張生懂 李捷 馮麗丹 孫濤 張煦 李永暉

摘 要 由尖孢鐮刀菌引起的根腐病是枸杞種植中的主要病害之一，為探究尖孢鐮刀菌侵染枸杞的分子致病機(jī)制，并挖掘其關(guān)鍵致病基因，通過尖孢鐮刀菌侵染‘寧杞1號(hào)枸杞根系，于侵染第7天刮取菌樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果表明，與純培養(yǎng)菌株相比，在侵染第7天的尖孢鐮刀菌中共發(fā)現(xiàn)了1 892個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因1 242個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因650個(gè)；GO富集分析表明，分子功能分類的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和ATP酶活性以及生物學(xué)過程分類的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能在尖孢鐮刀菌致病過程中發(fā)揮了重要作用；KEGG富集分析表明，鞘脂代謝、過氧化物酶體和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是尖孢鐮刀菌侵染過程的主要代謝途徑。此外，通過對(duì)比分析編碼碳水化合物酶與植物-病原互作相關(guān)基因在尖孢鐮刀菌侵染前后的表達(dá)量，篩選到10個(gè)關(guān)鍵致病候選基因。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)錄組；尖孢鐮刀菌；枸杞；差異表達(dá)基因；富集分析

枸杞（Lycium barbarum L.）是西北地區(qū)一類重要的藥食同源型經(jīng)濟(jì)作物，其在促進(jìn)西北地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用。但近年來由尖孢鐮刀菌為主要病原菌引起的土傳真菌性病害——根腐病的廣泛傳播，造成盛果期枸杞植株的大量死亡［1］。相關(guān)研究表明，枸杞根腐病的發(fā)病率會(huì)隨枸杞種植年限的延長而逐年加重，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)50%，給枸杞的種植和生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。加上根腐病的土壤傳播性質(zhì)，以目前的技術(shù)手段，很難通過施用殺菌劑對(duì)其產(chǎn)生有效防治［3］。

高通量測序技術(shù)精確度高，成本較低，已廣泛應(yīng)用于病原和寄主分子互作機(jī)制的研究以及功能基因的挖掘［4］。Thatcher等［5］對(duì)侵染苜蓿（Medicago sativa L.）的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，初步篩選到10個(gè)與致病相關(guān)的基因；舒新月等［6］對(duì)不同侵染時(shí)間點(diǎn)的稻粒黑粉病菌（Tilletia horrida）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，初步解析了稻粒黑粉病菌的致病分子機(jī)制；Ding等［7］和丁兆建等［8］通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路激酶基因FoBck1、 FoMKK2和FoSlt2可以調(diào)控尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.cubense）的生理特性和致病性，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?；鸵吧途旰虵oSlt2敲除突變體菌株進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，證實(shí)基因FoSlt2在調(diào)控尖孢鐮刀菌古巴?；偷纳L發(fā)育、細(xì)胞壁完整性和致病性方面發(fā)揮著重要作用；梁麗琴等［9］也通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，敲除Argonaute1基因后的尖孢鐮刀菌致病相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá)。

目前，對(duì)于尖孢鐮刀菌在其他植株，如綠豆（Vigna radiata L.）［10］、香蕉（Musa nana Lour.）［11］和苜蓿［5］等方面的研究較多，但在枸杞中的致病性研究較少。因此，為了初步解析尖孢鐮刀菌侵染枸杞的分子致病機(jī)制，本研究對(duì)侵染‘寧杞1號(hào)根系7 d的尖孢鐮刀菌進(jìn)行取樣，以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d菌株作為對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，并篩選出尖孢鐮刀菌在侵染過程中的關(guān)鍵致病基因，為后續(xù)功能基因的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尖孢鐮刀菌菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林木生理生化實(shí)驗(yàn)室分離并保存；枸杞根部組織采集自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)林實(shí)訓(xùn)基地大田栽種的‘寧杞1號(hào)植株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將尖孢鐮刀菌菌株于PDA固體培養(yǎng)基上活化后，用消毒后的打孔器挑取菌餅于新的PDA固體培養(yǎng)基中，于26 ℃恒溫箱培養(yǎng)7 d后，刮取培養(yǎng)基表面的菌絲制成孢子懸浮液。將采集到的根組織用蒸餾水沖洗干凈，以消毒后的針刺對(duì)枸杞根組織間隔1 cm進(jìn)行扎孔處理，為尖孢鐮刀菌提供侵染途徑。將處理后的根組織置于配置好的孢子懸浮液中靜置2 min后取出，于培養(yǎng)皿中26 ℃恒溫培養(yǎng)，為保持根組織活性，每隔2 d于無菌操作臺(tái)中向培養(yǎng)皿加入適量無菌水。由前期預(yù)試驗(yàn)可知，在尖孢鐮刀菌侵染枸杞第7天可取夠轉(zhuǎn)錄組測序所需樣本量，同時(shí)PDA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)的菌絲也可長滿培養(yǎng)皿。因此，于尖孢鐮刀菌侵染第7天刮取枸杞根組織表面的菌絲作為處理組（T），同時(shí)以PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌絲作為對(duì)照組（CK），各組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于后續(xù)RNA提取。

