李澤蓮,肖 蘭,江 玉,季維雪,陳 潁,楊媛媛,曹云霞

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)死亡率居婦科惡性腫瘤首位,晚期EOC患者5年生存率低于30%[1-2]。早期EOC無遠處播散轉(zhuǎn)移,且瘤體多較大;晚期EOC盡管已遠處播散轉(zhuǎn)移,但瘤體卻較小。EOC瘤體大小與腫瘤分期呈相反趨勢,且調(diào)控EOC生長的機制亦未知。YES相關(guān)蛋白(yes-associated protein, YAP)是Hippo信號通路下游效應(yīng)分子,研究[3-4]表明,Hippo-YAP/TAZ通路過度活化可使腫瘤細胞克服接觸抑制,強化其增殖能力。有研究[5]提示YAP蛋白在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等實體腫瘤中高表達。但YAP蛋白在EOC中表達及其作用仍有待研究。該研究從組織學(xué)水平檢測EOC及正常卵巢上皮組織中YAP蛋白表達并分析YAP蛋白表達與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系;從細胞學(xué)水平探討YAP對EOC細胞生長的調(diào)控作用,以期為EOC預(yù)后評估及治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與主要試劑 卵巢癌細胞株C13K及OV2008為本實驗室保存。RPMI-1640培養(yǎng)基及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自美國GIBGO公司;TRIzol試劑及Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green MasterMix購自日本TaKaRa公司;DAB顯色試劑及TritonX-100通透液均購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;鼠抗人Ki67單克隆抗體購自英國abcam公司;兔抗人YAP多克隆抗體購自美Santa Cruz公司;熒光抗鼠、抗兔二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Cell-LightTMEdU流式細胞儀檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司;靶向YAP1的siRNA-YAP1序列由上海吉瑪公司設(shè)計并合成。

1.1.2組織標本 選取2015年5月至2021年12月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療且經(jīng)病理學(xué)明確診斷的EOC患者120例,FIGO分期：Ⅰ+Ⅱ期38例,Ⅲ+Ⅳ期82例,同期良性腫瘤(子宮肌瘤)患者30例(取正常卵巢上皮)。EOC組患者納入標準為：① 病理明確診斷為EOC;② 排除自身免疫病及其他系統(tǒng)腫瘤;③ 術(shù)前均未接受新輔助化療、免疫及靶向治療;④ 手術(shù)行腫瘤分期或腫瘤減滅術(shù)。入選者均簽署知情同意書,并通過安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.3資料收集及隨訪統(tǒng)計患者的臨床資料 記錄患者的年齡、腫瘤分期、腹水量、病理類型、分化程度、腫瘤直徑及CA125水平。根據(jù)術(shù)中記錄的腫瘤病灶各個徑線大小,計算平均值即為腫瘤大小,參考已發(fā)表文獻證據(jù)[6],根據(jù)腫瘤大小將患者分為兩組：腫瘤大小≥10 cm,腫瘤大小<10 cm。

