互作用對(duì)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量的影響結(jié)果如圖6所示，其等高線(xiàn)圖為橢圓形，說(shuō)明這兩個(gè)因素交互作用對(duì)結(jié)果的影響顯著；同時(shí)，從響應(yīng)面圖可以看出，毛蕊花糖苷提取量隨酵解溫度上升的幅度比酵解pH大，說(shuō)明酵解溫度對(duì)毛蕊花糖苷提取量的影響更強(qiáng)。毛蕊花糖苷提取量最大值出現(xiàn)在酵解溫度25～35 ℃、酵解pH值6.5～7.5時(shí)。

圖6 酵解溫度與酵解pH值對(duì)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖

2.5.4 酵解時(shí)間與酵解pH值的交互作用 酵解時(shí)間與酵解pH的交互作用對(duì)向日葵毛蕊花糖苷提取量的影響結(jié)果如圖7所示，其等高線(xiàn)圖為橢圓形，說(shuō)明這兩個(gè)因素交互作用對(duì)結(jié)果的影響顯著；同時(shí)，從響應(yīng)面圖可以看出，毛蕊花糖苷提取量隨酵解時(shí)間上升的幅度比酵解pH值稍大，說(shuō)明酵解時(shí)間對(duì)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量的影響更強(qiáng)。毛蕊花糖苷提取量最大值出現(xiàn)在酵解pH值為6.5～7.5、酵解時(shí)間在2.5～3.5 d時(shí)。

圖7 酵解時(shí)間與酵解pH值對(duì)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖

2.5.5 優(yōu)化工藝驗(yàn)證 由Design-Expert.V8.06 軟件求解回歸方程，得出毛蕊花糖苷提取量最大時(shí)的條件為：酵解溫度26.53 ℃，酵解pH值7.22，酵解時(shí)間3.52 d，此為復(fù)合菌劑對(duì)向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷的最佳提取條件。在此條件下，向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量預(yù)測(cè)值為1 383 μg/mL。綜合試驗(yàn)操作的可行性，調(diào)整提取條件為：酵解溫度 27 ℃，酵解pH值7，酵解時(shí)間3.5 d，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量為 1 396 μg/mL，與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明此酵解工藝可以有效提高向日葵列當(dāng)中毛蕊花糖苷的提取量。

2.6 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷的抗氧化活性

如圖8所示，向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷對(duì)OH·自由基、DPPH自由基和超氧陰離子的清除能力隨其質(zhì)量濃度的升高而不斷提高，但其均始終顯著低于同質(zhì)量濃度的Vc溶液(P<0.05)。此結(jié)果表明，毛蕊花糖苷有明顯的抗氧化活性且呈劑量依賴(lài)性。

圖8 向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷的抗氧化活性

3 討 論

田間雜草是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中管理成本升高、產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益受抑的主要因素之一，然而某些雜草因具有一定的藥用屬性可以作為中藥資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。對(duì)農(nóng)田雜草型藥用植物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、炮制方法等開(kāi)展研究，對(duì)于雜草的綜合治理和資源有效利用具有重要意義。

近年來(lái)，人們對(duì)肉蓯蓉過(guò)度采挖的現(xiàn)象頻發(fā)，加之土地沙漠化情況愈發(fā)嚴(yán)重，肉蓯蓉幾近滅絕，被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。而向日葵列當(dāng)中的苯乙醇苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、多糖類(lèi)等物質(zhì)與肉蓯蓉的成分十分接近，其中苯乙醇苷類(lèi)化合物具有抗菌、抗炎、增強(qiáng)記憶、保肝、強(qiáng)心等多種藥理作用[21]，且苯乙醇苷類(lèi)化合物具安全性、低毒性等特點(diǎn)，在開(kāi)發(fā)新藥上有重大意義，因此向日葵列當(dāng)具有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。本研究通過(guò)GC-MS技術(shù)，從向日葵列當(dāng)浸提膏中檢測(cè)到苯乙醇苷類(lèi)典型化合物毛蕊花糖苷，其含量高達(dá)2.470%，進(jìn)一步證明了將其開(kāi)發(fā)為中藥資源的潛力。

為了高效利用向日葵列當(dāng)，使其細(xì)胞中的藥用成分充分釋放，首先要將其堅(jiān)硬的細(xì)胞壁破除。向日葵列當(dāng)細(xì)胞壁主要由木質(zhì)素、纖維素等成分構(gòu)成，通過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)行破壁處理被認(rèn)為是簡(jiǎn)便有效的方法之一。畢京芳等[22]發(fā)現(xiàn)，在中藥藥渣中接入一定的微生物菌劑后，可以加快啟動(dòng)木質(zhì)素與纖維素的降解，其降解率分別比對(duì)照組提高了40.43%和26.14%。楊杭等[23]從中藥材中分離得到2株高效破壁菌株LSX-9和LSZ-1，破壁試驗(yàn)結(jié)果表明，它們不僅能縮短多糖和三萜的釋放時(shí)間，還能提高提取率。本試驗(yàn)利用產(chǎn)木質(zhì)素酶菌株和產(chǎn)纖維素酶菌株對(duì)向日葵列當(dāng)進(jìn)行酵解，發(fā)現(xiàn)不同組合的復(fù)合菌株對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)慕徒庾饔糜兴町?。其中S4-S5-S1-S2和S4-S5-S1組合的復(fù)合菌系對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)钠票谀芰^強(qiáng)，因后者是3種菌組成，因此更為適用。本研究結(jié)果表明，向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量的影響因素主次順序是酵解溫度>酵解時(shí)間>酵解pH值；酵解破壁的最佳條件為：酵解溫度27 ℃，酵解時(shí)間3.5 d，酵解pH值7，在此條件下向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷提取量為1 396 μg/mL，與理論值相差不大。

陳琳琳等[24]發(fā)現(xiàn)，西南貓尾木顆粒保健茶抗氧化能力可能與毛蕊花糖苷有關(guān)。本研究結(jié)果表明，向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷對(duì)OH·、DPPH自由基和超氧陰離子的清除能力不同，且抗氧化活性均比同質(zhì)量濃度的Vc弱，但在一定劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的抗氧化性能，說(shuō)明向日葵列當(dāng)毛蕊花糖苷具有抑制自由基生成的作用，可以作為自由基清除型抗氧化劑應(yīng)用。