1.2.2 樣品RNA提取 采用Tri-zol法提取6個(gè) RNA 樣品，利用Nanodrop 2 000對(duì)所提RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測，以1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，并保存于超低溫冰箱備用。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序分析 利用高通量測序平臺(tái)（Illumina Hiseq 2 500）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d菌株測序作為參考基因組，使用SOAP2軟件將測序得到的過濾后讀段（Clean reads）比對(duì)到參考基因組。

1.2.4 差異表達(dá)分析 使用R程序中的DESeq2（version1.18.0）程序包進(jìn)行差異表達(dá)分析，P-value的計(jì)算模型為負(fù)二項(xiàng)分布，初步以P-value< 0.0001 & |log2（Fold Change）| > 2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，并根據(jù)基因的表達(dá)量繪制表達(dá)模式聚類熱圖。

1.2.5 GO和KEGG富集分析 GO和KEGG富集的P-value經(jīng)過Bonferroni校正后，以? FDR<0.05為顯著富集。使用R程序中的GOseq程序包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析；KEGG富集分析使用KOBAS 3.0軟件，并分別選取在GO和KEGGG中富集最為顯著的20個(gè)條目（term）和通路（pathway）繪制富集分析圖。

1.2.6 關(guān)鍵致病基因的篩選 根據(jù)“1.2.4”篩選到的差異表達(dá)基因繪制可以直觀顯示全部基因在兩組樣本間差異倍數(shù)（Fold Change）值分布情況的火山圖，進(jìn)一步限定閾值，篩選極顯著差異表達(dá)的基因，并剔除少于兩個(gè)注釋信息的基因。在此基礎(chǔ)上，對(duì)與病原菌致病性密切相關(guān)的碳水化合物活性酶以及植物-病原互作相關(guān)基因進(jìn)行篩選并分析。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用篩選到的候選致病基因，使用 ABI 7 500 實(shí)時(shí)系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量 PCR （qRT-PCR） 驗(yàn)證 RNA-seq 的結(jié)果。以actin作為內(nèi)參基因，試驗(yàn)對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，使用軟件Oligo 7.0設(shè)計(jì)引物（表1），采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌侵染枸杞根系的測序數(shù)據(jù)分析

6個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組測序共獲得131 997 114條Clean reads，去掉接頭、含N的序列和低質(zhì)量的reads后，每個(gè)樣本產(chǎn)生約 6.5 Gb Clean bases；在參考基因組上的平均比對(duì)率約達(dá)70%，Q20為96.8%～98.5%，Q30為91.6%～95.3%，GC含量為53.6%～55.2%（表2）。根據(jù)測序的Clean reads和比對(duì)到參考基因組的數(shù)據(jù)，可進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 尖孢鐮刀菌侵染枸杞根系前后的差異性分析

2.2.1 差異表達(dá)分析 在P-value<0.000 1 & |log2（Fold Change）| >2的篩選閾值下總共篩選到1 892個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），包括1 242個(gè)上調(diào)表達(dá)和650個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因，表明尖孢鐮刀菌在侵染后的差異表達(dá)基因主要表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達(dá)。

通過表達(dá)模式聚類熱圖（圖1）可知，CK和T兩組樣本間聚類明顯分離，且兩組樣本間顯示相同顏色的基因相對(duì)較少，初步說明尖孢鐮刀菌在侵染枸杞前后的基因表達(dá)存在明顯差異。

