祁東梅 史慎奎 王玉芳 趙紅桃 崔素娟 王春芳

摘 要 SWI/SNF染色質(zhì)重塑因子在植物的生長發(fā)育及逆境應(yīng)答過程中起重要作用。本研究首先通過序列比對，從谷子基因組中鑒定出6個候選SiSWI3基因，分別命名為 SiSWI3A、 SiSWI3B、 SiSWI3C1、 SiSWI3C2、 SiSWI3D1和 SiSWI3D2。然后對上述基因的結(jié)構(gòu)、編碼蛋白、啟動子元件、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測，結(jié)果表明：SiSWI3蛋白都含有SANT Motif，且亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示SiSWI3成員主要被定位在細(xì)胞核中； SiSWI3基因啟動子區(qū)域含有大量與光響應(yīng)、激素類應(yīng)答、逆境應(yīng)答、代謝調(diào)控等相關(guān)的順式作用元件。最后采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測這些基因在谷子苗期鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)量變化，檢測結(jié)果表明：SiSWI3基因受鹽和干旱不同程度的誘導(dǎo)，說明SiSWI3基因參與谷子苗期鹽脅迫和干旱脅迫應(yīng)答。本研究所得結(jié)論為進(jìn)一步探究SiSWI3染色質(zhì)重塑因子在抗逆作物谷子的逆境響應(yīng)中的功能和機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 谷子；染色質(zhì)重塑；SiSWI3基因；鹽脅迫；干旱脅迫

谷子（Setaria italica L.）是起源于中國的重要糧食作物，具有生育周期短、植株矮小、單穗結(jié)實率高、基因組小等特點，被認(rèn)為是禾本科黍亞科C4模式植物，適合實驗室內(nèi)功能基因的研究[1]。谷子抗鹽抗干旱能力較強，能夠在邊際土地上種植，同時籽粒營養(yǎng)豐富，富含多種氨基酸，長期以來，谷子作為北方重要的制米作物，是養(yǎng)育華夏民族的哺育作物[2-4]。

染色質(zhì)重塑是指在基因組DNA序列不改變的前提下，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的現(xiàn)象[5]。根據(jù)傳統(tǒng)的分類方法，將染色質(zhì)重塑復(fù)體劃分為SWI/SNF（SWItching/Sucrose non-Fermenting）、ISWI（imitation SWI）、CHD（Chromotin organization modifier， Helicase， and DNA-binding Domains）和INO80（INOsitol requiring 80）4種類型[6-7]。SWI/SNF家族染色質(zhì)重塑復(fù)體由核心酶、SWI3亞基及其他附屬亞基組成[8-9]。SWI3染色質(zhì)重塑組分在植物生長發(fā)育過程中起重要作用：SWI3A和SWI3B參與擬南芥葉片和胚胎的發(fā)育[8，10]；SWI3B在ABA信號通路中作為正調(diào)節(jié)子，抑制種子的萌發(fā)和生長[11]；SWI3C和SWI3D參與葉片和花器官的形態(tài)建成及雌蕊發(fā)育[8，12]；SWI3D同源蛋白ZmCHB101參與玉米葉片和穗軸發(fā)育[13]。目前，染色質(zhì)重塑組分SWI3成員在谷子生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中的具體功能尚不清楚。

