馬蕊 張衛(wèi)紅 郭陽陽

摘 要 旨在通過高通量測(cè)序技術(shù)獲得赤琥珀螺（Succinea erythrophana）線粒體基因組全序列，對(duì)其結(jié)構(gòu)及組成特征進(jìn)行分析，并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的琥珀螺科及柄眼目物種序列，以最大似然法和貝葉斯法分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示：①赤琥珀螺線粒體基因組全長(zhǎng)? 14 023 bp（GenBank No.ON533899），由37個(gè)基因和一段富含AT的非編碼控制區(qū)組成，有20處基因間隔，13處基因重疊。A＋T平均含量為77.3%，表現(xiàn)出明顯的AT偏向性?；虻呐帕许樞颉⒔Y(jié)構(gòu)與組成、密碼子使用情況與琥珀螺科已報(bào)道種類相似。? ②除tRNA-Phe、tRNA-His、tRNA-Ser1、tRNA-Ser2外，其余? tRNAs呈典型三葉草結(jié)構(gòu)。③Ka/Ks選擇壓力分析顯示其受到純化選擇作用。④系統(tǒng)發(fā)育研究揭示赤琥珀螺與同屬的腐敗琥珀螺（Succinea putris）親緣關(guān)系最近，然后與同科其他物種形成姐妹群關(guān)系。

關(guān)鍵詞 赤琥珀螺；琥珀螺科；線粒體基因組；系統(tǒng)發(fā)育

線粒體基因組是動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育研究中廣泛使用的分子標(biāo)記[1]。這主要得益于其分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、具有較高的進(jìn)化速率、母系遺傳、重組率低和拷貝數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。近年來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的下降，對(duì)線粒體基因組的研究報(bào)道大量增加，但不同動(dòng)物類群的研究存在一定差異，對(duì)無脊椎動(dòng)物的關(guān)注明顯少于脊椎動(dòng)物。

琥珀螺科（Succineidae）是軟體動(dòng)物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、柄眼目（Stylommatophora）的主要類群[4]。該科物種形態(tài)多樣，大多數(shù)種類水陸兩棲，其中一些種類危害棉、麻、糧、蔬菜等農(nóng)作物和園藝花卉，有些是家畜、家禽及野生動(dòng)物寄生吸蟲、線蟲的中間宿主，而另有一些種類其軟體和貝殼均可入藥，因而琥珀螺科與人類關(guān)系十分密切[5]。但對(duì)琥珀螺科的研究多集中在形態(tài)方面，線粒體基因組研究十分有限，目前僅有腐敗琥珀螺（Succinea putris）[6]、五家渠尖緣螺（Oxyloma wujiaquensis）[7]和Omalonyx unguis[8]共3個(gè)物種的線粒體基因組被報(bào)道。

赤琥珀螺（Succinea erythrophana Ancey，1883）是琥珀螺科中的小型種類，為中國(guó)特有種，在吉林、北京、河北、山西、陜西、新疆和長(zhǎng)江中下游及其以南的兩廣地區(qū)廣泛分布[9]。赤琥珀螺也是傳統(tǒng)中藥，中藥名為緣桑螺，主治小兒驚風(fēng)，痔瘡，脫肛等癥（中藥大辭典，中華本草）。目前對(duì)赤琥珀螺的研究?jī)H見貝殼形態(tài)和分布地的簡(jiǎn)單記述[10]，本試驗(yàn)將對(duì)其進(jìn)行線粒體全基因組測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，以期為該物種的系統(tǒng)進(jìn)化及保護(hù)利用提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

赤琥珀螺標(biāo)本于2013年8月11日采自新疆伊犁察布查爾縣烏孫山公路邊及山坡松林地? （43°28′N，81°06′E），海拔2 106 m，采集人張衛(wèi)紅等。標(biāo)本鑒定由李成有和張衛(wèi)紅依據(jù)其形態(tài)解剖特征完成[11]，現(xiàn)保存于新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（標(biāo)本號(hào)：XJU S13029）。

