安麗婷 石明明 倪春輝 劉永剛 魏雪娟 喬萬強(qiáng) 李惠霞

摘 要 為了明確根結(jié)線蟲種類，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，對甘肅省臨洮縣胡蘿卜上的根結(jié)線蟲進(jìn)行鑒定，并測定其致病性。結(jié)果表明，該群體雌蟲蟲體梨形或檸檬形，乳白色，口針粗壯，中食道球近圓形。雌蟲會陰花紋呈卵圓形，背弓較平緩，肛門處有刻點(diǎn)。雄蟲蟲體細(xì)長，尾部鈍圓，交合刺針狀，成對。2齡幼蟲蟲體細(xì)長，呈蠕蟲形，唇區(qū)無明顯縊縮，口針發(fā)達(dá)，口針基部球小而圓，尾部透明區(qū)明顯，尾尖鈍圓。利用特異性引物Mh-R/Mh-F擴(kuò)增得到大小為462 bp的特異性片段，與北方根結(jié)線蟲（Meloidogyne hapla）一致?；诟Y(jié)線蟲屬rDNA ITS和28S-rDNA D2D3區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該群體均與北方根結(jié)線蟲序列聚為一支。將該線蟲接種胡蘿卜，其癥狀與田間發(fā)病癥狀一致，35 d后分離線蟲，其形態(tài)特征與北方根結(jié)線蟲相符。綜上，形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法，將該病原鑒定為北方根結(jié)線蟲（M.hapla），這是甘肅省首次報(bào)道北方根結(jié)線蟲危害胡蘿卜類蔬菜作物。

關(guān)鍵詞 胡蘿卜；北方根結(jié)線蟲；形態(tài)學(xué)特征；分子生物學(xué)；致病性；鑒定

胡蘿卜（Daucus? carota var. sativa Hoffm.）屬傘形科胡蘿卜屬2 a生草本植物，在世界各地廣泛種植，為全球性十大蔬菜之一[1]，含有豐富的類胡蘿卜素等多種植物活性物質(zhì)，具有抗癌、抗菌和血清生成的作用[2]。中國胡蘿卜種植面積約占世界總面積的40%，種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一[3]。甘肅省是中國重要的胡蘿卜產(chǎn)區(qū)，全省胡蘿卜種植面積達(dá)到2.355萬hm2，產(chǎn)量達(dá)69.5萬t，近年來，定西市臨洮縣胡蘿卜種植面積約? 0.3萬 hm2，是甘肅省胡蘿卜種植大縣之一，胡蘿卜產(chǎn)業(yè)已成為農(nóng)民致富的新增長點(diǎn)[3]。

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）寄主范圍廣泛，致病性強(qiáng)，是對中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響最大的一類植物病原線蟲[4]。對經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失的常見種類主要是南方根結(jié)線蟲（M. incongnita）、爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）、花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）和北方根結(jié)線蟲（M. hapla）等4種[5-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國蔬菜種植面積約1 100萬hm2，因根結(jié)線蟲為害造成減產(chǎn)約為30%，嚴(yán)重時甚至絕收，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)5億美元[7]。在北方，主要以南方根結(jié)線蟲危害保護(hù)地蔬菜，甘肅省尚未見北方根結(jié)線蟲危害蔬菜的報(bào)道。2020年，在甘肅省臨洮縣窯店鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)露地胡蘿卜發(fā)生根結(jié)線蟲病，本研究擬通過病樣采集，利用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，以確定根結(jié)線蟲種類，為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2020年10月，在甘肅省定西市臨洮縣窯店鎮(zhèn)（N 35°2′99″，E 103°8′59″）胡蘿卜病田，采集具有典型癥狀的病株，帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

1.2 胡蘿卜根結(jié)線蟲病病原種類鑒定

1.2.1 根結(jié)線蟲雌蟲會陰花紋的制作與形態(tài)觀察 將胡蘿卜病株根系洗凈，置于體視顯微鏡下，用眼科手術(shù)刀將根結(jié)表皮切開，用毛刷或鑷子將乳白色的球狀物（即為根結(jié)線蟲雌蟲）挑出，收集20頭，備用。載玻片上滴一滴0.9% NaCl溶液，挑取一頭，觀察形態(tài)特征并拍照，參照謝輝[8]的方法測量雌蟲的形態(tài)特征值。