2.2.2 GO富集分析 對(duì)篩選到的1 892個(gè)DEGs進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些DEGs被富集到生物學(xué)過程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular componment）和分子功能（molecular function）3個(gè)GO分類中。由GO富集柱狀圖（圖2）可以看出，在生物學(xué)過程分類中，DEGs主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程相關(guān)條目中，如金屬離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等過程；在細(xì)胞組成分類中，DEGs在細(xì)胞膜及質(zhì)膜等相關(guān)條目富集最為顯著；在分子功能分類中，DEGs則主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及ATP酶活性相關(guān)條目中。

2.2.3 KEGG富集分析 對(duì)DEGs進(jìn)行Pathway顯著性分析發(fā)現(xiàn)，在尖孢鐮刀菌侵染過程中，鞘脂代謝（sphingolipid metabolism）、過氧化物酶體（Peroxisome）和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporters）等是最主要的代謝途徑，其P-value均小于0.000 1，推測以上代謝途徑很可能參與了尖孢鐮刀菌對(duì)枸杞的致病過程（圖3）。

2.3 關(guān)鍵致病基因的篩選

通過火山圖可以發(fā)現(xiàn)，大部分高表達(dá)的基因主要分布于-lg P-value>10 & |log2（Fold Change）|>5的范圍內(nèi)，因此進(jìn)一步設(shè)定篩選閾值為-lg P-value>10 & |log2（Fold Change）|>5對(duì)1 892個(gè)顯著DEGs進(jìn)行篩選，最終共篩選到283個(gè)極顯著DEGs，包括166個(gè)上調(diào)表達(dá)和117個(gè)下調(diào)表達(dá)的DEGs（圖4）。通過NR數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、KO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、KOG數(shù)據(jù)庫和Swiss-prot數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選到的極顯著DEGs進(jìn)行注釋，并剔除少于兩個(gè)注釋結(jié)果的DEGs，最終得到180個(gè)極顯著表達(dá)且有兩個(gè)及以上注釋結(jié)果的DEGs。

2.3.1 碳水化合物活性酶相關(guān)DEGs 通過分析180個(gè)極顯著DEGs的注釋信息，發(fā)現(xiàn)47個(gè)DEGs與碳水化合物活性酶相關(guān)，包括編碼MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶以及細(xì)胞壁降解酶相關(guān)的基因。其中，編碼β-木糖酶（beta-xylosidase）的基因 NECHADRAFT_48184、編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase）的基因NECHADRAFT_52370、編碼果膠酸裂解酶（pectate lyase）的基因NECHADRAFT_8181和NECHADRAFT_122787以及編碼MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MFS transporter）的基因NECHADRAFT_45233在尖孢鐮刀菌侵染7 d后顯著上調(diào)表達(dá)（圖5）。相關(guān)研究表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在病原真菌侵染宿主植物過程中發(fā)揮致病性作用，而β-木糖酶和果膠酸裂解酶均為細(xì)胞壁降解酶類，是致病菌侵染宿主植物細(xì)胞壁的關(guān)鍵酶［12-13］。因此，推測NECHADRAFT_48184、NECHADRAFT_52370、NECHADRAFT_8181、 NECHADRAFT_122787和NECHADRAFT_45233參與了尖孢鐮刀菌的致病機(jī)制。

2.3.2 植物-病原互作相關(guān)DEGs 從180個(gè)DEGs中共篩選到25個(gè)上調(diào)表達(dá)的植物-病原互作相關(guān)DEGs，包括編碼角質(zhì)酶、自噬相關(guān)蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)運(yùn)型ATP酶等相關(guān)酶的基因。其中，編碼Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶（Na+/K+ P-type transporting ATPase）的基因 NECHADRAFT_65962和 NECHADRAFT_62632、編碼Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶（Ca2+P-type transporting ATPase）的基因 NECHADRAFT_100814、編碼AAA+型ATP酶（AAA+-type ATPase）的基因NECHADRAFT_1988和編碼角質(zhì)酶（chitinase）的基因 NECHADRAFT_122567在尖孢鐮刀菌侵染前后變化尤為顯著（圖6）。研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)型ATP酶在致病菌致病過程中可以為細(xì)胞輸入許多新陳代謝所需的物質(zhì)并輸出毒物［14］，因此推測基因NECHADRAFT_65962、 NECHADRAFT_62632、 NECHADRAFT_100814和NECHADRAFT_1988可能在致病過程中發(fā)揮了重要作用。另外，角質(zhì)酶作為突破寄主植物角質(zhì)層的工具酶，也參與了真菌的致病性過程，其編碼基因 NECHADRAFT_122567也是尖孢鐮刀菌成功侵染的關(guān)鍵基因。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 分析