1.2 DNA提取

選取一只成體赤琥珀螺，剪取腹足肌肉約? 30 mg，使用天根公司DNA組織提取試劑盒提取總DNA。提取結(jié)果經(jīng)檢測(cè)合格后（DNA質(zhì)量濃度超過100 ng/μL）送上海天昊生物有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 線粒體基因組測(cè)序及組裝

利用二代高通量測(cè)序技術(shù)（Illumina Hiseq平臺(tái)）對(duì)赤琥珀螺線粒體全基因組測(cè)序。對(duì)下機(jī)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，低質(zhì)量讀段、N率較高序列及測(cè)序接頭序列等被過濾。質(zhì)控后的contigs以同屬物種腐敗琥珀螺（GenBank No. JN627206）作為參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，將雙端數(shù)據(jù)輸入MetaSPAdes中進(jìn)行組裝。使用ORF finder在線分析確定蛋白質(zhì)編碼基因的邊界，使用? tRNAscan預(yù)測(cè)tRNA的位置及其二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過MITOS在線服務(wù)[12]進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能注釋，并在Geneious R11軟件[13]中對(duì)注釋結(jié)果手動(dòng)校正。拼接組裝后的序列使用OGDRAW在線平臺(tái)[14]繪制基因結(jié)構(gòu)圖。最后，將赤琥珀螺線粒體全基因組數(shù)據(jù)提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank登錄號(hào)為ON533899。

1.4 基因組序列分析

使用Geneious R11軟件統(tǒng)計(jì)堿基組成情況；在CodonW v1.4.2軟件中統(tǒng)計(jì)密碼子偏向性及使用情況；通過DnaSP v.5.10軟件[15]計(jì)算每個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因同義替換（Ks）和非同義替換（Ka）概率，Ka/Ks大于1、等于1和小于1分別表示受到正選擇、中性進(jìn)化和純化選擇作用[16]。對(duì)線粒體基因組鏈的非對(duì)稱性（strand asymmetry），即兩條鏈的組成偏差利用公式AT shew=（A-T）/（A+T）和GC shew=（G-C）/（G+C）分別進(jìn)行計(jì)算。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于柄眼目不同類群具代表性的14個(gè)物種（表1）的線粒體蛋白質(zhì)編碼基因，以新腹足目塔螺科物種Lophiotoma cerithiformis作為外群，使用貝葉斯法（Bayesian analysis，BI）和最大似然法（Maximum likelihood methods，ML）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（表1）。其中，蛋白質(zhì)編碼基因使用PhyloSuite v1.2.2軟件[17]提取串聯(lián)。BI樹使用MrBayes v3.2.6軟件[18]生成，馬爾可夫鏈蒙特卡洛分析運(yùn)行100萬代，每1 000代抽樣保存1個(gè)樣本，前25% burnin；ML樹使用IQ-TREE v.1.6.8軟件構(gòu)建，建樹模型選用GTR+F+G，自舉檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)定為1 000次。使用iTOL在線程序[19]對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組結(jié)構(gòu)及組成

赤琥珀螺線粒體基因組為典型環(huán)狀閉合雙鏈結(jié)構(gòu)（圖1），全長(zhǎng)14 023 bp，由37個(gè)基因組成，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼（Protein coding genes，PCGs）基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因以及1個(gè)富含AT的非編碼區(qū)。A、T、C、G平均含量為33.5%、43.8%、10.6%和12.0%，其中? A＋T含量為77.3%，存在明顯的AT偏向性。37個(gè)基因中22個(gè)位于正鏈，包括9個(gè)PCGs，12個(gè)tRNAs和1個(gè)rRNA基因；15個(gè)位于負(fù)鏈，包括4個(gè)PCGs，10個(gè)tRNAs和1個(gè)rRNA基因。存在基因間隔20處，基因重疊13處（表2）。

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

赤琥珀螺13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因長(zhǎng)度在117 bp（ ATP8）到1 680 bp（ NAD5），總長(zhǎng)? 10 753 bp，AT含量為76.7%，AT偏斜（AT shew）為? -0.16，GC偏斜（CG shew）為0.07。13個(gè)PCGs中，12個(gè)基因以ATN作為起始密碼子，只有CYTB 基因以TTG起始；11個(gè)基因以TAA為終止密碼子，只有 NAD1和CYTB基因以TAG終止。