會陰花紋的制作與觀察[7]：將雌蟲置于滴有45% 乳酸的載玻片上，用手術(shù)刀切去雌蟲的頸，然后輕輕擠壓蟲體排出內(nèi)含物，用手術(shù)刀將含有會陰花紋的蟲體后部切下，修整成平整的正方形，放置于載玻片上的甘油滴中，用毛針撥平鋪正，蓋上蓋玻片，制成臨時玻片，用顯微鏡觀察雌蟲會陰花紋并拍照。

1.2.2 根結(jié)線蟲2齡幼蟲的收集與形態(tài)觀察 在體視顯微鏡下用滅菌的眼科手術(shù)刀切開較大的根結(jié)，收集單個卵囊。將其置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵化。2～3 d后，在體視顯微鏡下觀察孵出2齡幼蟲[9]，挑取20條，? 備用。

載玻片上滴加蒸餾水，挑取2齡幼蟲，酒精燈上加熱，隔2～3秒在顯微鏡下觀察蟲體，若彎曲的線蟲蟲體突然伸直，則表明線蟲已死亡，停止加熱。熱殺死的線蟲立即加一滴TAF固定液（制作比例：三乙醇胺2 mL、福爾馬林7 mL、蒸餾水91 mL）固定，制作臨時玻片。以水作為浮載劑，將固定好的線蟲挑入，蓋上蓋玻片[7]，在顯微鏡下觀察線蟲形態(tài)并拍照，參照謝輝[8]的方法，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和體值測量。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 根結(jié)線蟲DNA的提?。簠⒄胀踅岬萚10]和王曦茁等[11]的方法稍作改進(jìn)。將孵出的2齡幼蟲清洗消毒后，挑取單條至盛有10 mL ddH2O的離心管中，反復(fù)沖洗2～3次，隨后轉(zhuǎn)移到含有10 μL線蟲裂解液的PCR管中。用滅菌解剖刀將線蟲切成數(shù)節(jié)，離心? 2 min后，加1 mg/mL的蛋白酶K 1 μL。將裂解后的線蟲置于PCR儀65 ℃恒育1 h，以降解蛋白質(zhì)，然后95 ℃恒溫10 min，得到線蟲DNA粗提取液。

PCR擴(kuò)增：采用線蟲ITS-rDNA通用引物TW81/AB28[12]、28S-rDNA通用引物D2A/D3B[13]及北方根結(jié)線蟲特異性引物Mh-F（5′-CGAATAGTCTCAACGTTTATC-3′）/Mh-R（5′-ATGTGACAGCGAAAAGAATT-3′）[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括DNA模板3 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1? μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃變性3 min，95 ℃變性30 s，退火溫度（55 ℃、55 ℃、52 ℃）退火30 s，? 72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min進(jìn)行檢測， 最后在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀測拍照[15]。

擴(kuò)增產(chǎn)物測序及數(shù)據(jù)分析：參照DNA凝膠回收試劑盒說明書，回收ITS序列和28S rDNA D2D3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與pMDTM 18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后均勻涂布于LB-氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上，用滅菌牙簽挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，獲得陽性克隆后委托擎科生物技術(shù)有限公司（北京）測序。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，下載置信度較高的序列，采用Clustal W對其和近源種進(jìn)行比對分析，通過Gbock 0.91b選擇保守區(qū)域后用MeModeltest version 2.3篩選最佳模型，最后用MrBayes構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15-17]。分別以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）（登錄號 X03680）和禾谷孢囊線蟲（Heterodera avenae）（登錄號 LT159825）為ITS和28S序列系統(tǒng)發(fā)育樹的外群。

1.2.4 致病性測定 將健康胡蘿卜種植于16×20 cm的塑料盆中，每盆一株，共10株，放置于? 25～28 ℃的溫室中，光暗交替培養(yǎng)（14L/10D）。2周后，8株胡蘿卜上接種北方根結(jié)線蟲臨洮群體的卵和2齡幼蟲混合液2 500條，2株未接種，作為對照。25～28 ℃溫室中培養(yǎng)，連續(xù)觀察植株發(fā)病情況。待植株發(fā)病后，從根上分離線蟲，觀察其形態(tài)是否與接種的線蟲群體一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜根結(jié)線蟲病危害癥狀