近年來，關(guān)于谷子抗逆的研究相繼被報道。在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)錄因子 SiANT1的表達(dá)受高鹽脅迫誘導(dǎo)[14]；在擬南芥中，異源表達(dá) SibZIP42和 SiREM6也表現(xiàn)出抗鹽表型[15-16]；在谷子中，轉(zhuǎn)錄因子 SiNF-YA1和 SiNF-YB8均與抗鹽和抗旱相關(guān)[17]。在干旱脅迫條件下，谷子自噬基因 SiATG8a和LIM基因家族成員 SiWLIM2b異源超表達(dá)使得干旱處理條件下的轉(zhuǎn)基因植株存活率高于野生型[18-19]，水稻中超表達(dá)谷子轉(zhuǎn)錄因子 SiMYB56，轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力明顯增強[20]。此外，利用遺傳轉(zhuǎn)化驗證基因功能的相關(guān)研究也陸續(xù)被報道。Argonaute（AGO1）屬于AGO蛋白家族，通過招募小RNAs調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，其在谷子中的缺失突變體 siago1b表現(xiàn)為葉片變窄變卷、花序變小、種子結(jié)實率降低且突變體經(jīng)干旱處理后，比野生型更容易萎蔫，這表明 SiAGO1b在抗旱中發(fā)揮功能[21]。在谷子抗旱機制上闡述比較清楚的是ABA依賴的信號通路，其中ABA響應(yīng)元件結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子SiAREB可以結(jié)合到SiARDP（ABA-responsive DRE-binding protein）基因啟動子區(qū)域，SiARDP超表達(dá)提高谷子的抗旱性[22]；SiARDP又可以結(jié)合到SiASR4 （ASR：abscisic acid-，stress-，and ripening-induced）和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白SiLTP基因啟動子區(qū)域，這兩個靶基因超表達(dá)后谷子抗旱能力均提高[23-24]。目前，谷子基因組測序已經(jīng)完成[25-26]，而谷子中ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合體成員在鹽和干旱脅迫下的響應(yīng)變化情況還沒有詳細(xì)的闡述。因此，探究SWI3染色質(zhì)重塑組分的分子機制及其在谷子對鹽和干旱逆境脅迫響應(yīng)中的作用，不僅具有重要理論意義，還對農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)實踐有重要指導(dǎo)意義。

本研究首先利用生物信息學(xué)分析方法，從谷子基因組中鑒定出與擬南芥同源的染色質(zhì)重塑組分SWI3家族成員，明確該家族基因的結(jié)構(gòu)特征，然后通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析該家族成員在鹽和干旱脅迫下的表達(dá)變化情況。本研究結(jié)果為探究染色質(zhì)重塑因子SWI3家族在谷子鹽和干旱應(yīng)答過程中的機制奠定基礎(chǔ)，并為谷子種質(zhì)資源的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用‘豫谷1號為試驗材料，種子由河北民族師范學(xué)院生物與食品科學(xué)學(xué)院分子實驗室提供。在玻璃平皿中放一張濾紙，浸濕，把‘豫谷1號種子灑在濾紙上，然后將玻璃平皿放在光培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行種子萌發(fā)，光照周期16 h光照/8 h黑暗，萌發(fā)溫度（25±2）? ℃，濕度60%。

1.2 試驗設(shè)計

待谷子根的長度達(dá)到1～2 cm后移到水培盒中，培養(yǎng)箱光周期設(shè)置16 h光照/8 h黑暗，溫度25 ℃±2 ℃，濕度60%，用Hogland培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至三葉一心期。分別采用150 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，10%、15%、20% PEG-6000進(jìn)行模擬干旱處理，在處理的0、2、6和12 h節(jié)點取樣，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。取樣后立即將全苗置于液氮中，冷卻后置于-80 ℃保存，準(zhǔn)備提取RNA。

1.3 試驗試劑

試驗所用RNA提取試劑盒RNA-easy Isolation Reagent、去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hiscript ⅢRT SuperMix for qPCR （＋gDNA wiper）和Real-time PCR所用到的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，引物由上海生工生物有限公司合成，其他常規(guī)試劑購自生工生物有限公司。

1.4 基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

通過將本研究獲得谷子基因序列與已知的擬南芥和水稻SWI3家族成員基因序列在Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）網(wǎng)站上進(jìn)行BlastP比對，獲得具有完整閱讀框的谷子同源序列，從中得到谷子中SWI3家族成員信息，并在Phytozome網(wǎng)站獲得各基因檢索號、基因組序列長度、CDS長度、內(nèi)含子個數(shù)和氨基酸數(shù)目等信息。

1.5 RNA提取

RNA提取按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。所用引物由OMIGA 2.0設(shè)計，引物序列信息見表1。