為了驗(yàn)證 RNA-seq 數(shù)據(jù)的可靠性，對(duì)篩選到的10個(gè)關(guān)鍵致病候選基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，并將其結(jié)果與RNA-seq結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析（圖7）。結(jié)果表明，10個(gè)關(guān)鍵致病候選基因轉(zhuǎn)錄得到的FPKM值與qRT-PCR得到的基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致，兩者的相關(guān)系數(shù)達(dá)?? 0.882 5，說明對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的分析具有可? 靠性。

3 討? 論

近年來，素有“植物癌癥”之稱的根腐病逐漸成為制約枸杞種植的重要因素之一，其發(fā)病率一般可達(dá)15%～65%［15］。而目前主要依賴于化學(xué)藥劑對(duì)枸杞根腐病的防治，不僅對(duì)環(huán)境和人體不利，而且因其土傳性質(zhì)，很難達(dá)到有效防治［16］。解析根腐病主要致病菌尖孢鐮刀菌的分子致病機(jī)[CM（21]制，是制定對(duì)其進(jìn)行有效防治策略的根本前提。

為初步闡明尖孢鐮刀菌的分子致病機(jī)制，本研究對(duì)尖孢鐮刀菌侵染第7天的DEGs進(jìn)行富集分析，并篩選10個(gè)與致病性密切相關(guān)的候選基因。為了確保測序數(shù)據(jù)的可靠性，通過qRT-PCR對(duì)10個(gè)候選致病基因的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)和qRT-PCR得到的數(shù)據(jù)表達(dá)趨勢(shì)高度一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)可以作為解析尖孢鐮刀菌致病機(jī)制的依據(jù)。

KEGG富集分析表明，DEGs在鞘脂代謝、過氧化物酶體和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等代謝途徑顯著富集。其中，鞘脂代謝途徑不僅參與多種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，還與病原真菌的致病性密切相關(guān)［17］。本研究中共發(fā)現(xiàn)17個(gè)與鞘脂代謝途徑相關(guān)的DEGs，其中在尖孢鐮刀菌侵染前后表達(dá)差異最為顯著的基因 NECHADRAFT_53688和 NECHADRAFT_78539分別通過調(diào)控能影響病原真菌生長發(fā)育和致病力的葡萄糖基神經(jīng)酰胺（glucosylceramide，GlcCer）和半乳糖基神經(jīng)酰胺（galactosylceramide，GalCer）的合成，從而對(duì)鞘脂代謝產(chǎn)生影響 ［18-21］。研究表明，沉默調(diào)控GlcCer合成相關(guān)基因的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）突變體菌株，雖仍可侵染宿主植物，但致病力明顯減弱［22］； PdGcs1是編碼柑橘綠霉菌（Penicillium digitatum） GlcCer合成的關(guān)鍵基因，缺失該基因會(huì)導(dǎo)致柑橘綠霉菌菌絲生長緩慢，孢子萌發(fā)延遲，且毒力顯著減弱［23］。過氧化物酶體也在真菌致病過程中發(fā)揮著重要作用，缺失過氧化物酶體 PEX6基因的炭疽病菌（Colletotrichum acutatum），致病力明顯下降，導(dǎo)致侵染宿主植物失敗［24］；敲除過氧化物酶體基因Mgpex6Delta的稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）突變體菌株，不能形成具有侵染能力的附著孢，從而導(dǎo)致病原菌的致病性喪失［25］。除此之外，通過對(duì)小麥葉銹病菌（Puccinia triticina）ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，沉默小麥葉銹病菌體內(nèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因，會(huì)導(dǎo)致小麥葉銹病菌致病力顯著降低，并且抑制病原菌的發(fā)育，證明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在致病菌侵染過程中發(fā)揮毒力作用［26］?；谝陨嫌^點(diǎn)，本研究進(jìn)一步推測鞘脂代謝、過氧化物酶體和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等代謝途徑在尖孢鐮刀菌侵染枸杞過程中發(fā)揮了極其重要的作用。