胡蘿卜感染根結(jié)線蟲后，初期地上部癥狀不明顯，后期發(fā)病重時地上部表現(xiàn)為植株矮小、葉片黃化萎蔫，發(fā)病植株常呈塊狀分布，造成缺苗斷梗。挖出肉質(zhì)根，可觀察到根部有大量須根和毛細(xì)根，主根偶有分叉。其上有球形或圓錐狀、大小不等的瘤狀物，即為根結(jié)（圖1-A）。根結(jié)初期為白色，表面光滑（圖1-B），后期逐漸變?yōu)楹稚㈤_始腐爛。剖開根結(jié)，可觀察到半透明或乳白色、針頭大小的雌成蟲。

2.2 根結(jié)線蟲胡蘿卜群體形態(tài)學(xué)特征

根結(jié)線蟲雌蟲形態(tài)測量值見表1。雌蟲蟲體為梨形或檸檬形（圖2-A），乳白色，蟲體前端突出如頸，后端橢圓形，口針強(qiáng)壯，中食道球發(fā)達(dá)，近圓形（圖2-B）。雌蟲會陰花紋呈卵圓形，背弓略平，有些群體刻線明顯，有些不明顯（圖2-C），肛門處有刻點(diǎn)。上述會陰花紋均為北方根結(jié)線蟲的典型特征。

該線蟲群體雄蟲形態(tài)測量值見表1。雄蟲蟲體蠕蟲形（圖3-A），口針粗壯（圖3-B）。尾部鈍圓，交合刺針狀，成對（圖3-C）。

胡蘿卜上根結(jié)線蟲2齡幼蟲形態(tài)測量值見表1。線蟲蟲體細(xì)長，頭部鈍圓光滑，尾部尖細(xì)，（圖3-D）唇區(qū)無明顯縊縮，口針發(fā)達(dá)（圖3-E），口針基部球明顯，呈圓形。尾部透明區(qū)清晰（圖3-F），這些特征均與北方根結(jié)線蟲2齡幼蟲特征相符。因此，初步將該線蟲群體鑒定為北方根結(jié)線蟲（M. hapla）。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

利用通用引物擴(kuò)增得到ITS和28S片段，大小分別為577 bp和762 bp，ITS序列（GenBank登錄號OM854803）與北方根結(jié)線蟲（GenBank登錄號MT249021、LC030361等）相似度為? 98.37%～99.82%，28S序列（GenBank登錄號OM401656）與北方根結(jié)線蟲（GenBank登錄號KJ598136、MN475814等）相似度為99.44%～99.87%?；贕TR+I+G模型構(gòu)建ITS和28S系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該根結(jié)線蟲ITS序列與北方根結(jié)線蟲序列聚為一支，置信度為100%，與其他根結(jié)線蟲序列可明顯區(qū)分（圖4）；28S序列與北方根結(jié)線蟲聚為一支，置信度達(dá)100%，與其他根結(jié)線蟲序列可明顯區(qū)分開（圖5）。

利用北方根結(jié)線蟲特異性引物Mh-F/Mh-R擴(kuò)增得到大小為462 bp的片段（圖6），而對照沒有擴(kuò)增出特異條帶，進(jìn)一步表明所測樣本為北方根結(jié)線蟲（M. hapla）。

2.4 致病性測定

株根部均有明顯的根結(jié)形成，與田間觀察到的癥狀一致，2株對照均未發(fā)現(xiàn)根結(jié)。從發(fā)病植株分離根結(jié)線蟲，觀察發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特征與接種線蟲一致，表明侵染胡蘿卜的病原是北方根結(jié)線蟲。