1.6 反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR分析

反轉(zhuǎn)錄過程按試劑盒說明書進(jìn)行，每個樣品先去除基因組DNA，反應(yīng)體系16 μL：4×g DNA wiper Mix 4 μL，模板RNA 500 ng，RNase-Free H2O補齊至16 μL，42 ℃ 反應(yīng)2 min后，再加入5×HiScript III qRT SuperMix 4 μL組成反轉(zhuǎn)錄體系的20 μL，反應(yīng)條件37 ℃，15 min，85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA均一化后作為Real-time PCR的模板。以谷子GADPH為內(nèi)參基因。定量反應(yīng)體系為10? μL 2×SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL下游引物（10 μmol/L），cDNA模板2 μL，無菌水7.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個處理3個重復(fù)，采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達(dá)量，采用Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1SiSWI3基因基本信息及結(jié)構(gòu)分析

通過序列分析和比對，在谷子中鑒定得到SWI3染色重塑組分，包括6個成員，分別命名為 SiSWI3A、 SiSWI3B、 SiSWI3C1、 SiSWI3C2、 SiSWI3D1和 SiSWI3D2。各成員的理化性質(zhì)及基因的基本信息如表2所示，基因長度為4 056～8 241 bp，CDS長度為1 494～2 748 bp，氨基酸數(shù)目497～915，成員的分子質(zhì)量為54 169.96～ ?99 805.16 u，蛋白質(zhì)等電點為4.94～ ?6.50。此外， SiSWI3A、 SiSWI3B、 SiSWI3C1、 SiSWI3C2、 SiSWI3D1、 SiSWI3D2分別含有6、5、8、8、7、6個內(nèi)含子（圖1）。

2.2 SiSWI3蛋白結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析

使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）在線分析工具對谷子SiSWI3家族成員蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，6個成員都存在比較保守的SANT結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)為DNA結(jié)合域。此外， SiSWI3C1、 SiSWI3D1、SiSWI3D2還存在ZnF_ZZ結(jié)構(gòu)域（圖2）。利用Softberry（http：//www.softberry.com/）網(wǎng)頁在線工具預(yù)測SiSWI3家族成員蛋白亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，谷子SWI3在細(xì)胞核中的定位結(jié)果積分值遠(yuǎn)高于在其他組織中定位積分值，在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體積分值為零，因此谷子SWI3蛋白可能主要在細(xì)胞核中表達(dá)（表3）。

2.3SiSWI3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為進(jìn)一步了解谷子SWI3基因家族譜系及其功能特點、進(jìn)化過程，對高粱、水稻、玉米、擬南芥、谷子SWI3基因共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹將其分為3大類，谷子SWI3蛋白不均勻地分布在3大類當(dāng)中。其中谷子SiSWI3C1與SiSWI3C2親緣關(guān)系最近，與其他4個物種的SWI3聚為一大類，并且在這一大類中谷子SiSWI3A與玉米LOC100285161的親緣關(guān)系最近；SiSWI3D2與SiSWI3D1同屬一大類，且谷子SiSWI3D2與水稻LOCOs04g01970的親緣關(guān)系最近；谷子SiSWI3B與高粱LOC8082888和玉米LOC100273414聚合在一起，說明它們親緣關(guān)系較近（同屬禾本科C4植物），另一方面也暗示它們的功能具有某些相似性。

2.4 SiSWI3基因啟動子調(diào)控元件功能分析

利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析軟件對上述SWI3染色質(zhì)重塑成員的基因啟動子進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，每個基因啟動子選取長度定為2.0 kb。結(jié)果如表4所示，各基因的啟動子區(qū)存在多個順式作用原件，包括大量的光響應(yīng)元件、激素類響應(yīng)元件（脫落酸、赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯、生長素）、逆境應(yīng)答元件（干旱、低溫、逆境防御）、對基因轉(zhuǎn)錄起始起重要作用的CAAT box和TATA-box以及其他調(diào)控生長的相關(guān)順式作用元件，包括分生組織特異性表達(dá)、胚乳特異性調(diào)控、生物鐘調(diào)控、玉米蛋白代謝調(diào)控、缺氧和厭氧誘導(dǎo)元件等。