此外，為了進(jìn)一步篩選出尖孢鐮刀菌在侵染過程中的關(guān)鍵致病基因，本研究對(duì)在真菌侵染過程中發(fā)揮致病作用的碳水化合物活性酶和植物—病原互作相關(guān)的DEGs進(jìn)行解析。在對(duì)碳水化合物活性酶相關(guān)DEGs進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，除細(xì)胞壁降解酶相關(guān)DEGs變化顯著外，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相關(guān)DEGs也被誘導(dǎo)顯著差異表達(dá)。其中，細(xì)胞壁降解酶是病原菌成功侵染宿主植物的關(guān)鍵致病因子，植物病原菌通過分泌細(xì)胞壁降解酶降解宿主植物的細(xì)胞壁成功進(jìn)入植物體內(nèi)，從而對(duì)植物產(chǎn)生致病性，Zheng等［27］研究表明，水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）侵染宿主期間，大量細(xì)胞壁降解酶被誘導(dǎo)表達(dá)。MFS是真核生物和原核生物體內(nèi)兩個(gè)最大的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族之一，在植物病原菌中，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可通過參與植物毒素的分泌，從而對(duì)植物產(chǎn)生致病性。敲除灰霉病菌（Botrytis cinerea） BcMfs1、小麥葉枯菌（Mycosphaerella graminicola） MgMfs1和炭疽病菌（Colletotrichum acutatum） ChMfs1等真菌體內(nèi)編碼MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因后，其突變體菌株均表現(xiàn)為分生孢子減少，致病力降低［12，28-29］。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，敲除編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 MoSch9基因后的稻瘟病菌突變體菌株，生長速率、產(chǎn)孢量、致病力以及在寄主植物體內(nèi)的擴(kuò)展能力均顯著降低，且有性生殖能力喪失［30］；Liu等［31］也發(fā)現(xiàn)缺失編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 MgATG1基因的稻瘟病菌突變體菌株，喪失侵染水稻和小麥的能力，以上研究均表明絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在植物病原菌侵染宿主植物過程中發(fā)揮了致病性作用。在本研究中，編碼細(xì)胞壁降解酶的基因NECHADRAFT_48184、NECHADRAFT_8181、NECHADRAFT_122787和編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因NECHADRAFT_52370以及編碼MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因NECHADRAFT_45233均被誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，因此推測以上基因是尖孢鐮刀菌侵染枸杞的關(guān)鍵致病基因。

在對(duì)植物—病原互作相關(guān)DEGs進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶編碼基因NECHADRAFT_65962和NECHADRAFT_62632、Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶編碼基因NECHADRAFT_100814等一些編碼P型ATP酶的基因在尖孢鐮刀菌侵染前后表達(dá)差異顯著。相關(guān)研究表明，P型ATP酶是一類可以被ATP驅(qū)動(dòng)發(fā)生磷酸化的陽離子泵，包括Na+、K+和Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，普遍存在于各種生物體中，參與生物體許多重要的代謝過程。在植物病原菌中，P型ATP酶家族基因不僅參與離子運(yùn)輸、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，部分P型ATP酶還與病菌的生長發(fā)育以及致病性密切相關(guān)［14］。相關(guān)研究在稻瘟病菌中發(fā)現(xiàn)了 MgAPT2和 PDE1兩個(gè)與致病性密切相關(guān)的P型ATP酶基因，其中? MgAPT2是稻瘟病菌侵染過程中分泌作用所必需的基因，缺少該基因的突變體菌株表現(xiàn)為多種胞外酶分泌受阻，影響附著胞的形成，而 PDE1基因則主要調(diào)控致病菌的生長發(fā)育和致病性［32-33］；蔡志英［34］利用基因敲除與互補(bǔ)技術(shù)，證實(shí)了Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶基因 CgATPase是橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的一個(gè)致病基因，該基因不僅影響菌株穿透橡膠樹葉片表皮組織的能力，還可調(diào)控菌株生長速度、產(chǎn)孢量以及孢子大小。此外，編碼角質(zhì)酶的基因NECHADRAFT_122567也在尖孢鐮刀菌侵染前后顯著差異表達(dá)，角質(zhì)酶在植物病原菌侵染宿主植物過程中發(fā)揮重要作用，是突破植物角質(zhì)層的主要工具酶，相關(guān)研究表明，缺失編碼角質(zhì)酶基因的突變體菌株致病力減弱或無致病力，而恢復(fù)缺失的角質(zhì)酶編碼基因后，菌株恢復(fù)致病力［35］。結(jié)合上述相關(guān)研究推測，編碼P型ATP酶的基因NECHADRAFT_65962、NECHADRAFT_62632、NECHADRAFT_100814和編碼角質(zhì)酶的基因NECHADRAFT_122567可能也是尖孢鐮刀菌成功侵染寄主的關(guān)鍵因子。

