何 瀅,馬曉玲,高璐璐,祖逸崢,張瑞琪 ,哈春芳,4

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大常見(jiàn)惡性腫瘤之一,其死亡率位居所有婦科惡性腫瘤之首[1]。因?yàn)槁殉菜赜械慕馄饰恢眉敖Y(jié)構(gòu),就診時(shí)70%的患者已處于晚期。目前晚期上皮性卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)診治流程為初始腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后給予 6個(gè)療程的含鉑方案化療[2]。但經(jīng)初始治療后患者3年累積復(fù)發(fā)率高達(dá)70%,5年總生存率不足50%[3]。鉑類耐藥是目前卵巢癌復(fù)發(fā)的主要原因之一[4]。因此,化療耐藥已成為提高卵巢癌治愈率的關(guān)鍵限制因素。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí),CXCL5即CXC趨化因子配體-5在非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[5],可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌放療敏感[6],還可作為腎癌、乳腺癌中促溶酶藥物耐藥的生物標(biāo)志物[7]。課題組前期采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出上皮性卵巢癌患者差異基因5個(gè),其中CXCL5基因表達(dá)最為明顯并行qRT-PCR 驗(yàn)證。故本研究探討 CXCL5 在鉑耐藥上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況及其與臨床特征之間的關(guān)年2月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總系,旨在為臨床上卵巢癌鉑類耐藥探索有效的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2015年1月至2021年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科行滿意腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類為主規(guī)范化療(至少6次),并且治療結(jié)束后隨訪時(shí)間不少于6個(gè)月的134名上皮性卵巢癌患者。其中根據(jù)停止化療6個(gè)月后是否復(fù)發(fā)分為鉑耐藥組(實(shí)驗(yàn)組)70例和鉑敏感組(對(duì)照組)64例,鉑耐藥組平均年齡為(56.14±8.97)歲,鉑敏感組平均年齡為(54.50±6.91)歲。所有入選者的組織石蠟標(biāo)本均為手術(shù)切除組織蠟塊,由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科制備。全部病例均經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷,該實(shí)驗(yàn)已獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)與授權(quán),實(shí)驗(yàn)參與者均已簽署知情同意書(shū)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合《中華婦產(chǎn)科學(xué)》(第3版)中相關(guān)卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者;②于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院進(jìn)行初始腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)且術(shù)后病理確診為上皮性卵巢癌的患者;③于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院術(shù)后接受至少6個(gè)療程含鉑方案化療的患者;④治療結(jié)束后隨訪時(shí)間大于6個(gè)月且病例資料完整可靠的患者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①非上皮性卵巢癌的惡性腫瘤患者;②合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病的患者;③術(shù)后未規(guī)范化療的患者;④隨訪時(shí)間小于6個(gè)月或失訪的患者。

1.2 鉑耐藥復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]經(jīng)規(guī)范治療達(dá)到臨床癥狀緩解的患者出現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物CA125升高、胸腹水,查體或影像學(xué)資料發(fā)現(xiàn)包塊、不明原因腸梗阻,其中2項(xiàng)陽(yáng)性或幾項(xiàng)陽(yáng)性提示卵巢癌復(fù)發(fā)。

1.3 鉑耐藥組各相關(guān)因素分組依據(jù) 根據(jù)課題組前期研究改良的Suidan 評(píng)分[2],將CA125、HE4分為高低水平組,CA125組又分為CA125<545.6 U/mL組和 CA125≥545.6 U/mL組;HE4組又分為HE4<246.7 pmol/L組和HE4≥246.7 pmol/L組。參考人民衛(wèi)生出版社出版的第九版《診斷學(xué)》,將NEUT、PLT分為高低水平組,NEUT組又分為NEUT<7.0×109/L組和NEUT≥7.0×109/L組;PLT組又分為PLT<300×109/L組和PLT≥300×109/L組?；颊呤状沃委煏r(shí)的影像學(xué)檢查(超聲、CT等)[9]或未行新輔助化療手術(shù)探查體現(xiàn)的腹水量,以500 mL為界值,分為腹水量<500 mL組和腹水量≥500 mL組。