13個(gè)PCGs共編碼3 666個(gè)氨基酸，使用頻率較高的密碼子為UUU（Phe）、UUA（Leu）和AUU（Ile），總體偏向于使用第3位為A或T（U）的密碼子（圖2）。

2.3 選擇壓力分析

赤琥珀螺線粒體基因組中所有PCGs的Ka/Ks值均小于1（圖3），即非同義突變的頻率少于同義突變，表明整體受到純化選擇作用。在13個(gè)PCGs中，ATP8、NAD2基因的Ka/Ks值相對(duì)較高（分別為0.392 8和0.387 9），表明它們受到較小的選擇壓力，而COX1的Ka/Ks值最小? （0.053 4），表明其受到的選擇壓力最大。

2.4 tRNA和rRNA基因

赤琥珀螺tRNAs基因總長(zhǎng)為1 422 bp。除tRNA-Phe、tRNA-His、tRNA-Ser1、tRNA-Ser2外，其他18個(gè)tRNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)均為典型三葉草結(jié)構(gòu)（圖4）。其中，tRNA-Phe和tRNA-His均缺少TΨC臂，額外環(huán)較長(zhǎng)，氨基酸臂中出現(xiàn)了錯(cuò)配；tRNA-Ser1和tRNA-Ser2均缺少DHU臂，其中，tRNA-Ser1基因在原本的DHU臂處出現(xiàn)了1個(gè)8 bp的小莖環(huán)結(jié)構(gòu)，額外環(huán)較長(zhǎng)，氨基酸臂中出現(xiàn)兩對(duì)錯(cuò)配。

對(duì)于rRNA基因，16S rRNA位于tRNA-Val和tRNA-Pro之間，長(zhǎng)度為931 bp；12S rRNA位于tRNA-Glu和tRNA-Met之間，長(zhǎng)度為764 bp。

2.5 控制區(qū)

赤琥珀螺線粒體基因組控制區(qū)與腐敗琥珀螺及Omalonyx unguis位置一樣，均位于COX3與tRNA-Ile基因之間，其中，前者控制區(qū)長(zhǎng)度為? 45 bp，后兩者均為50 bp，但與同在新疆分布的五家渠尖緣螺有所不同，五家渠尖緣螺的控制區(qū)位于COX1和tRNA-Val基因之間，長(zhǎng)度為42 bp。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于線粒體基因組13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，故此處選取其中一種作為展示（圖5）。結(jié)果顯示柄眼目呈單系，“non-achatinoid”類群與“achatinoid”類群被分開，其中“achatinoid”類群僅由Achatina fulica作為代表。琥珀螺科（Succineidae）也為單系，與旋蝸?？偪疲℉elicoidea）和尾刺螺總科（Urocoptoidea）聚成的支系互為姐妹群關(guān)系。琥珀螺科中赤琥珀螺與同屬的腐敗琥珀螺親緣關(guān)系最近。

3 討論與結(jié)論

本研究測(cè)定了采集自新疆的陸生貝類物種赤琥珀螺的線粒體基因組序列，全長(zhǎng)為14 023 bp，該長(zhǎng)度處于琥珀螺科已發(fā)表物種的線粒體基因組大小范圍內(nèi)（13 984～14 092? bp，見表1）。呈共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，包含37個(gè)典型編碼基因和1個(gè)控制區(qū)。其線粒體全基因組展現(xiàn)明顯的AT偏向性，符合柄眼目動(dòng)物類群相關(guān)特征[21]。鏈的非對(duì)稱性研究揭示赤琥珀螺在整個(gè)正鏈上有鏈的不對(duì)稱性逆轉(zhuǎn)，即T的含量高于A，G的含量高于C（AT skew為－0.16，GC skew為0.07），與腹足綱大部分種類相似[31]。

