李亞楠， 韓非原， 王 文， 伍昊文綜述， 孫宏巍審校

卒中是導(dǎo)致殘疾和認(rèn)知缺陷的主要原因，占全球所有疾病死亡率的5.2%［1］，即使是卒中幸存者，大部分也需要依賴他人才能完成行走及其他日常活動(dòng)。在中國(guó)，卒中是成人致殘致死的第一位病因［2］?！吨袊?guó)腦卒中防治報(bào)告2019》報(bào)告指出，在我國(guó)所有疾病人群中至少有1/5的死亡率來(lái)自于卒中，且卒中的發(fā)病率持續(xù)上升，特別是缺血性卒中［2］。缺血性卒中約占全部卒中的80%，具有高致殘率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)，極大程度影響患者的生活質(zhì)量，給個(gè)人和國(guó)家?guī)?lái)沉重負(fù)擔(dān)。

雖然缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制仍模糊不清，但通常認(rèn)為缺血性卒中與環(huán)境因素、遺傳因素及其交互作用有關(guān)，其中遺傳背景相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)約占37.9%［3］。盡管關(guān)于缺血性卒中的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了卒中風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的不同基因座，但這些遺傳變異僅能解釋缺血性卒中5%～10%的遺傳風(fēng)險(xiǎn)［4］，這代表著很多缺血性卒中相關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素未被發(fā)現(xiàn)和重視，而表觀遺傳修飾就是其中之一。

1 表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化/去甲基化

1.1 表觀遺傳學(xué) 染色質(zhì)生物學(xué)是目前生物醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化研究中最令人興奮的領(lǐng)域之一。染色質(zhì)是由DNA、組蛋白和相關(guān)因子構(gòu)成的一個(gè)高度復(fù)雜且緊密盤繞的生物結(jié)構(gòu)。所有超越基因組學(xué)的修飾都被稱為表觀遺傳修飾。表觀遺傳修飾是康拉德·沃丁頓在1942 年提出的一個(gè)術(shù)語(yǔ)，旨在彌合遺傳學(xué)、生長(zhǎng)和分化之間的差距，可能是基因、環(huán)境和疾病之間的重要接口［5］。理論上來(lái)說(shuō)，推動(dòng)表觀遺傳改變的常見環(huán)境因素包括但不限于日常生活方式（如吸煙、飲酒）、重金屬（如鉛）的接觸和紫外線輻射等等。表觀遺傳調(diào)控可以在不改變DNA 序列的前提下進(jìn)行遺傳和修飾［4］，其中一些是穩(wěn)定的可以遺傳給后代的，另一些在環(huán)境因素的刺激下呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。表觀遺傳機(jī)制主要通過改變表觀遺傳密碼、調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)來(lái)操縱各種生理和病理過程。有3 種主要的表觀遺傳密碼已經(jīng)得到了很好的研究，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其中DNA 甲基化是最重要的表觀遺傳機(jī)制，已被深入研究［6］。

1.2 DNA 甲基化和去甲基化 Johnson 和Coghill在1925 年首次觀察到胞嘧啶殘基的甲基化，1975 年Holliday 和Pugh 提出胞嘧啶殘基的甲基化可以參與調(diào)控基因表達(dá)［7］。DNA 甲基化過程是在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的調(diào)控下，從S-腺苷甲硫氨酸等供體中將甲基轉(zhuǎn)移到基因上的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosine phosphate-guanine，CpG）中的胞嘧啶殘基上，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊密，轉(zhuǎn)錄機(jī)制無(wú)法接近，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。DNMT的3個(gè)核心成員（DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b），即維持酶和從頭酶［8］，在哺乳動(dòng)物中均有表達(dá)。最早的DNMT1 被稱為“維持甲基轉(zhuǎn)移酶”，因?yàn)樗梢允拱爰谆腄NA 堿基對(duì)發(fā)生甲基化，而DNMT3a 和DNMT3b 屬于從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，可使最初非甲基化的胞嘧啶發(fā)生甲基化。

