趙蓀琦，張明輝，高學(xué)軍

長江大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北荊州 434023

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種從土壤中分離的革蘭氏陽性桿狀細菌，被美國食品和藥物管理局（FDA）認可為GRAS（Generally recognized as safe）菌株。作為益生菌，枯草芽孢桿菌在動物飼料、水產(chǎn)養(yǎng)殖、植物病害防治等方面應(yīng)用前景廣闊，常作為飼料添加劑提高動物抗病力，改善動物腸道微生物平衡[1]。因其強大的蛋白質(zhì)分泌能力和完善的遺傳操作系統(tǒng)，近年來被廣泛應(yīng)用為生成外源蛋白的基層宿主。本文進一步介紹了枯草芽孢桿菌分泌系統(tǒng)、啟動子、質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)化方法，以及利用同源重組表達外源基因在畜牧業(yè)應(yīng)用的研究進展。

1 枯草芽孢桿菌表達與分泌系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌是目前背景最為詳細的革蘭氏陽性細菌之一，已成為基因工程菌的熱門。

1.1 表達系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的主要優(yōu)勢有：①屬于GRAS 菌株，無致病性；②細胞壁主要成分為肽聚糖和磷壁酸，不含有脂多糖，即內(nèi)毒素。在分泌蛋白時不會產(chǎn)生有害物質(zhì)；③抗逆性強，培養(yǎng)需求容易滿足，生長速度快；④有全基因組測序，遺傳背景清晰，無明顯的密碼子偏好，不會因稀有密碼子出現(xiàn)蛋白表達量降低、翻譯提前終止等問題；⑤擁有胞外蛋白分泌系統(tǒng)，能夠高效正確地表達外源基因。

目前枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)也存在一定缺陷：①枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細胞制備較為困難，轉(zhuǎn)化成功率低；②枯草芽孢桿菌會分泌大量蛋白酶，導(dǎo)致外源基因的產(chǎn)量下降。枯草芽孢桿菌產(chǎn)生至少8 種細胞外蛋白酶，有很高的降解異源分泌蛋白的傾向，導(dǎo)致目標產(chǎn)物的巨大損失。為了解決這一問題，人們通過滅活蛋白酶基因構(gòu)建了幾種胞外蛋白酶活性降低的枯草桿菌宿主，包括1A751、WB600、WB700、WB800 等；③部分外源蛋白在培養(yǎng)基中的分泌會影響枯草芽孢桿菌自身生長；④枯草芽孢桿菌存在的多種修復(fù)系統(tǒng)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降，易丟失[2]。

1.2 分泌系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌僅有一層細胞膜，分泌的蛋白質(zhì)無須轉(zhuǎn)位至周質(zhì)空間即可經(jīng)過細胞膜到達胞外。依據(jù)應(yīng)用分泌元件、翻譯轉(zhuǎn)運偶聯(lián)程度、切割信號肽酶等方面的不同，可將其分泌途徑分為4 種：Sec 轉(zhuǎn)運酶-SRP（Signal recognition particle)聯(lián)合操作途徑、雙精氨酸轉(zhuǎn)運（twin-arginine transport）、ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運子途徑和網(wǎng)絡(luò)蛋白（Pseudopilin）分泌途徑。

為了提高蛋白表達，人們開發(fā)了許多基因調(diào)控策略和表達系統(tǒng)，其中信號肽工程已成為近年來促進重組蛋白分泌的主要策略。研究表明，對相應(yīng)的信號肽或宿主細胞自身蛋白分泌系統(tǒng)進行篩選和改造，可以提高蛋白質(zhì)的分泌，優(yōu)化目的蛋白的生產(chǎn)[3]。

1.3 啟動子

用于生產(chǎn)異源蛋白的啟動子要求高強度，使得重組蛋白的產(chǎn)量更高。許多天然、人工啟動子已成功用于枯草芽孢桿菌中重組蛋白的表達，目前枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的啟動子有：P43、Pgrac、Pxyl、PspoVG、PbltD、PabrB、PBH4、PsrfA、Pveg、PserA、PymdA、PaprE、Pspac、PsacB、PT7、PyxiE等。

研究結(jié)果表明，雙啟動子可以進一步提高酶在枯草芽孢桿菌中的過表達。通過克勞桿菌堿性絲氨酸蛋白酶在枯草芽孢桿菌中篩選出的最優(yōu)啟動子PBsamy-PBaamy 雙啟動子，胞外酶活性達27860U/mL。

1.4 表達載體

目前枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中常用的表達載體有游離型質(zhì)粒載體和整合型質(zhì)粒載體。枯草芽孢桿菌常用的游離型質(zhì)粒有pHT43、pMA0911、pUB110、pLS1、pMAD、pE194、pAMβ1、pSB6、pTB19、pC194 等。