赤琥珀螺PCGs結(jié)構(gòu)及排列與同科已報(bào)道物種一致[6-8]。其中，最長(zhǎng)的基因?yàn)?NAD5（1 680 bp），最短的為 ATP8（117 bp），亦與腹足綱物種情況一致[32]。密碼子使用情況顯示偏向于使用第3位為A或T（U）的密碼子，與Guzmán等對(duì)Omalonyx unguis的研究結(jié)果一致[8]。對(duì)選擇壓力的研究發(fā)現(xiàn)，13個(gè)PCGs的Ka/Ks比值均小于1，表明受到純化選擇作用，但不同基因受選擇強(qiáng)度并不相同： ATP8和 NAD2基因受選擇壓力較小，因而有利于它們進(jìn)化速率加快；相比較而言，COX1基因受選擇壓力較大，因而相對(duì)于其他基因可能更為保守，這與通常認(rèn)為的COX1可作為DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定的觀點(diǎn)相一致[33]。

赤琥珀螺rRNAs的基因位置及長(zhǎng)度與琥珀螺科已報(bào)道物種相似，但tRNAs基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)則有所不同。這與通常認(rèn)為的線粒體基因組中基因排列順序和結(jié)構(gòu)是可變的[34]，且tRNA的位置變動(dòng)要比rRNA以及蛋白質(zhì)編碼基因更為常見的觀點(diǎn)相一致[35]。本研究中，赤琥珀螺的tRNA-Ser1基因在原本DHU臂處出現(xiàn)了1個(gè)8 bp的小莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而同科已報(bào)道的3個(gè)物種均缺乏這一結(jié)構(gòu)。除此之外，赤琥珀螺tRNA-Phe和tRNA-His基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)缺失TΨC臂，亦與琥珀螺科已報(bào)道種不同[6-8]。盡管如此，由于陸生貝類許多重要類群的線粒體基因組當(dāng)前未知，對(duì)于它們基因重排的機(jī)制、進(jìn)化模式和變異程度至今尚不清楚。因此，對(duì)當(dāng)前觀察到的基因結(jié)構(gòu)差異在系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究中的意義有待更廣泛的? 探究。

腹足綱物種的系統(tǒng)發(fā)育分析一直備受關(guān)注，本研究中對(duì)高階層柄眼目的系統(tǒng)分類顯示其呈現(xiàn)單系，與Wade等的研究結(jié)果相一致[36]。柄眼目中對(duì)于琥珀螺科的分類問題亦備受重視，本研究對(duì)該科的研究結(jié)果與Guzmán等[8]的結(jié)果相一致，揭示琥珀螺科是Helicoidea + Urocoptoidea的姐妹群。對(duì)于赤琥珀螺的分類，本研究揭示其與同屬的腐敗琥珀螺關(guān)系最近，而與同在新疆分布的尖緣螺屬物種五家渠尖緣螺關(guān)系較遠(yuǎn)，這與形態(tài)學(xué)研究進(jìn)行的物種劃分結(jié)果一致。未來，期待有更多種類的線粒體基因組被測(cè)定研究，以便進(jìn)行更為全面、深入的系統(tǒng)發(fā)育探討。

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Complete Mitochondrial Genome Sequencing and Phylogeny

Analysis of? Succinea erythrophana

Abstract In this study，we obtained the complete mitochondrial genome sequence of Succinea erythrophana by high-throughput sequencing，and analyzed its structural and compositional features，and performed phylogenetic analyses using maximum likelihood （ML） and Bayesian inference （BI） methods （mtDNA sequences of three species of Succineidae and some species of Stylommatophora used in this paper downloading from NCBI）.The results showed that：①The complete mitochondrial genome of Succinea erythrophana was 14 023 bp in length （GenBank? No.ON533899），consisting of 37 genes and a segment of AT-rich non-coding control region，with 20 gene spacings and 13 gene overlaps.The average A+T was 77.3%，showing a significant AT bias.The order of gene arrangement，structure and composition，and codon usage were similar to those of the reported species in the Succineidae.? ②The secondary structure of most tRNAs in Succinea erythrophana showed a typical cloverleaf structure except for tRNA-Phe，tRNA-His，tRNA-Ser1，and tRNA-Ser2.③Ka/Ks selection pressure analysis of Succinea erythrophana showed that it was subject to purifying selection.④Phylogenetic studies showed the closest relatives of Succinea erythrophana and Succinea putris，which then formed sister groups with other species of the same family.

Key words Succinea erythrophana；Succineidae；Mitochondrial genome；Phylogeny