尹明秀 歐國進 陳劍 鳳婧 趙虹

1四川大學華西第二醫(yī)院檢驗科；2四川大學華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川成都 6100412

胎兒新生兒溶血?。╤emolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）是指因母嬰血型不合，母體針對與其不同的胎兒紅細胞血型抗原所產生的相應抗體經胎盤進入胎兒血液循環(huán)，導致胎兒或新生兒同種免疫性溶血引起的一系列臨床癥狀[1]。HDFN常導致早期流產，輕者出現(xiàn)胎兒或新生兒貧血、水腫、肝脾腫大，重者如果未經處理，可能導致胎兒重度貧血、嚴重的新生兒高膽紅素血癥與核黃疸甚至死亡[2-3]。ABO型新生兒溶血?。ˋBO-HDFN）是新生兒期最常見的疾病之一，是母體血液中產生的針對胎兒紅細胞的IgG免疫抗體通過胎盤進入胎兒血液循環(huán)發(fā)生同種免疫而引起的溶血。臨床上偶爾有IgG高效價抗-A（B）抗體引起嚴重的ABO-HDFN案例報道[4]，且有研究指出，O型孕婦IgG抗A（B）抗體效價與ABO-HDFN和高膽紅素血癥發(fā)生具有相關性[5]，隨著抗體效價的增高，ABO新生兒溶血病患病率增加[6]。

提高新生兒/臍帶血標本中紅細胞抗體陽性檢出率能更好地為臨床提供診斷依據(jù)，便于ABO-HDFN早期診斷與治療，降低其傷害。ABO-HDFN診斷依據(jù)主要為3項血清學試驗：直接抗人球蛋白試驗（DAT）、游離抗體試驗和紅細胞釋放試驗（即放散試驗）。DAT陽性不能完全診斷HDFN，放散試驗對新生兒ABO-HDFN的敏感度最高[7]，即放散試驗檢出抗體特異性是HDFN診斷的重要依據(jù)[8]。紅細胞釋放試驗方法種類多，常用方法包括物理放散法（如冷凍復融放散、45℃熱放散、56℃熱放散等）和化學放散法（如甘氨酸放散、氯喹放散等）。我室一直采用冷凍復融放散法作為常規(guī)紅細胞釋放試驗，其結果與臨床吻合度較高；但此方法因絕大多數(shù)紅細胞已被破壞，獲得的放散液顏色很深，后續(xù)只能進行試管法抗人球蛋白試驗來進行抗體檢測，該法需要多次洗滌細胞，操作步驟較多，結果判讀也易受檢測人員能力水平影響。傳統(tǒng)56℃熱放散法需要在孵育期間多次人工混勻，根據(jù)操作手法不同也會導致不同比例的紅細胞破壞，獲得的放散液也因顏色較深，后續(xù)抗體檢測用微柱凝膠卡法不便于觀察，最好進行試管法的抗人球蛋白試驗。而改良56℃熱放散法為上海市血液中心參比實驗室采用的試驗方法，此方法獲得的放散液僅輕微溶血，后續(xù)可采用微柱凝膠卡法，更好進行操作標準化。本文主要探究改良56℃熱放散和冷凍復融放散法對診斷ABO-HDFN是否存在差異，多方面探討其是否可作為實驗室的常規(guī)檢測方法。

資料與方法

1 一般資料

選擇2023年3月1日—2023年3月31日來我院就診疑似ABO-HDFN 的新生兒患者。其中絕大部分患兒母親血型為O型且父親血型為非O型，以及少部分在外院生產而因高膽紅素血癥轉入我院的新生兒，其父母ABO血型不一致的患兒。我院出生的新生兒采集EDTA抗凝臍帶血4mL進行檢測，若無臍帶血則采集患兒靜脈血3～4 mL進行EDTA抗凝。試驗期間共收集445例標本，其中非O型新生兒263例，排除4例存在ABO外抗體，2例標本量少不能完成試驗，1例血型抗原減弱，共有256例標本納入試驗和數(shù)據(jù)分析。

2 試劑與儀器

單克隆抗-A、抗-B-（江蘇力博醫(yī)藥生物技術股份有限公司），反定A1細胞、B細胞、抗體篩查細胞（西班牙Diagnostic Grifols 公司），ABO-Rh血型檢測卡、coombs卡（西班牙Diagnostic Grifols 公司），抗人球蛋白試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）和低離子液（珠海貝索生物技術有限公司），所有試劑均在有效期內。采用西班牙Grifols Erytra 全自動配血及血型分析儀、西班牙Grifols專用孵育器、西班牙Grifols專用離心機、日本久保田血清學離心機、安徽中佳低速離心機。