1.5 轉(zhuǎn)化體系

細菌細胞的人工轉(zhuǎn)化包括兩個過程：①獲得適應(yīng)外源DNA 的能力（感受態(tài)細胞）；②在特定刺激下將外源遺傳物質(zhì)吸收到細胞中。目前枯草芽孢桿菌常用的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化方法有：高滲透電穿孔法、SP 法、GM 法、EGTA 改良的低鹽環(huán)境饑餓法等[4]。

2 枯草芽孢桿菌同源重組

質(zhì)粒介導(dǎo)的重組蛋白在細菌中的生產(chǎn)是不穩(wěn)定的，尤其是在后期發(fā)酵過程中?；谌旧w整合的同源重組表達外源基因方法比基于質(zhì)粒的方法具有優(yōu)勢。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過染色體整合獲得的百菌清水解脫鹵酶（Chd）和甲基對硫磷水解酶（MPH）活性分別比質(zhì)粒介導(dǎo)表達的活性高300倍和5.3 倍。研究學(xué)者通過染色體整合ipaH 基因在枯草芽孢桿菌中成功表達，其表達出的異菌二酮水解酶（IpaH）活性高達213.26U/mL，比pet29a 質(zhì)粒介導(dǎo)的表達高21 倍。

2.1 整合載體

整合型質(zhì)粒載體通過攜帶外源基因表達片段插入到宿主菌染色體內(nèi)從而達到復(fù)制效果，可以保持外源基因的穩(wěn)定性。通常包含以下部分：大腸桿菌的復(fù)制子，抗生素抗性基因，可表達外源蛋白的目的基因，一或兩段上下游同源臂?？莶菅挎邨U菌整合型質(zhì)粒有：pMutin-GFP+、pSG1151、pSG1156、pDG364、pDG1664、pMutin4、pHY300PLK、pDL、pDK 等[5]。

2.2 整合位點

相關(guān)研究表明，基因在染色體上的位置會顯著影響基因的表達水平。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中，靠近復(fù)制起點的基因最大表達水平約是靠近復(fù)制終點基因的9 倍?？莶菅挎邨U菌中常用的基因插入位點有thrC、amyE、sacA、lacA 等。

2.3 影響因素

除整合位點外，同源重組的整合過程、整合效率和整合基因表達水平還受到諸多因素調(diào)控。雙交換整合的質(zhì)粒需要400 ～500bp 的同源臂長度來提高整合效率。研究學(xué)者分離鑒定了14 種不同的枯草芽孢桿菌DNA 修復(fù)和重組缺陷突變體，并對它們的染色體和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率進行比較。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MutS2 的缺失會導(dǎo)致質(zhì)粒和染色體DNA 的轉(zhuǎn)化效率降低，并通過實驗結(jié)果推斷MutS2可以促進枯草芽孢桿菌的同源重組。

3 枯草芽孢桿菌同源重組在畜牧業(yè)的應(yīng)用

通過生物技術(shù)表達外源基因可以使益生菌進行更多成分例如酶、抗菌肽、富含限制性氨基酸多肽、有益代謝產(chǎn)物等的高效表達，從而進一步提高畜禽生產(chǎn)效率。目前枯草芽孢桿菌同源重組在畜牧業(yè)的應(yīng)用尚處于起步階段，以下綜述了已有相關(guān)報道。

3.1 同源重組表達抗菌肽

抗菌肽作在畜牧業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景，其作為飼料添加劑不但可以提高生產(chǎn)性能、維持動物腸道健康，還可以在一定程度上代替抗生素。雖然抗菌肽具有很高的經(jīng)濟價值，但生產(chǎn)中存在產(chǎn)率低、提取工藝繁瑣等問題。外源表達技術(shù)具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、提取工藝簡單、易于獲得高產(chǎn)率等優(yōu)點，為提高抗菌肽的產(chǎn)量提供了有效途徑。

研究學(xué)者通過同源重組法構(gòu)建了異源表達桿菌肽生物合成操縱子的枯草芽孢桿菌菌株KE360，重組菌高水平合成了支鏈環(huán)肽抗生素桿菌肽（bacitracin），實現(xiàn)了NRPS 基因的外源表達。研究學(xué)者通過啟動子優(yōu)化、宿主菌株篩選和重組表達成功構(gòu)建了高效表達微球菌素MccJ25 和MccY 的枯草芽孢桿菌，且無抗生素耐藥標志物、無誘導(dǎo)劑、無孢子形成以及無內(nèi)毒素負面作用，可用于抗菌治療和食品保存。