近年研究者擴(kuò)展了DNA 甲基化的經(jīng)典觀點(diǎn)，認(rèn)為CpG可能不是哺乳動(dòng)物基因組中唯一的甲基化位點(diǎn)；此外DNA 主動(dòng)去甲基化的證據(jù)也對(duì)這種表觀遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性提出了質(zhì)疑。與DNA 甲基化相反，近期研究發(fā)現(xiàn)了DNA 去甲基化的機(jī)制，該機(jī)制通過10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白將5mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosin，5hmC）、5-甲酰胞嘧啶，逆轉(zhuǎn)5mC變?yōu)槲葱揎棸奏ぃ瑥亩コ谆?，?dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活和基因表達(dá)［9］。TET主要包括3 種亞型（TET1-3），均廣泛存在于大腦中［8］。除了通過TET 氧化5mC 脫甲基外，另提出了其他3種脫甲基化機(jī)制：（1）通過堿基切除修復(fù)將甲基化或氧化的堿基替換為非甲基化的胞嘧啶；（2）堿基切除修復(fù)后5mC 脫氨；（3）通過核苷酸切除修復(fù)去除5mC。

此外，DNA 甲基化還受到甲基-胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤結(jié)合域（methyl-CpG-binding domain，MBD）蛋白的調(diào)節(jié)。在MBD家族基因中，迄今為止已克隆出5個(gè)獨(dú)立的基因，即編碼甲基-CpG 結(jié)合蛋白2 和MBD1-4的基因［8］。MBD蛋白的重要作用之一是維持DNA 甲基化并與其直接作用，參與DNA 甲基化介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制和/或異染色質(zhì)形成?？傊@些新進(jìn)展證明了我們對(duì)DNA 甲基化呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的更深理解。

2 DNA 甲基化/去甲基化調(diào)控缺血性卒中的研究進(jìn)展

2.1 DNA 甲基化/去甲基化與卒中的發(fā)生近年來(lái)，DNA 甲基化在缺血性卒中發(fā)病機(jī)制中的作用得到重視［10，11］。各項(xiàng)基礎(chǔ)研究也致力于闡明DNA甲基化與卒中發(fā)生的機(jī)制。總體來(lái)說(shuō)，在缺血性卒中動(dòng)物模型中，DNA甲基化的整體水平升高，并且與大腦中DNMT 的較高活性相關(guān)。Hu 等［12］發(fā)現(xiàn)，血栓反應(yīng)蛋白1 是一種血管生成抑制因子，參與調(diào)節(jié)血小板的聚集和腦梗死的發(fā)生，在體外缺血模型中血栓反應(yīng)蛋白1 基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了高度甲基化。另外，血栓調(diào)節(jié)蛋白是一種表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面的膜蛋白，有抗凝血特性，對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。血栓調(diào)節(jié)蛋白啟動(dòng)子區(qū)的DNA 超甲基化與同型半胱氨酸水平升高、內(nèi)皮損傷和卒中風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［13］。

臨床研究發(fā)現(xiàn)高水平的血漿同型半胱氨酸是缺血性卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，胱硫醚β 合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）是同型半胱氨酸代謝過程的主要酶。Wang 等［14］描述了CBS 啟動(dòng)子區(qū)的DNA 高甲基化與人群卒中風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。CBS 啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可能導(dǎo)致酶活性降低、血漿同型半胱氨酸升高和卒中易感性增加。此外，血脂異常也是缺血性卒中的危險(xiǎn)因素，載脂蛋白E 是一種參與脂質(zhì)代謝的血漿脂蛋白，研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)會(huì)影響腦梗死的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［15］。利鈉肽系統(tǒng)被認(rèn)為是缺血性卒中的重要調(diào)節(jié)因子，研究證實(shí)4個(gè)利鈉肽系統(tǒng)基因的DNA 甲基化下調(diào)與缺血性卒中發(fā)生相關(guān)［16］。