3 試驗方法

將血標本1 000×g離心5 min，參照臨床檢驗操作規(guī)程鑒定標本ABO及RhD血型?；颊哐獫{標本進行游離抗體試驗。取壓積紅細胞 2mL于潔凈玻璃試管，加入3～5 mL生理鹽水洗滌4～6次。將末次洗滌的生理鹽水棄盡得到洗滌紅細胞。用洗滌后的紅細胞進行DAT試驗和放散試驗，放散試驗同時采用冷凍復融法和改良56℃熱放散法。

3.1 游離抗體試驗

取Grifols Coombs卡標記1～3孔分別加入0.8%～1.0%標準A1細胞、B細胞和抗篩細胞50 μL，再加入患兒血漿25 μL于各孔，在Grifols專用孵育器孵育15 min后，于Grifols專用離心機離心9 min，觀察和判讀微柱凝膠卡結果。

3.2 直接抗人球蛋白試驗（DAT）

取上述洗滌紅細胞用生理鹽水配制0.8%～1.0%紅細胞懸液，加入50 μL于Grifols Coombs卡中，用Grifols專用離心機離心9 min后，觀察和判讀微柱凝膠卡結果。

3.3 冷凍復融放散試驗

取0.5 mL上述洗滌紅細胞與等量生理鹽水在試管中混勻，蓋上試管并旋轉試管將細胞涂覆試管壁上，將試管水平置于-80℃冰箱冰凍10 min后取出，在37℃水浴箱的融化5 min。1 000×g離心3 min得上清液即放散液，將放散液轉移到干凈試管中，并與紅細胞末次洗液做平行對照。隨后進行試管法抗人球蛋白試驗，即取2滴放散液、1滴3%～5%標準ABO細胞懸液、2滴低離子液，混勻，于37℃水浴15 min后，生理鹽水洗滌4～6次，末次去盡上清后于試管內加入單克隆抗IgG抗體1滴，1 000×g 離心 15 秒后，人工判讀試管法結果。

3.4 改良56℃熱放散試驗

取0.5 mL上述洗滌紅細胞加入等量生理鹽水制成50%紅細胞懸液，于56℃恒溫水浴箱中輕微震蕩1 min后，再孵育9 min（注：標準熱放散試驗為將試管置于56℃孵育10 min，期間定期攪拌試管）。取出后1 000×g離心3 min得上清液即放散液，將放散液轉移到干凈試管中，并于紅細胞末次洗滌的上清液做平行對照試驗。隨后進行微柱凝膠卡法抗人球蛋白試驗法，即取Grifols Coombs卡加入50 μL 0.8%～1.0%標準A1細胞/B細胞，再加入放散液50 μL。于Grifols專用孵育器孵育15min后，再用Grifols專用離心機離心9min，觀察微柱凝膠卡法結果。

4 結果判定

按照產品說明書，根據(jù)紅細胞聚集在凝膠卡凝膠帶上的位置判定陰陽性（陽性強度為±～4+，全部沉淀在凝膠卡底部為陰性）。

5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)數(shù)據(jù)采用比例（%）表示，組間比較進行χ2檢驗，等級資料比較進行非參數(shù)U檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 平行對照結果

冷凍復融放散法和改良56℃熱放散法均留取了末次洗滌的上清液作為平行對照，所有納入試驗的標本平行對照試驗結果均為陰性。

2 改良56℃放散法和56℃放散法結果比較

因冷凍復融放散試驗放散液為細胞破碎后所得，顏色為深紅色，加入微柱凝膠卡后，無法判讀結果，因此只能進行試管法抗人球蛋白試驗。而改良56℃熱放散試驗大部分細胞沒有破碎，所得上清液為淺紅色，可以直接加入微柱凝膠卡，進行卡法抗人球蛋白試驗。改良56℃熱放散試驗結果如圖1所示。

圖1 原56℃熱放散與改良56℃熱放散微柱凝膠卡法結果比較

同時對隨機4個樣本同時進行56℃放散法和改良56℃放散法，結果見圖1。由圖可以看出，末次洗滌上清液結果均為陰性，說明試驗結果可靠，原56℃放散液顏色很深（因為紅細胞已被破壞），而改良56℃放散液顏色更淺，更利于微柱凝膠卡判讀結果，且相同試驗條件下，改良56℃放散比原56℃放散法獲得的結果陽性程度更高。