3.2 同源重組表達代謝酶

外源性酶是目前公認的一類飼料添加劑，常用于家禽和豬的飼料配方，能減少抗營養(yǎng)因子的負面影響，改善飼糧成分的消化和動物性能。同時酶還能被應(yīng)用于解決畜牧業(yè)中抗生素使用增加、改善動物飼養(yǎng)環(huán)境等問題。

假單胞菌屬脂肪酶（Lipase）因具有其他微生物脂肪酶所沒有的生化特性而在脂肪酶應(yīng)用領(lǐng)域備受青睞，在畜牧業(yè)中有良好使用前景。張飛燕等（2017 年）從具有脂肪酶活性的銅綠假單胞菌中克隆LipA 基因，構(gòu)建整合表達質(zhì)粒pHSG398-16S-lipA 后整合到枯草芽孢桿菌pab02染色體上，獲得了重組菌pab02-lipA，脂肪酶蛋白得到了有效表達[6]。

異丙二酮是一種潛在的致癌化合物和內(nèi)分泌干擾物，在環(huán)境中難以降解。異丙二酮水解酶（IpaH）是一種高效的異丙二酮降解酶。研究學(xué)者成功構(gòu)建了無標記的工程菌株WB800-ipaH，并通過染色體整合表達方法實現(xiàn)了ipaH 在枯草芽孢桿菌中的胞外表達，能有效清除土壤中的異丙二酮殘留，改善動物飼養(yǎng)環(huán)境。

3.3 同源重組表達有益代謝產(chǎn)物

利用同源重組技術(shù)，可以使枯草芽孢桿菌表達色素、氨基酸、維生素等多種有益代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物不但可以作為飼料添加劑直接使用，還能夠改善畜牧環(huán)境，降低飼養(yǎng)成本，提高利用效率。

聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）可作為飼料添加劑提高動物對微量元素的吸收，減少其排泄物對環(huán)境造成的污染，在畜牧業(yè)具有潛在應(yīng)用價值。研究學(xué)者通過同源重組在ywtABC 基因上游區(qū)域引入了一段高效的合成表達控制序列，獲得了γ-PGA的枯草芽孢桿菌。

類胡蘿卜素具有生物活性和促進健康的特性，在飼料中具有良好應(yīng)用前景。在飼料中補充類胡蘿卜素不僅可以提高家禽的生產(chǎn)性能、提高機體免疫力，還能夠增強雞蛋和肉的質(zhì)量。Filluelo等（2023 年）[7]以質(zhì)粒pJOE8999 為媒介，通過同源重組的方法將枯草芽孢桿菌BsMN3 的sigX 基因替換成fpps 基因。重組菌能夠內(nèi)源產(chǎn)生C30 類胡蘿卜素，染色體整合crtMN 基因的過表達促進了C30 類胡蘿卜素的產(chǎn)生，F(xiàn)PPS 的過表達和分支途徑的減弱進一步提高了C30類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

番茄紅素在畜牧養(yǎng)殖中常作為飼料添加劑發(fā)揮其著色和抗氧化功能，同時還具有改善肉品質(zhì)、增加蛋黃營養(yǎng)和提高動物生長性能等功效。研究學(xué)者通過質(zhì)粒pCas 將番茄紅素合成基因EBI 插入到枯草芽孢桿菌WB800N 的染色體上，成功構(gòu)建了番茄紅素基因表達系統(tǒng)。

4 總結(jié)與展望

枯草芽孢桿菌作為益生菌的同時，其自然遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以通過同源重組將DNA 整合到基因組中，借此技術(shù)能夠表達多種在畜牧業(yè)有廣泛應(yīng)用前景的活性蛋白（酶）和有益代謝產(chǎn)物。諸多影響因素尚未研究透徹，更加高效穩(wěn)定的染色體整合體系建立仍有待進一步探索。目前枯草芽孢桿菌同源重組表達的外源基因多數(shù)是作為飼料添加劑來提高畜牧生產(chǎn)，更多地應(yīng)用前景尚待研究。

未來的研究可以從以下幾點出發(fā)：①建立有效的多基因同時插入體系，進一步提高畜牧有益產(chǎn)物的表達。目前枯草芽孢桿菌的多位點整合系統(tǒng)依賴于反復(fù)的質(zhì)粒構(gòu)建來將基因依次插入到宿主菌染色體中，操作繁瑣且耗時；②解析影響染色體整合的因素或機制，尋找新的高效同源重組表達整合位點以建立促進整合效率的環(huán)境體系，提高外源基因的整合與表達效率；③從資源環(huán)境、疾病防控、質(zhì)量安全和經(jīng)濟效益等多方面探尋更多促進畜牧生產(chǎn)的外源基因，利用同源重組進行高效表達。預(yù)期隨著枯草芽孢桿菌基礎(chǔ)研究的進步，其同源重組表達外源基因?qū)谛竽翗I(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮更重要的作用。