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性卒中的重要病因。有趣的是研究發(fā)現(xiàn)小鼠模型的頸動(dòng)脈血流受到干擾時(shí)，DNMT 活性會(huì)增加，而抑制DNMT 會(huì)降低動(dòng)脈粥樣硬化病變的風(fēng)險(xiǎn)［17］。內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的早期特征，幾項(xiàng)體外研究強(qiáng)調(diào)了DNA 甲基化在內(nèi)皮功能障礙中的關(guān)鍵作用［18］。此外，研究表明血管細(xì)胞黏附蛋白1 的高表達(dá)可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，LINE基因的低甲基化會(huì)誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附蛋白1 表達(dá)增加，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，增加缺血性卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［19］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的血管中，與血管生成和炎癥相關(guān)的基因的甲基化CpG 島的水平明顯下降，這些變化導(dǎo)致叉頭盒蛋白P1（forkhead box protein P1，F(xiàn)OXP1）的下調(diào)、晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）受體配體的上調(diào)以及 NOTCH1 和表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域 7（epidermal growth factor-like domain 7，EGFL7）的激活而它們是已知的參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要因子［17］。

2.2 DNA甲基化/去甲基化與卒中的治療 小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后，大腦整體DNA 甲基化水平上升，這與DNMT活性增加有關(guān)，應(yīng)用DNMT 抑制劑減輕了卒中的嚴(yán)重程度，延遲了缺血性腦損傷。Nandan 等［20］發(fā)現(xiàn)DNMT 抑制劑治療通過上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitors metalloproteinases-2，TIMP-2）的表達(dá)來(lái)預(yù)防腦梗死后發(fā)生的線粒體功能障礙而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Endres 等研究發(fā)現(xiàn)在大腦中動(dòng)脈閉塞模型中，野生型（DNMT+/+）小鼠的DNA 甲基化水平顯著增加，而轉(zhuǎn)基因DNMT S/+小鼠則沒有顯示任何變化。大腦中動(dòng)脈閉塞后的梗死體積和活細(xì)胞數(shù)的分析表明DNMT S/+小鼠的梗死體積減小和活細(xì)胞數(shù)增加。此外，在大腦中動(dòng)脈閉塞的野生型（DNMT +/+）小鼠中，用5-氮雜-脫氧胞苷（5-aza-dC，一種DNMT 抑制劑）治療后觀察到病變體積減?。?1］。另一種DNMT 抑制劑zebularine 在小鼠缺血性腦損傷實(shí)驗(yàn)中也被證實(shí)可以減輕腦水腫和血腦屏障的通透性，改善神經(jīng)功能缺損［22］。近年研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可以下調(diào)DNMT1 和DNMT3a 的表達(dá)，降低DNA 甲基化水平，對(duì)缺血再灌注損傷呈現(xiàn)保護(hù)作用［23］。

新證據(jù)表明TET 和5hmC 可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。TET1保護(hù)神經(jīng)元免受活性氧和caspase-3依賴的神經(jīng)毒性，而TET1基因敲除動(dòng)物的神經(jīng)元對(duì)氧化損傷更敏感［24］。此外，TET2和5hmC耗竭會(huì)降低成年小鼠的神經(jīng)元存活率，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)受損和認(rèn)知功能下降，而重建TET2即可減輕老年大腦的認(rèn)知功能障礙［24］。同時(shí)，TET3在DNA損傷修復(fù)通路中發(fā)揮重要作用，可以觸發(fā)損傷后的軸突再生，從而促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶過程中的突觸可塑性［24］。最近的研究已經(jīng)確定抗壞血酸（維生素C）是一種表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，它通過激活TET 酶參與DNA 中5hmC 的生成。卒中后應(yīng)用抗壞血酸治療可提高TET3活性和5hmC水平，減少梗死面積，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能恢復(fù)［25］。