1.4 主要試劑 兔來(lái)源多克隆CXCL5抗體 (美國(guó)Affinity Biosciences 公司) ,HRP標(biāo)記山羊抗兔和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)濃縮液及稀釋液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行石蠟組織中抗原檢測(cè)。所有腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)3μm切片。將載玻片以30°角度放置在60 ℃漂烘機(jī)上烘干30 min后插入染色架,并放入60 ℃烤箱過(guò)夜。用二甲苯脫蠟后用依次遞減濃度酒精脫去二甲苯并水化;微波抗原修復(fù)后加入適量?jī)?nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑來(lái)消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;加入適量的山羊血清封閉液完全覆蓋組織塊,在室溫孵育30 min后再加入適當(dāng)比例稀釋的一抗 (稀釋濃度為1∶200 ),放入4 ℃冰箱過(guò)夜后室溫孵育1h,用PBS溶液清洗2～3次(每次5 min);然后滴加黃色加強(qiáng)劑,放入保溫盒里15 min,PBS溶液清洗2次后甩干放入保溫盒里滴加二抗,蓋上保溫蓋放置1個(gè)小時(shí),清洗2遍后DAB顯色液顯色;蘇木素染液復(fù)染;梯度乙醇脫水;凝膠封片;顯微鏡觀察組織染色情況,并在相同條件下拍照記錄。

1.6 結(jié)果判讀 CXCL5以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá),所有結(jié)果均需由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片判讀,每張切片在(200×)高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(必須保證所有圖像在同一條件下采集),用軟件Image J進(jìn)行圖像分析,測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(AOD),計(jì)算5個(gè)視野的平均數(shù)值作為本張切片的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 CXCL5在卵巢癌患者組織中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,CXCL5表達(dá)主要在卵巢癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。CXCL5在鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞中弱表達(dá)或無(wú)表達(dá),而在血管中高表達(dá),染色為淺棕色;在鉑敏感卵巢癌細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá),染色為深棕色或棕褐色,見(jiàn)圖1至圖3(封二)。

2.2 鉑耐藥組與鉑敏感組患者卵巢癌組織中CXCL5表達(dá)水平比較 本實(shí)驗(yàn)采用陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(AOD)來(lái)表示2組患者卵巢癌組織中CXCL5的相對(duì)表達(dá)水平。CXCL5在鉑耐藥組卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯低于鉑敏感組卵巢癌,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 鉑耐藥組與鉑敏感組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)比較

2.3 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與一般臨床特征的關(guān)系 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)在年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病灶大小間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ,而在是否接受新輔助化療和總化療次數(shù)(總化療次6次與總化療次數(shù)>6次)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中,CXCL5 蛋白在未接受新輔助化療的鉑耐藥患者卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于接受新輔助化療的鉑耐藥患者(P<0.05),在總化療次數(shù)為 6 次組鉑耐藥患者卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于總化療次數(shù)>6次組的鉑耐藥患者(P<0.05)。提示CXCL5在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中的表達(dá)與新輔助化療和總化療次數(shù)有關(guān)且呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病灶大小無(wú)相關(guān)性(P>0.05) ,見(jiàn)表2。

2.4 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與術(shù)前血清學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與血清中CA125的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ,而與HE4、NEUT、PLT的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中,CXCL5在HE4低水平組患者卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于HE4高水平組患者(P<0.05),但在NEUT高水平組患者的表達(dá)水平明顯高于NEUT低水平組患者(P<0.05),在PLT高水平組患者卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于PLT低水平組患者(P<0.05)。提示CXCL5 在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中的表達(dá)與血清中HE4、NEUT、PLT的表達(dá)水平有關(guān),且與HE4呈正相關(guān)(P<0.05),與 NEUT、PLT呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與CA125無(wú)相關(guān)性(P>0.05),見(jiàn)表3。

表2 鉑耐藥患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與一般臨床特征的相關(guān)性

表3 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與術(shù)前血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與腫瘤單雙側(cè)、脈管陽(yáng)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ,而與FIGO分期、組織分化程度、腹水量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中,CXCL5在FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期組的患者卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期組的患者(P<0.05),在中-高分化組的患者卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于低分化組的患者(P<0.05),在腹水量<500 mL組患者卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于腹水量≥500 mL組的患者(P<0.05)。提示CXCL5在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中的表達(dá)與與FIGO分期、組織分化程度、腹水量有關(guān)(P<0.05),且與FIGO分期、腹水量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),組織學(xué)分化程度呈正相關(guān)(P<0.05),而與腫瘤單雙側(cè)、脈管陽(yáng)性無(wú)相關(guān)性(P>0.05),見(jiàn)表4。

表4 鉑耐藥患者卵巢癌組織中CXCL5的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論

卵巢癌僅占女性癌癥的 3%,卻是女性癌癥死亡的第五大原因之一[10]。據(jù)報(bào)道,卵巢癌的發(fā)病率為12.5/10萬(wàn)婦女,發(fā)病率在過(guò)去20年里下降了不到1%,死亡率基本沒(méi)有改變[10]。鉑耐藥是導(dǎo)致卵巢癌患者治療失敗甚至死亡的重要原因,即使患者治療初期對(duì)鉑類藥物敏感,但是經(jīng)過(guò)多次復(fù)發(fā)后,最終都會(huì)對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性[11]。因此,探索新的治療靶點(diǎn)從而克服鉑類耐藥是提高癌癥治療效果的迫切需要。