3 討論與結(jié)論

本研究對胡蘿卜根結(jié)線蟲病病株進(jìn)行病原分離，通過形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定和致病性測定，確定引起甘肅省臨洮縣胡蘿卜根結(jié)線蟲病的病原為北方根結(jié)線蟲（M.hapla）。北方根結(jié)線蟲是冷涼區(qū)作物上最主要的植物病原線蟲[16]。其寄主范圍廣泛，致病性強(qiáng)，可侵染蔬菜、煙草、花生、豆類等[17]多種作物，2020年，Li等[18]在甘肅省渭源縣黨參上首次發(fā)現(xiàn)北方根結(jié)線蟲。目前，國內(nèi)報(bào)道的引起胡蘿卜根結(jié)線蟲病的病原有南方根結(jié)線蟲[19]、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲[20-21]。2010年，蘇定昌等[21]報(bào)道花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲引起胡蘿卜根結(jié)線蟲病，但未對其進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。因北方根結(jié)線蟲對不同作物品種具有較強(qiáng)的寄主?；停蕼?zhǔn)確鑒定病原種類，明確田間為害的優(yōu)勢種對防治根結(jié)線蟲病具有重要意義。

通常，根結(jié)線蟲采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定[22-23]。雌蟲會陰花紋是根結(jié)線蟲重要的鑒別特征[24]，本試驗(yàn)中，供試根結(jié)線蟲的會陰花紋肛門處有刻點(diǎn)，背弓緩，這與謝輝[8]描述的北方根結(jié)線蟲雌蟲會陰花紋特征相似，且2齡幼蟲和雄蟲的測量值均與Whitehead[25]所描述的北方根結(jié)線蟲測量值基本相符。根結(jié)線蟲近源種之間形態(tài)差異不明顯，而雌蟲的會陰花紋存在一定的種內(nèi)變異[26]，因而無法單獨(dú)根據(jù)形態(tài)學(xué)特征準(zhǔn)確鑒定，還需結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。本試驗(yàn)擴(kuò)增了根結(jié)線蟲胡蘿卜群體的? rDNA-ITS和28S-rDNAD2D3區(qū)序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，其序列均與北方根結(jié)線蟲群體聚為一支且相似度較高。同時，北方根結(jié)線蟲特異性引物Mh-R/Mh-F擴(kuò)增結(jié)果與馮光泉等[14]一致，進(jìn)一步證實(shí)胡蘿卜根結(jié)線蟲病病原為北方根結(jié)線蟲。

甘肅省是北方根結(jié)線蟲新分布區(qū)，這是首次在甘肅省發(fā)現(xiàn)北方根結(jié)線蟲危害胡蘿卜。臨洮縣氣候陰濕，降雨較充足[27]，適合北方根結(jié)線蟲生存。胡蘿卜作為高原夏菜的重要品種，常年連作[28]，易造成根結(jié)線蟲病逐步擴(kuò)大、危害加重的趨勢，這將成為胡蘿卜生產(chǎn)中潛在的危險(xiǎn)性因素。若不采取控制措施，造成北方根結(jié)線蟲大量繁殖和擴(kuò)散，則會對甘肅省露地蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成? 威脅。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ 劉加建.鹽藻土有機(jī)肥在胡蘿卜上的肥效試驗(yàn)[J].中國果菜，2022，42（7）：66-69.

LIU J J.Effect of salina soil organic fertilizer on carrot[J].China Fruit & Vegetable，2022，42（7）：66-69.

[2] 朱順華，鐘秀來，王 堃，等.野生胡蘿卜和栽培胡蘿卜中DcF3H基因的克隆、進(jìn)化及功能分析[J].分子植物育種，2022，12（8）：1-17.

ZHU SH H，ZHONG X L，WANG K，et? al.Cloning，evolution and functional analysis ofDcF3H gene in wild carrot and cultivated carrot[J].Molecular Plant Breeding，2022，12（8）：1-17.

[3] 昔小麗.甘肅省胡蘿卜產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展建議[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2015（8）：77-79.

XI X L.Present situation and development suggestion of carrot industry in Gansu Province[J].Gansu Agricultural Science and Technology，2015（8）：77-79.

[4] 李 敏，白全江，席先梅，等.內(nèi)蒙古赤峰市保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲種類鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2017，47（2）：286-288.

LI M，BAI Q J，XI X M，et? al.Identification of vegetable root-knot nematodes in protected areas of Chifeng City，Inner Mongolia[J].Acta Phytopathologica Sinica，2017，47（2）：286-288.

[5] 宮遠(yuǎn)福.東北地區(qū)根結(jié)線蟲的種類分布及南方根結(jié)線蟲氯離子通道基因分析[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

GONG Y F.Species distribution of root-knot nematodes and analysis of chloride channel genes in southern root-knot nematodes in Northeast China[D].Shenyang：Shenyang Agricultural University，2020.