2.3 DNA甲基化/去甲基化與卒中的預(yù)后 DNA甲基化可能在卒中預(yù)后中發(fā)揮重要作用，尤其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種細(xì)胞的命運(yùn)至關(guān)重要?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸對(duì)缺血性卒中神經(jīng)發(fā)生的負(fù)面影響可能與DNA 甲基化有關(guān)。經(jīng)同型半胱氨酸處理的缺血腦組織中，DNMT 的活性降低，DNA 呈現(xiàn)低甲基化，神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力受到抑制，這說(shuō)明通過降低同型半胱氨酸水平來(lái)維持正常的DNA 甲基化，可能促進(jìn)卒中后神經(jīng)恢復(fù)和重建［26］。多項(xiàng)研究調(diào)查了DNMT 在突觸可塑性機(jī)制中的重要性，DNMT 缺陷小鼠表現(xiàn)出記憶障礙和海馬區(qū)突觸可塑性降低［27］。血小板分泌的血小板反應(yīng)蛋白1 是腦缺血期間誘導(dǎo)血管生成和神經(jīng)修復(fù)所必需的炎癥介質(zhì)，在卒中后恢復(fù)過程中DNA 甲基化誘導(dǎo)血小板反應(yīng)蛋白1 基因沉默會(huì)抑制神經(jīng)恢復(fù)，加劇卒中損傷［8］。

而在臨床研究中，基因甲基化與卒中預(yù)后的關(guān)系一直是研究熱門。Natalia 等［28］發(fā)現(xiàn)EXOC4基因（主要參與調(diào)控胞吐作用、細(xì)胞生長(zhǎng)胞質(zhì)分裂和神經(jīng)元發(fā)育等）的DNA 甲基化上調(diào)與卒中后較差的功能結(jié)局相關(guān)。一項(xiàng)研究對(duì)700 名卒中患者的表觀基因組關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行初步研究，分析了基因組中450 000 個(gè)CpG 島，發(fā)現(xiàn)了一些CpG 位點(diǎn)的缺失，會(huì)通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖等方式導(dǎo)致了卒中的不良預(yù)后［29］；而另一項(xiàng)研究測(cè)定了以DNA 甲基化為標(biāo)志的生物年齡與卒中患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［30］。最新一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)NPPB基因啟動(dòng)子的高甲基化與卒中患者住院14 d或出院時(shí)的良好功能結(jié)局相關(guān)［31］。以上研究均提示DNA甲基化與缺血性卒中預(yù)后密切相關(guān)。

2.4 DNA甲基化/去甲基化與卒中的康復(fù) 卒中會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期神經(jīng)功能缺損，因此卒中后的康復(fù)治療成為卒中患者的治療重點(diǎn)。卒中后任務(wù)導(dǎo)向訓(xùn)練對(duì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用眾所周知，但這種效果在一段時(shí)間內(nèi)是有限的。因此，同時(shí)進(jìn)行DNA 甲基化調(diào)控和任務(wù)導(dǎo)向訓(xùn)練，可以克服慢性期恢復(fù)的局限性。當(dāng)DNMT 抑制劑5-aza-dC 與任務(wù)導(dǎo)向訓(xùn)練一起使用時(shí)，卒中后運(yùn)動(dòng)功能受損程度顯著改善［32］。

生長(zhǎng)抑制和DNA 損傷誘導(dǎo)因子 45β（growth arrest and DNA damage inducible protein 45 β，Gadd45β），一種活性DNA 去甲基化調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)的去甲基化可能調(diào)節(jié)神經(jīng)的發(fā)生以響應(yīng)外部的損傷信號(hào)［33］。Gadd45b 缺失的小鼠海馬中神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和新生神經(jīng)元的樹突生長(zhǎng)均存在缺陷，可能與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)無(wú)法發(fā)生DNA 去甲基化，從而引起成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1 和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)下降有關(guān)［34］。