1.1.4隨訪門診及電話等方式進行隨訪 隨訪內(nèi)容為患者生存情況,隨訪時間截止2022年6月,中位隨訪時間42個月。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 腫瘤組織以及正常對照組標本采用福爾馬林固定,石蠟包埋,標本連續(xù)切片,切片厚4 μm,一抗YAP-D1(1 ∶500)孵育4℃過夜。次日,抗兔二抗(1 ∶2 000)37℃孵育30 min,沖洗,顯微鏡下加 DAB(5%)顯色,蘇木精復(fù)染。免疫組織化學(xué)結(jié)果中,細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為YAP蛋白表達陽性細胞,每例均隨機觀察10個高倍視野(×200),鏡下未觀察到陽性細胞為陰性(-),鏡下陽性細胞數(shù)<5%為弱陽性(1+),鏡下陽性細胞數(shù)5%～25%為陽性(2+),鏡陽性細胞數(shù)>25%為強陽性(3+)。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細胞 使用含10%小牛血清1640培養(yǎng)液,5% CO2濃度及37 ℃下孵育培養(yǎng),其中細胞匯合度為60%(低密度培養(yǎng)組)和90%(高密度培養(yǎng)組);分別取對數(shù)生長期低密度、高密度培養(yǎng)兩株細胞,棄上層培養(yǎng)液;各自轉(zhuǎn)染siRNA-YAP1及陰性siRNA(siRNA-NC)。具體操作按Lipofectamine 2000說明書進行,6 h后更換含10%小牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3細胞克隆實驗 高密度和低密度培養(yǎng)C13K及OV2008細胞,分別制備成低接種量(5×103/cm2)和高接種量(1×104/cm2)細胞懸液,以1 ml/孔將細胞接種于6孔板,繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼可見細胞集落時,吉姆薩染色,顯微鏡下觀察并計數(shù)(每孔隨機選取5個視野),實驗重復(fù)3次。

1.2.4免疫熒光檢測細胞Ki67表達 培養(yǎng)C13K及OV2008細胞至對數(shù)期,0.25%胰酶消化、分別以低接種量(5×103/cm2)和高接種量(1×104/cm2)接種于6孔培養(yǎng)板,放入蓋玻片。置于5% CO2濃度、37 ℃培養(yǎng)箱中進行細胞爬片,48 h取出蓋玻片,4 ℃預(yù)冷丙酮固定10 min,PBS洗5 min×3次。2.5 g/L的TritonX-100破膜5 min,PBS洗5 min×3次。加Ki67抗體(1 ∶100),4 ℃孵育過夜,PBS洗10 min×3次。加FITC標記的稀釋兔抗鼠IgG(1 ∶100),37 ℃避光孵育1 h,PBS洗10 min×3次,吸干PBS,加入抗熒光淬滅劑,熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.5qRT-PCR檢測YAP mRNA表達 TRIzol提取細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后按照SYBR Green Real-time PCR試劑盒說明書操作,ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。以U6為實驗內(nèi)參,PCR引物序列YAP上游5′-CGCTCTTCAACGCCGTCA-3′,下游5′-AGTACTGGCCTGTCGGGAGT-3′;U6上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,下游5′-CGAACGCTTCACGA-ATTTG-3′;條件： 95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃復(fù)性34 s,重復(fù)2、3步驟40個循環(huán),YAP表達水平采用2-ΔΔCt計算。

1.2.6Western blot檢測YAP蛋白水平 RIPA裂解液裂解細胞,BCA試劑盒定量,SDS-PAGE中行電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用封閉液封閉1 h,之后加入一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,用成像系統(tǒng)檢測印跡并拍照,使用Image J分析YAP蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 YAP表達與EOC臨床病理特征的關(guān)系如圖1所示,EOC組織胞質(zhì)及核中均有YAP陽性染色,為棕黃色染色,主要位于細胞核。正常卵巢上皮組織中YAP染色著色淡,主要位于細胞質(zhì)中,細胞核表達極低。EOC組織YAP陽性表達率(70.8%)高于正常卵巢上皮組織陽性表達率(23.3%)(P<0.05),腫瘤大小≥10 cm的EOC中 YAP核表達低于腫瘤大小<10 cm的EOC(P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ期EOC腫瘤平均直徑大于Ⅲ+Ⅳ期EOC(P<0.01)(表1)。臨床病理學(xué)分析提示：YAP核高表達與腫瘤大小(<10 cm)、腫瘤分期、組織學(xué)分化程度及CA125水平(>1 000 IU/ml)相關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、腹水以及病理類型的相關(guān)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表1 兩組EOC患者腫瘤大小比較

表2 YAP核表達與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 不同卵巢組織及不同腫瘤大小YAP表達比較 ×200