3 改良56℃熱放散法微柱凝膠卡法結果圖示

冷凍復融放散試驗放散液為細胞破碎后所得，顏色為深紅色，加入微柱凝膠卡后，無法判讀結果，因此只能進行試管法抗人球蛋白試驗，不便于結果拍照保存。原56℃放散法有部分紅細胞破壞所得放散液顏色較深，微柱凝膠卡法抗人球蛋白試驗結果不便于觀察，一般也選擇試管抗人球蛋白試驗進行后續(xù)操作。而改良56℃放散法大部分微柱凝膠卡法細胞沒有破碎，得上清液為淺紅色，可以用微柱凝膠卡進行抗人球蛋白檢測。試驗結果對比如圖1所示，對于游離試驗強度為1+的2號標本，改良56℃放散法結果（凝集強度3+）比原56℃放散法結果（凝集強度1+）的放散效果更好。

4 兩種放散方法陽性檢出率比較

本試驗中，256例樣本中冷凍復融放散法的陽性率為64.45%，陰性率為45.55%。改良56℃放散法的陽性率為69.92%，陰性率為30.08%。兩種方法比較P值為0.188，大于0.05，說明兩種放散方法的陽性檢出率無統(tǒng)計學差異。具體結果如表1所示。

表1 兩種放散方法結果比較

5 兩種放散方法不同凝集強度結果比較

比較兩種方法檢出陽性標本的凝集強度±～4+，統(tǒng)計學方法得出P值為0.058，大于0.05，無統(tǒng)計學差異，具體結果如表2所示。

表2 兩種放散方法不同凝集強度結果比較

6 不同血型兩種放散方法結果比較

納入試驗的256例標本中，A型145例，B型109例，AB型2例，其中AB型的2例標本兩種方法檢測均為陰性。A型冷凍復融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為77.24%和80.69%，P值為0.471；B型冷凍復融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為51.38%和56.88%；P值為0.35。不同血型兩種方法的陽性率比較P值均大于0.05，兩種放散方法的陽性檢體結果如表3所示。

表3 不同血型兩種放散方法結果比較

7 不同直抗結果兩種放散方法結果的比較

本試驗中，直抗陰性一共197例。冷凍復融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為54.31%和60.91%，P值為0.185；直抗陽性一共59例，冷凍復融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為98.31%和100.00%，P值為0.315。不同直抗結果的P均大于0.05，故不同直抗結果兩種放散方法結果無統(tǒng)計學差異。具體結果見表4。

表4 不同直抗結果兩種放散方法結果的比較

8 不同游離抗體結果兩種放散方法結果比較

納入試驗的256例標本中，游離抗體陰性共88例，冷凍復融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為11.36%和17.05%，P值為0.280；游離抗體陰性共168例，冷凍復融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為92.26%和97.62%，P值為0.025，小于0.05，具有統(tǒng)計學意義，即當游離抗體陽性時，改良56℃放散法的陽性率高于冷凍復融放散法。具體結果見表5。

表5 不同游離抗體結果兩種放散方法結果的比較

討 論

母嬰血型不合是引起新生兒病理性黃疸的主要原因。有研究表明，母嬰ABO和Rh血型不合引起的HDFN中，ABO血型不相容占85.3%[9]，遠高于Rh血型系統(tǒng)，臨床上需要盡早診斷并開展治療，使疾病預后得到改善[10]，從而改善患兒的生存質量。紅細胞抗體釋放試驗是診斷ABO-HDFN最有力的證據(jù)，陽性結果表明患兒紅細胞被母體IgG抗A（B）抗體致敏。但放散試驗比一般輸血前檢查更加精密，更容易受到檢驗溫度、環(huán)境、操作規(guī)范等因素的影響[11]。