MBD1對(duì)成人神經(jīng)發(fā)生的研究表明，MBD1敲除小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育減少和基因突變?cè)黾樱?5］。海馬齒狀回在成年MBD1敲除小鼠中表現(xiàn)出神經(jīng)發(fā)生減少和空間學(xué)習(xí)受損［8］?？傮w而言，這些結(jié)果表明DNA 甲基化和去甲基化精確地協(xié)調(diào)了神經(jīng)的發(fā)生，對(duì)健康的神經(jīng)祖細(xì)胞和大腦活動(dòng)至關(guān)重要。然而，動(dòng)態(tài)DNA 甲基化在神經(jīng)發(fā)生中的作用的理解仍處于初級(jí)階段，還需深入研究。

2.5 DNA甲基化/去甲基化與卒中的復(fù)發(fā) DNA甲基化/去甲基化與缺血性卒中后血管事件的復(fù)發(fā)相關(guān)。多項(xiàng)研究旨在發(fā)現(xiàn)氯吡格雷治療的缺血性卒中患者血管復(fù)發(fā)相關(guān)的差異甲基化位點(diǎn)。Li等［36］發(fā)現(xiàn)GANQ基因的低甲基化與氯吡格雷治療的急性缺血性卒中患者缺血事件的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。另有研究報(bào)道ABCB1啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化與CYP2C19*1/*1基因型的中國(guó)缺血性卒中患者對(duì)氯吡格雷的不良反應(yīng)相關(guān)［37］。一項(xiàng)表觀基因組研究表明，在接受氯吡格雷治療的缺血性卒中患者中，TRAF3基因中cg03548645位點(diǎn)的低甲基化與血小板聚集增加和血管事件復(fù)發(fā)相關(guān)［38］。同一團(tuán)隊(duì)的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)［39］，在接受阿司匹林治療的患者中，PPM1A基因中cg04985020 位點(diǎn)的高甲基化與血管事件復(fù)發(fā)相關(guān)。Soriano 等［40］發(fā)現(xiàn)生物年齡（與年齡相關(guān)的DNA甲基化變化）是卒中復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，卒中復(fù)發(fā)患者的生物學(xué)年齡明顯高于無(wú)卒中復(fù)發(fā)的患者。

3 DNA 甲基化/去甲基化研究面臨的挑戰(zhàn)與對(duì)策

缺血性卒中患者的DNA 甲基化/去甲基化分析需要測(cè)試疾病的關(guān)鍵組織，但在實(shí)際研究中很難得到人類的腦組織樣本或人類的血管樣本。因此血液樣本仍然是進(jìn)行心腦血管疾病DNA 甲基化分析的良好選擇。因?yàn)檠簶颖竞苋菀撰@取，檢測(cè)的侵入性很小，而且缺血性卒中的癥狀雖然以腦功能受損為特征，但根本上是血管病變引起大腦血液供應(yīng)中斷所致，而與腦組織本身病變無(wú)甚相關(guān)。Liu 等［41］指出，卒中受試者血液中的ACTB基因甲基化水平較低，這表明血液可用于識(shí)別與卒中相關(guān)的DNA 甲基化分子的變化。

DNA 甲基化/去甲基化在卒中的應(yīng)用是一個(gè)新興研究領(lǐng)域，它似乎在缺血性卒中不同階段中起著重要作用，與卒中發(fā)生、治療、復(fù)發(fā)和功能結(jié)局密切相關(guān)。DNA 甲基化/去甲基化可以將卒中的環(huán)境刺激轉(zhuǎn)化為可逆的基因異常表達(dá)。但由于缺血性卒中病因的復(fù)雜性，目前研究還處于初級(jí)階段，未來(lái)需要更多的研究，更大的樣本量，更深入的國(guó)際合作探索缺血性卒中的DNA 甲基化/去甲基化變化和下游相關(guān)基因的表達(dá)，為研發(fā)調(diào)控DNA甲基化/去甲基化藥物的臨床轉(zhuǎn)化提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李亞楠負(fù)責(zé)文獻(xiàn)收集、撰寫文章、論文修改；韓非原、王文、伍昊文負(fù)責(zé)文獻(xiàn)收集；孫宏巍負(fù)責(zé)擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。