2.2 YAP核表達、臨床病理參數(shù)及EOC患者預(yù)后關(guān)系根據(jù)腫瘤直徑大小(≥10 cm或<10 cm)將120例EOC患者分為兩組進行隨訪。多因素回歸分析提示：YAP核高表達、FIGO分期、腹水≥1 000 ml、組織分化差、CA125≥1 000 IU/ml以及腫瘤大小<10 cm是EOC不良愈后的獨立因素(表3)。Kaplan-Meier法進一步分析顯示：YAP核低表達且腫瘤大小≥10 cm患者的3年生存率最高(79.1%),YAP核高表達且腫瘤大小<10 cm患者的3年生存率最低(28.7%),YAP核高表達且腫瘤大小≥10 cm及YAP核低表達且腫瘤大小<10 cm患者的3年生存率居中,約為51%(圖2)。以上結(jié)果提示腫瘤直徑較小(<10 cm)及YAP核高表達是EOC患者預(yù)后的獨立危險因素。

表3 多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響EOC患者總生存期的因素

圖2 不同YAP核表達和腫瘤大小的EOC患者生存曲線

2.3 卵巢癌細胞生長受細胞密度負調(diào)控與高密度組比較,低密度組C13K及OV2008細胞形成克隆數(shù)目增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示細胞在高密度時存在接觸抑制現(xiàn)象,高密度生長時細胞增殖受到抑制(P<0.01)(圖3)。

圖3 細胞培養(yǎng)密度對EOC細胞克隆形成的影響

2.4 高密度生長時細胞增殖受到抑制Ki67免疫熒光實驗結(jié)果表明,與低密度生長細胞相比,高密度C13K及OV2008細胞核中Ki67熒光表達下降,提示卵巢癌細胞的增殖能力在高密度生長下減弱(圖4)。

圖4 Ki67的免疫熒光表達 ×200

2.5 YAP在低密度和高密度EOC細胞中表達及YAP敲低效率檢測為探討YAP表達與細胞密度的關(guān)系,使用qRT-PCR檢測C13K及OV2008細胞中YAP mRNA的表達,結(jié)果提示：低密度生長的兩株細胞中YAP mRNA水平均高于高密度生長細胞(P<0.000 1)(圖5)。Western blot結(jié)果也表明低密度生長的細胞中YAP蛋白水平均高于高密度生長細胞(圖6)。

圖5 YAP mRNA在OV2008和C13K細胞中的表達

圖6 YAP蛋白在OV2008和C13K細胞中的表達

為進一步展示YAP蛋白對EOC細胞增殖的調(diào)控,運用靶向YAP的siRNA制備YAP瞬時敲低EOC細胞株,并使用qRT-PCR和Western blot檢測敲低效率,結(jié)果表明YAP mRNA和蛋白表達水平均顯著下降(圖5、6)。

2.6 YAP敲低能減弱EOC細胞的增殖能力為進一步研究YAP對EOC細胞增殖的影響,將2株EOC細胞按低密度和高密度接種后培養(yǎng)2 d并計數(shù)以比較YAP敲低前后細胞的增殖能力。結(jié)果表明,無論是C13K及OV2008細胞,YAP敲低組在低密度和高密度生長時增殖能力均下降,其中低密度生長時下降更為顯著(P<0.01)(圖7、8)。