除此之外，本研究通過火山圖發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的DEGs中分別有兩個(gè)表達(dá)差異異常顯著的基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因 NECHADRAFT_92084和 NECHADRAFT_51989主要調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，而下調(diào)表達(dá)的基因 NECHADRAFT_64597和 NECHADRAFT_39397則主要調(diào)控磷酸酶的活性。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在真菌致病過程中發(fā)揮了重要作用在上文已經(jīng)得到論證，因此，本研究推測，調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的基因 NECHADRAFT_92084和 NECHADRAFT_51989極有可能也是尖孢鐮刀菌成功侵染枸杞的關(guān)鍵致病基因。而磷酸酶是一類廣泛存在于除高等植物外幾乎所有生物體內(nèi)的非特異性磷酸單酯酶，主要參與催化生物體內(nèi)的水解反應(yīng)［36］。有研究表明，磷酸酶在真菌的生長發(fā)育、分生孢子的形成和對(duì)寄主的致病性方面發(fā)揮著重要作用，通過敲除稻瘟病菌體內(nèi)編碼磷酸酶的基因發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，突變體菌株生長緩慢，且分生孢子的致病力減弱［37］；除參與病原菌的致病性過程外，磷酸酶還參與病原菌對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，在氧化脅迫下，柑橘褐斑病菌編碼磷酸酶的基因表達(dá)量顯著下降［38］。在本研究中，編碼磷酸酶的基因 NECHADRAFT_64597和 NECHAD-RAFT_39397在尖孢鐮刀菌侵染后顯著下調(diào)表達(dá)，推測可能是由于枸杞為了抵御尖孢鐮刀菌的侵染，產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致編碼磷酸酶的基因表達(dá)受到了抑制，但其具體的作用機(jī)理以及基因 NECHADRAFT_64597和 NECHADRAFT_39397是否為尖孢鐮刀菌侵染枸杞的關(guān)鍵致病基因還需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

4 結(jié)? 論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析，解析尖孢鐮刀菌在侵染枸杞前后的基因表達(dá)差異，初步闡明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、過氧化物酶體以及鞘脂代謝是尖孢鐮刀菌侵染枸杞過程中的關(guān)鍵代謝途徑。此外，對(duì)細(xì)胞壁降解酶和植物—病原互作相關(guān)DEGs進(jìn)行解析，最終篩選到10個(gè)與尖孢鐮刀菌致病性密切相關(guān)的致病候選基因，為后續(xù)關(guān)鍵致病基因的功能驗(yàn)證奠定了理論基礎(chǔ)。

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Transcriptome Analysis of Fusarium oxysporum Infected Roots of Lycium barbarum

Abstract Root rot caused by Fusarium oxysporum is major disease affecting the cultivation of Lycium barbarum.We infected the roots of L.barbarum ‘Ningqi No.1 with F.oxysporum and analyzed the bacterial samples on the 7th day of infection using transcriptome sequencing.The aim was to investigate the molecular pathogenic mechanism of F.oxysporum infection in? L.barbarum and identify its key pathogenic genes.Our findings? revealed that，compared with pure culture strains，F(xiàn).oxysporum showed 1 892 significantly differentially expressed genes on the 7th day of infection，including?? 1 242 up-regulated genes and 650 down-regulated genes; GO enrichment analysis indicated that transmembrane transporter and ATPase activity classified as molecular function and transmembrane transport classified as biological process might play an important role in the pathogenesis of F.oxysporum; KEGG enrichment analysis showed that sphingolipid metabolism，peroxisome and ABC transporters were the main metabolic pathways during F.oxysporum infection.Furthemore，we identified 10 key pathogenic candidate genes by comparing the the expression levels of genes encoding carbohydrases and plant-pathogen interactions before and after F.oxysporum infection.Overall，this study provides a theoretical foundation for the elucidation of the molecular pathogenic mechanism of? F.oxysporum.

Key words Transcriptome; Fusarium oxysporum; Lycium barbarum; Differentially expressed genes; Enrichment analysis