CXCL5是CXC趨化因子的家族成員,作為中性粒細(xì)胞強(qiáng)大的誘導(dǎo)劑和炎癥介質(zhì),可介導(dǎo)血管增生,促進(jìn)細(xì)胞遷移、吞噬、鈣離子內(nèi)流和呼吸爆發(fā),在纖維化、細(xì)胞增殖及凋亡等活動(dòng)中具有重要作用[12]。Zhao等人[13]證實(shí),CXCL5可激活ERK/Elk-1/Snail通路和AKT/GSK3β/β-catenin/MMP7通路,進(jìn)而通過(guò)CXCL5/CXCR2軸誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。目前有關(guān)CXCL5在卵巢癌中作用的研究較少,本研究證實(shí)在上皮性卵巢癌患者組織中低水平的CXCL5提示卵巢癌患者有產(chǎn)生鉑耐藥的可能。

人附睪蛋白4(HE4)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的生物標(biāo)志物,在檢測(cè)上皮性卵巢癌方面具有更高的敏感性和特異性,并且在疾病早期發(fā)展過(guò)程中比 CA125更早升高[14]。Lee等人[15]進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn),HE4 能夠激活ERK和AKT途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥,并且這與患者更差的預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,CXCL5在鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達(dá)水平與患者術(shù)前血清HE4水平有明顯相關(guān)性,且兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,這與既往研究基本一致。

中性粒細(xì)胞從脈管系統(tǒng)向腫瘤微環(huán)境的遷移主要由CXC趨化因子(如CXCL5)介導(dǎo),CXCL5從血管系統(tǒng)向組織招募并激活中性粒細(xì)胞,進(jìn)而殺死微生物和/或啟動(dòng)組織修復(fù)重塑[16]。據(jù)報(bào)道,CXCL5的高水平與腫瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)[17]。本研究中,CXCL5在鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達(dá)水平與患者NEUT水平有明顯相關(guān)性,且兩者呈正相關(guān)關(guān)系,這與以往的研究結(jié)果相符。

對(duì)于新輔助化療可否導(dǎo)致上皮性卵巢癌鉑耐藥這一問(wèn)題尚有爭(zhēng)議。Rauh Hain[18]等人研究發(fā)現(xiàn),新輔助化療導(dǎo)致患者術(shù)后發(fā)生鉑耐藥的機(jī)率增高。有學(xué)者在影響鉑耐藥相關(guān)因素的研究中發(fā)現(xiàn),患者的化療次數(shù)越多其發(fā)生鉑耐藥的風(fēng)險(xiǎn)越高[19]。這與本研究結(jié)果基本一致。有研究發(fā)現(xiàn)[20],卵巢癌術(shù)后發(fā)生鉑耐藥復(fù)發(fā)與臨床分期晚和組織分化程度的降低有關(guān),其原因可能是隨著組織分化程度的降低,癌細(xì)胞更容易發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移;隨著臨床分期的推遲,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)脫落,造成腹盆腔種植轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明,CXCL5在FIGO分期晚、組織學(xué)分化低的鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達(dá)水平較低,這與既往研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),CXCL5在≥500ml腹水量的鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達(dá)明顯低于<500 mL腹水量的患者。有大量證據(jù)表明,至少三分之一的卵巢癌癥患者腹腔積聚的惡性腹水有助于腫瘤細(xì)胞增殖、進(jìn)展、化療抵抗和免疫逃避,促進(jìn)疾病在腹部的轉(zhuǎn)移,這往往提示著預(yù)后不良[21]。

綜上所述,鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中CXCL5的低表達(dá)與新輔助化療、總化療次數(shù)、HE4、NEUT、PLT、FIGO分期、組織學(xué)分化程度、腹水量有關(guān)。提示CXCL5的低表達(dá)可能與上皮性卵巢癌鉑耐藥相關(guān)。近年來(lái),CXCL5的預(yù)后價(jià)值仍然存在爭(zhēng)議,到目前為止報(bào)道的大多數(shù)研究在離散的結(jié)果和樣本量方面都是有限的。本研究是回顧性的單因素分析研究,缺少動(dòng)物模型和細(xì)胞模型驗(yàn)證,會(huì)在一定程度上影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性,后續(xù)需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并拓展實(shí)驗(yàn)對(duì)研究成果進(jìn)行驗(yàn)證。