圖7 YAP敲低前后OV2008細胞低密度和高密度生長時細胞增殖變化

圖8 YAP敲低前后C13K細胞低密度和高密度生長時細胞增殖變化

3 討論

在實體腫瘤如宮頸癌、乳腺癌、肝癌中,腫瘤大小多被用于臨床分期和患者預(yù)后評估,但基于EOC腫瘤大小來判斷腫瘤分期及預(yù)后仍存在較大爭議。Horvath et al[6]對110例EOC的研究發(fā)現(xiàn)早期EOC腫瘤體積大于晚期EOC。Paik et al[7]發(fā)現(xiàn)瘤體正常大小的晚期漿液性卵巢癌較之瘤體大者預(yù)后更差。一項小樣本臨床研究則認為晚期EOC的初始腫瘤負荷與接受完全性腫瘤細胞減滅術(shù)患者的預(yù)后相關(guān)[8]。但另一項對553例Ⅰ/Ⅲ期卵巢癌的研究表明Ⅲ期卵巢癌腫瘤體積大于I期,Ⅲ期卵巢癌患者預(yù)后不良與腹腔轉(zhuǎn)移灶大小相關(guān)[9]。鑒于腫瘤大小在EOC分期和預(yù)后評估中的爭議性結(jié)果,本研究針對120例EOC進行分析,包括38例Ⅰ/Ⅱ期EOC,82例Ⅲ/Ⅳ期EOC,顯示EOC早中期腫瘤體積大于晚期腫瘤體積(14.0 cmvs7.2 cm),且瘤體較小患者預(yù)后差于體積較大者。這提示早中期和晚期EOC發(fā)展可能是兩種不同模式,因此,有必要研究EOC瘤體大小的調(diào)控因素。

有研究[10-13]提示YAP是一種致癌因子,在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌以及血液系統(tǒng)腫瘤中均表達升高,其高表達與腫瘤增殖及遠處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本研究通過免疫組化方法研究EOC原發(fā)灶中YAP表達,顯示EOC組織中YAP核陽性率約70.8%,正常卵巢組織中YAP陽性率僅為23.3%。臨床病理資料分析顯示Ⅲ+Ⅳ期,腫瘤直徑<10 cm的EOC中YAP核表達高于Ⅰ+Ⅱ期,腫瘤直徑 ≥ 10 cm的EOC,表明YAP核高表達與EOC臨床分期呈正相關(guān),而與腫瘤大小呈負相關(guān)。120例EOC患者的生存分析結(jié)果則表明腫瘤體積較小(< 10 cm),YAP核高表達的EOC患者3年總生存率更低,提示這兩個變量可能是EOC患者的獨立危險因素。綜上,YAP在EOC組織的高表達,尤其YAP核高表達及腫瘤體積較小與EOC患者不良預(yù)后相關(guān)。

本實驗觀察到體積較小的EOC腫瘤組織中YAP核表達反而高于體積較大的腫瘤。同時,體外實驗中,低密度培養(yǎng)的C13K及OV2008細胞中YAP表達高于高密度培養(yǎng)細胞,且敲低CI3K和OV2008細胞中YAP表達可誘導(dǎo)細胞增殖阻滯,尤其在低密度培養(yǎng)的細胞中該現(xiàn)象更為明顯。這表明YAP可能參與調(diào)控EOC細胞的增殖。前期研究提示YAP對癌細胞增殖調(diào)控的作用與其胞內(nèi)定位有關(guān),Hoxha et al[14]研究發(fā)現(xiàn)低密度培養(yǎng)細胞中YAP/TAZ主要定位于細胞核,促進靶基因轉(zhuǎn)錄和細胞增殖。相反,高密度培養(yǎng)細胞中YAP/TAZ主要位于細胞質(zhì),參與生長抑制。因此推測,低密度培養(yǎng)EOC細胞可能通過調(diào)節(jié)某些細胞因子,使YAP發(fā)生核轉(zhuǎn)位而促進EOC細胞增殖,具體機制有待深究。

綜上所述,YAP核高表達及腫瘤大小是EOC患者的預(yù)后影響因素;細胞低密度培養(yǎng)誘導(dǎo)YAP表達上調(diào),進而促進細胞增殖,其機制可能與細胞低密度促進YAP核轉(zhuǎn)位,進而促進YAP下游靶基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。目前的研究涉及實驗樣本較少,隨訪時間相對較短,對相關(guān)作用機制的研究較為粗淺,后續(xù)還需進一步深入研究。