2.5SiSWI3基因在苗期鹽脅迫下表達(dá)分析

為探究SiSWI3基因成員是否響應(yīng)鹽脅迫，對‘豫谷1號的幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理，然后通過實時熒光定量PCR對SiSWI3基因的表達(dá)量變化情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。在150? ?mmol/L NaCl脅迫條件下， SiSWI3A在處理 ?12 h后表達(dá)量明顯增加， SiSWI3C1、 SiSWI3D1在處理6 h后表達(dá)量明顯增加， SiSWI3B、 SiSWI3C2表達(dá)量沒有明顯變化。在200? ?mmol/L NaCl處理脅迫條件下，基因表達(dá)出現(xiàn)受抑制的情況，主要表現(xiàn)為： SiSWI3A在處理2 h后表達(dá)量明顯降低，在12 h后又增加； SiSWI3B在處理2 h和6 h后表達(dá)量都降低，在12 h后又明顯增加； SiSWI3C1、 SiSWI3C2在處理2 h和 ?6 h后表達(dá)量都明顯降低； SiSWI3D1表達(dá)量沒有明顯變化。在250 mmol/L NaCl處理脅迫條件下， SiSWI3A、 SiSWI3C1、 SiSWI3C2、表達(dá)量沒有明顯變化， SiSWI3B在處理6 h后表達(dá)量明顯增加， SiSWI3D1在處理2 h和12 h表達(dá)量明顯增加。上述結(jié)果表明，SiSWI3家族基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)，該家族成員參與了鹽脅迫的響應(yīng)。

2.6 SiSWI3基因在苗期干旱脅迫下表達(dá)分析

為探究SiSWI3基因成員是否響應(yīng)干旱脅迫，對‘豫谷1號的幼苗進(jìn)行模擬干旱處理后通過實時熒光定量PCR對SiSWI3基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在10% PEG-6000處理條件下， SiSWI3A和 SiSWI3B[QX）〗經(jīng)脅迫處理6 h后基因表達(dá)量升高，但 SiSWI3C1和 SiSWI3C2表達(dá)量降低。在15% PEG-6000處理條件下， SiSWI3A、 SiSWI3B與 SiSWI3C2表達(dá)量沒有明顯變化， SiSWI3C1的表達(dá)量隨著時間增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但差異并不顯著； SiSWI3D1的表達(dá)量在處理后2 h升高、6 h降低，表明基因受干旱誘導(dǎo)后其表達(dá)又受到抑制。在20% PEG-6000處理條件下， SiSWI3A在干旱處理6 h后基因表達(dá)量升高， SiSWI3B與 SiSWI3C1表達(dá)量沒有明顯變化， SiSWI3C2的表達(dá)量有上升的趨勢，但是差異并不顯著， SiSWI3D1的表達(dá)量在干旱處理2 h后降低。上述結(jié)果表明，SiSWI3家族成員在不同程度上受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，暗示其參與了谷子苗期干旱脅迫響應(yīng)并在谷子苗期干旱響應(yīng)通路中發(fā)揮重要 ?作用。

3 結(jié)論與討論

本研究通過比對分析在谷子基因組中得到6個SWI3基因，并對6個基因生物信息學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的預(yù)測和分析。預(yù)測結(jié)果顯示，SiSWI3家族成員的亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞核，因為該家族屬于染色質(zhì)重塑組分，其功能的發(fā)揮離不開染色質(zhì)，而染色質(zhì)作為遺傳物質(zhì)的主要載體就存在于細(xì)胞核中，因此SiSWI3成員的性狀和參數(shù)非常接近。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，谷子成員與玉米、水稻、高粱親緣關(guān)系較近，與擬南芥相對較遠(yuǎn)。順式元件分析表明，在SiSWI3基因啟動子區(qū)域含有很多順式作用元件，包括光周期響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、生長代謝調(diào)控元件、逆境脅迫響應(yīng)元件等，這些元件的存在暗示著這些基因很可能參與到相應(yīng)的信號通路調(diào)控過程中[27]，例如ABA在非生物脅迫（干旱、鹽、高溫、低溫等）響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)ABA水平升高[28-30]，因此推測SiSWI3基因很可能參與植物對非生物逆境脅迫的響應(yīng)過程。