[6] 馮志新.植物線蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：50-200

FENG ZH X.Plant Nematology[M].Beijing：China Agriculture Press，2001：50-200

[7] 段玉璽.植物線蟲學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2011：95-146.

DUAN Y X.Plant Nematology[M].Beijing：Science Press，2011：95-146.

[8] 謝 輝.植物線蟲分類學(xué)[M].第2版.北京：高等教育出版社，2005：243-247.

XIE H.Taxonomy of Plant Nematodes[M].2nd ed.Beijing：Higher Education Press，2005：243-247.

[9] 楊艷梅，梁 艷，袁紹杰，等.云南省部分煙區(qū)根結(jié)線蟲形態(tài)和分子鑒定[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，48（2）：284-291.

YANG Y M，LIANG Y，YUAN SH J，et? al.Morphological and molecular identification of root-knot nematodes in some smoky areas of Yunnan Province[J].Journal of Southern Agriculture，2017，48（2）：284-291.

[10] 王江玲，張建成，顧建峰.單條線蟲DNA提取方法[J].? 植物檢疫，2011，25（2）：32-35.

WANG J L，ZHANG J CH，GU J F.Method of extract? DNA from a single nematode[J].Plant Quarantine，2011，25（2）：32-35.

[11] 王曦茁，汪來發(fā)，楊佐忠，等.四川省茂縣花椒根結(jié)線蟲病病原鑒定[J].植物保護(hù)，2014，40（4）：84-88.

WANG X ZH，WANG L F，YANG Z ZH，et? al.Identification of root-knot nematodes of? prickly ash in Maoxian County，Sichuan Province [J].Plant? Protection，2014，40（4）：84-88.

[12] WAEYENBERGE L，SUBBOTIN S A，MOENS M.Identification of cyst forming nematodes of the genus Heterodera （Nematoda：Heteroderidae） based on the ribosomal DNA-RFLP[J].Nematology Intenational? Journal of Fundamental & Applied? Nematological Research，2000，2（2）：153-164.

[13] DE LEY P，F(xiàn)ELIX M A，F(xiàn)RISSE L，et? al.Molecular and morphological characterisation of two reproductively isolated species with mirror-image anatomy （Nematoda：Cephalobidae）[J].Nematology，1999，1（6）：591-612.

[14] 馮光泉，董麗英，陳昱君，等.三七病原結(jié)線蟲的分子鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，27（1）：100-102.

FENG G Q，DONG L Y，CHEN L J，et? al.Molecular identification of pathogenic knot nematodes of Panax notoginseng[J].Southwest? China?? Journal? of? Agricultural? Sciences，2008，27（1）：100-102.

[15] 石明明，李惠霞，劉永剛，等.甘肅省黨參根結(jié)線蟲病發(fā)生、分布及病原種類鑒定[J].植物保護(hù)，2022，48（3）：181-191.

SHI M M，LI H X，LIU Y G，et? al.Occurrence，distribution and pathogen identification of Codonopsis root-knot nematodes in Gansu Province[J].Plant Protection，2022，48（3）：181-191.

[16] 耿英杰，陳德經(jīng)，商文靜.陜西省西洋參根結(jié)線蟲病的發(fā)生和病原鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，17（8）：1-8.

GENG Y J，CHEN D J，SHANG W J.Occurrence and pathogen identification of root-knot nematode disease of American ginseng in Shaanxi province[J].Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2022，17（8）：1-8.

[17] 馬承鑄.北方根結(jié)線蟲對棉花致病力的研究[J].植物保護(hù)，1985（5）：18-19.

MA CH ZH.Study on the virulence of boreal root-knot nematode on cotton[J].Plant Protection，1985（5）：18-19.

[18] LI W H，LI H X，LIU Y G，et? al.First report of North root-knot nematode Meloidogyne hapla on Codonopsis pilosula in China[J].Plant Disease，2020，104（8）：2295-2296.

[19] 張 鋒，洪 波，王遠(yuǎn)征，等.警惕胡蘿卜根結(jié)線蟲病的發(fā)生為害[J].西北園藝，2018（5）：48-49.

ZHANG F，HONG B，WANG Y ZH，et? al.Vigilance against the occurrence and harm of carrot root knot nematode disease[J].Northwest Horticulture，2018（5）：48-49.