本試驗在相同環(huán)境下進行，且操作人員相同，兩種放散方法的陽性檢出率約65%，差異無統(tǒng)計學意義，說明兩種放散方法均適合用于檢測ABO-HDFN。兩種放散方法在不同凝集強度之間也不具有統(tǒng)計學差異，但存在細微差別。冷凍復融放散的凝集強度主要為±～2+，其中2+占比為41.2%，3+占比為10.3%；改良熱放散的凝集強度主要為1+～3+，2+陽性率為45.3%，3+陽性率為13.4%，說明改良熱放散法檢測效果更好更利于結果判讀。對于檢測不同血型樣本，A型、B型兩種方法的陽性率比較P值均＞0.05，說明兩種放散方法的陽性檢出率在不同血型上無統(tǒng)計學差異。但對不同血型陽性率進行分析我們可以看出，冷凍復融法A型和B型的陽性檢出率分別為77.2%和48.6%，改良熱放散法A型和B型的陽性檢出率分別為80.7%和56.9%，兩種放散方法A型的陽性率均遠遠高于B型，可能與紅細胞上A位點的抗原決定簇略多于B有關，同時A抗原免疫原性強于B抗原，更容易誘導機體產生免疫應答，這與MATTEOCCI[12]、朱潔好[13]等研究結果一致。該試驗中，不同直抗結果之間比較P值均＞0.05，得出不同直抗結果兩種放散方法結果無統(tǒng)計學差異。但我們可以看出，直抗陽性標本放散實驗檢出特異性抗體均＞98%，故直抗陽性不能直接確診發(fā)生了新生兒溶血??；直抗陰性標本中放散實驗檢出特異性抗體均＞54%，故直抗陰性不能直接排除未發(fā)生新生兒溶血病。兩種放散方法的比較結果均顯示改良熱放散陽性率稍高，但無統(tǒng)計學差異，提示加大檢測標本量可能比較出兩種方法的差異性。對游離抗體陰性和陽性時兩種方法陽性率進行比較分析可知，游離抗體陰性時冷凍復融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為11.36%和17.05%，驗證了游離陰性不能完全排除不存在ABO-HDFN；游離抗體陽性的標本檢測中，冷凍復融放散法和改良56℃放散法均有較高陽性率，分別為92.26%和97.62%，且二者存在統(tǒng)計學差異，說明此狀態(tài)下改良56℃放散法的陽性檢出率更高，漏檢率更低，具有更好的臨床診斷能力。比較原56℃放散法和改良56℃放散法可知，改良56℃放散法紅細胞被破壞較少，更適合用于微柱凝膠卡檢測，而原56℃放散法細胞破壞嚴重，放散液嚴重溶血，后續(xù)一般進行試管法的抗人球蛋白試驗來進行抗體檢測。

本研究在實驗設計細節(jié)有不足之處，凍融復融放散法中紅細胞完全溶解，由于壓積紅細胞和鹽水等量，壓積紅細胞中細胞質完全釋放后，相當于放散液被稀釋了1倍。因此比較合理的比對是1份熱放散液和2份凍融放散液的比對。此外，后續(xù)放散液的檢測，改良56℃熱放散液用微柱凝膠卡法、冷凍復融用試管抗人球蛋白法，兩種方法的靈敏度不同，使用的抗人球試劑有較大差異，可能影響兩種方法結果的比較。

兩種放散試驗對工作人員經驗有不同的要求，且試驗時間上存在差異。改良56℃熱放散試驗使用微柱凝膠卡法進行抗人球蛋白試驗，試驗結果的判讀可以根據(jù)說明書準確判斷，不存在人為差異；而冷凍復融放散試驗中只能進行試管法抗人球蛋白試驗，有研究指出，微柱凝膠卡法抗人球蛋白試驗的靈敏度要高于試管法，這種偏差可能是由于試管法測定血清抗體效價時需要反復清洗紅細胞，操作輔助，易受人為因素影響[14]。回顧整個放散試驗的過程，改良56℃熱放散試驗涉及幾個流程，總耗時長約35 min，標本量對整體工作時間影響不大。冷凍復融放散試驗涉及另外的固定流程，總耗時長大于40 min，因涉及樣本洗滌，所以標本量越大所需時間越長。兩種方法相比，冷凍復融放散法操作更為繁瑣和耗時，對工作人員能力要求更高，而且需要-80℃超低溫冰箱（注：根據(jù)本實驗經驗，-20℃冰箱冷凍時間達1 h才能達到-80℃冰箱冷凍10 min的相同效果）。和冷凍復融放散試驗相比，改良56℃熱放散試驗操作更簡便，人為因素影響較小，但需要配套的微凝膠Coombs卡、孵育器和離心機。大多數(shù)情況下，兩種方法的放散結果一致，不同實驗室可結合本實驗室情況綜合考慮和選擇。

早診早治HDN患兒可有效地控制病情進展并改善預后，縮短病程是最為重要的[15]。有研究表示新生兒溶血病檢出率在出生后3 d內最高，隨著日齡的增長，3項試驗陽性率會逐漸降低[16-17]，因此需要盡早送檢，做到早發(fā)現(xiàn)、早預防、早診斷、早治療，降低ABO-HDFN對新生兒的危害。

本研究通過多方面比較改良56℃熱放散法與冷凍復融放散法對于ABO-HDFN的診斷價值。各實驗室可結合臨床患者的緊急程度以及本實驗室的儀器設備、耗材配置、工作人員經驗和時間成本等綜合考慮，選擇適合本實驗室的方法，以助力臨床患者的診療，保障患兒生活質量安全。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突