Real-time PCR檢測結(jié)果表明，5個SiSWI3基因在兩種處理下呈現(xiàn)不同程度的差異性表達(dá)，這暗示著谷子SiSWI3基因參與了植物苗期鹽脅迫和干旱脅迫的響應(yīng)過程。結(jié)果顯示，SiSWI3家族基因在每個鹽濃度中均有基因呈現(xiàn)差異性表達(dá)變化，在150 mmol/L鹽脅迫下， SiSWI3A、 SiSWI3C1、 SiSWI3D1均表現(xiàn)為受鹽誘導(dǎo)表達(dá)量在不同時間點上調(diào)；在200 mmol/L鹽脅迫下， SiSWI3A、 SiSWI3B、 SiSWI3C1、 SiSWI3C2的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低又增加的趨勢；在250 mmol/L鹽脅迫下， SiSWI3B和 SiSWI3D1表現(xiàn)為受鹽誘導(dǎo)表達(dá)量增加。可見隨著鹽濃度增加，基因的響應(yīng)程度發(fā)生變化，響應(yīng)的基因在各梯度也有所不同，推測原因一是各基因家族成員的表達(dá)模式可能不盡相同；二是基因的表達(dá)調(diào)控非常復(fù)雜，植物體內(nèi)外兩方面因素都能對基因表達(dá)產(chǎn)生影響，使不同濃度下基因調(diào)控通路有差異而導(dǎo)致各基因的響應(yīng)模式不同。

與鹽脅迫下SiSWI3基因的表達(dá)模式相比，干旱脅迫下該家族基因的表達(dá)情況相對簡單。在 SiSWI3A、 SiSWI3B干旱脅迫誘導(dǎo)試驗中，10% PEG-6000的濃度下處理6 h，二者表達(dá)量均增加，并且 SiSWI3A在20% PEG-6000處理6 h時表達(dá)量也增加，并呈現(xiàn)顯著性差異； SiSWI3C1、 SiSWI3C2在10% PEG-6000的濃度下處理12 h后表達(dá)量下降； SiSWI3D1在10% PEG-6000處理時表達(dá)量沒有明顯變化，在15%和20% PEG-6000處理時分別呈現(xiàn)出先增加后降低以及先降低后增加的趨勢。這5個基因在干旱脅迫下的3種表達(dá)情況說明SiSWI3家族基因的表達(dá)模式不相同。此外， SiSWI3D1在不同濃度PEG-6000下的表達(dá)量變化可能是由于外界條件誘導(dǎo)下內(nèi)源激素或者信號通路調(diào)節(jié)機制不同。

綜上所述，研究初步表明谷子SiSWI3基因受鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)，可能參與谷子對逆境脅迫的應(yīng)答過程，雖然這些結(jié)論與分析還需要進(jìn)一步證實，但為探究染色質(zhì)重塑因子SiSWI3成員在非生物逆境下的表達(dá)特性提供了線索，為進(jìn)一步闡明 SiSWI3基因在谷子逆境應(yīng)答中的功能和機制提供了試驗依據(jù)。

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Identification of? SWI3 Genes from Foxtail Millet （Setaria italica? L.） and Its Expression Analysis under Salt and Drought Stresses

Abstract SWI/SNF chromatin remodeling factors play important rolesin plant development and stress response. In this study，six candidate SWI3 genes were identified，namely SiSWI3A，SiSWI3B，SiSWI3C1，SiSWI3C2，SiSWI3D1，SiSWI3D2 from foxtail millet （Setaria italica L.） genome through sequence alignment.Bioinformatics methods were used to analyze the gene structure，protein，promoter sequence，and subcellular localization.The result showed that all six genes contained the conserved characteristic domains of SANT Motif，besides subcellular localization predictions showed that SiSWI3 members were mainly localized in nucleus. cis-elements analysis revealed that light，hormonal，stress，metabolism regulation and other related cis-elements were presented in the promoter region of the SiSWI3 genes. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression levels of SiSWI3 genes under different stresses at seedling stage，including salt and drought stress at last. Stress expression analysis showed that the expression levels of SiSWI3 genes were induced under the salt and drought stresses，indicating that five SiSWI3 genes involved in salt and drought stress response at the seedling stage. This study lays a foundation for further research on the function and mechanisms of SiSWI3 chromatin remodeling factors in the stress response of millet.

Key words Foxtail millet; Chromatin remodeling; SiSWI3 gene; Salt stress; Drought stress