[20] 武社梅，王 磊，王瑞芳.胡蘿卜根結(jié)線蟲病的發(fā)生與防治[J].種業(yè)導(dǎo)刊，2014（12）：22-23.

WU SH M，WANG L，WANG R F.Occurrence and control of carrot root-knot nematode disease[J].Journal of Seed Industry Guide，2014（12）：22-23.

[21] 蘇定昌，張友明.胡蘿卜根結(jié)線蟲病的防治措施[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16（17）：128-160.

SU D CH，ZHANG Y M.Control measures of carrot root knot nematode disease[J].Anhui Agricultural Science Bulletin，2010，16（17）：128-160.

[22] SASSER J N，EISENBACK J D，CARTER C C，et? al.The international Meloidogyne project-its goals and accomplishments[J].Annual Review of Phytopathology，1983，21：271-288.

[23] KHAN Z，KIM S，JEON Y，et? al.A plant growth promoting rhizobacterium? Paenibacillus polymyxa strain GBR-1，suppresses root-knot nematode[J].Bioresource Technology，2008，99：3016-3023.

[24] 趙 鴻，彭德良，朱建蘭.根結(jié)線蟲的研究現(xiàn)狀[J].植物保護(hù)，2003（6）：6-9.

ZHAO H，PENG D L，ZHU J L.Research status of root-knot nematodes[J].Plant Protection，2003（6）：6-9.

[25] WHITEHEAD A G.Taxonomy of Meloidogyne （Nematodea：Heteroderidae） with descriptions of four new species[J].The Transactions? of? the Zoological Society? of? London，1968，31：263-401.

[26] COOMANS A，TANDINGAN I，LEY D，et? al.Morphological，molecular characterisation and phylogenetic position of Longidorus mindanaoensis n.sp.（Nematoda：Longidoridae） from a Philippine Avicennia mangrove habitat[J].Nematology，2012，14（3）：285-307.

[27] 陳 楓，李澤紅，董鎖成，等.基于VSD模型的黃土高原丘陵溝壑區(qū)縣域生態(tài)脆弱性評價——以甘肅省臨洮縣為例[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2018，32（11）：74-80.

CHEN F，LI Z H，DONG S CH，et al.Ecological vulnerability assessment for counties in hilly and Gully Region of Loess Plateau based on VSD Model：a case study for Lintao County，Gansu Province[J].Journal of Arid Land Resources and Environment，2018，32（11）：74-80.

[28] 王 華.隴中地區(qū)高原夏菜套種栽培技術(shù)[J].中國蔬菜，2006（10）：47-48.

WANG H.Interplanting and cultivation techniques of summer vegetable in central Gansu[J].China Vegetables，2006（10）：47-48.

Identification of Carrot Root-knot Nematode Pathogen in Gansu Province

Abstract Morphological and molecular biological methods were used to identified the nematode population affecting carrots in Lintao county，Gansu province.The results showed that the female nematodes exhibiting pear-shaped or lemony bodied，were milky white with a robust stylet，and had round? median bulbs.The perineal patterns of females were oval with a low dorsal arch and punctations，and typically located above the anus.The male nematodes displayed elongated bodies with obtuse tails and a pair of acicular spicula.The second-stage juveniles（J2） had elongated and helminth-shaped bodies with no obvious constriction in the labial area.Their stylets were robust with small and round basal balls，and their tails were obtuse with obvious transparent areas.A specific 462 bp fragment? was amplified from the population using Mh-R/Mh-F specific primers，consistent with that of Meloidogyne hapla.Phylogenetic trees constructed based on the rDNA ITS and 28S-rDNA D2D3 sequences of the genus meloidogyne，indicated that this population clustered with the sequences of M.hapla.This nematode population inoculated on carrots led to the symptoms consistent with those of the diseased ones in the field.After 35 days，the nematode was isolated，and its morphological characteristics matched those of M.hapla.In conclusion，both morphological characteristics and molecular biological methods identify the the pathogen as M.hapla.This is the first report of M.hapla infecting carrot vegetable crop in Gansu province.

Key words Carrot;Meloidogyne hapla; Morphological characteristics; Molecular biological; Pathogenicity; Identification