劉鴻 莫琴 馬榮鈉 賈堯 伍曉菲 王迅

上海市血液中心，上海 200051

血液和血液成分的輸血傳播細菌感染（transfusion-transmitted bacterial infection，TTBI）和膿毒性輸血反應（septic transfusion reactions，STRs）是感染性輸血疾病的主要原因[1]。雖然血漿由于其凍存的環(huán)境并不利于細菌生長，因此被認為存在細菌污染的風險較小，然而血漿在制備和處理的過程中仍可能被細菌污染，如有研究發(fā)現(xiàn)在水浴箱中凍融后的血漿被檢出受到銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）的污染[2-3]，此外，F(xiàn)DA也曾在2016年報告過一起治療性血漿置換（單采血漿）被凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci）污染導致受血者死亡的案例，因此受細菌污染的血漿仍可能成為受血者感染的載體[4]。

目前應對血液和血液成分細菌污染風險的措施包括但不限于手臂消毒、初血分離、細菌培養(yǎng)、快速檢測、病原體滅活技術的應用等[1]。其中，病原體滅活技術（pathogen reduction technology，PRT）如核黃素光化學病原體滅活系統(tǒng)經(jīng)驗證可滅活包括血漿和血小板中的多種輸血傳播病毒、致病菌和寄生蟲[5，6]；采用病原體滅活技術不僅可以彌補血站現(xiàn)有檢測方法的缺陷，如潛在假陰性，檢測靈敏度低等問題，其也為應對一系列已知和未知的新發(fā)病原體提供了一種積極主動的預防策略[7]，這對提高血液安全和維持安全可靠的血液供應都有著重要的意義。然而，我國目前尚無自主知識產(chǎn)權的針對血液成分細菌污染的病原體滅活技術，而國外商品化的病原體滅活系統(tǒng)成本高昂。因此，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的血液成分病原體滅活系統(tǒng)就顯得尤為重要。而本研究嘗試以420 nm可見光為光源，以血液中常見的污染細菌大腸桿菌作為指示菌，血漿作為介質載體，對不同核黃素濃度與可見光光照強度對血漿中大腸桿菌的影響進行探討，以明確兩者與處理效果間存在的量效關系，從而為未來建立更完善的實驗條件和有效性的評估提供更多數(shù)據(jù)支撐。

材料與方法

1 標本來源

隨機抽取分裝的谷氨酸氨基轉移酶（ALT）檢測不合格的新鮮冰凍血漿作為實驗樣本，本研究涉及的所有樣本均來自本血站的無償獻血者。本研究獲本中心倫理審批（編號：SBC-IRB-2022-24）。

2 試劑與儀器

核黃素（美國Sigma-Aldrich公司，批號：60K0021）；大腸桿菌（ATCC 25922）（Culti-Loops，美國Thermo Scientific公司，批號：348289，美國KwikStik公司，批號：335-557-21）；LB肉湯培養(yǎng)基（上海生工生物公司，批號：I113KA3288）；瓊脂粉（上海生工生物公司，批號：I701BA0001）； 一次性大腸桿菌培養(yǎng)皿（上海生工生物公司，批號：I505LA2421）；Costar 12孔細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司，批號：26421043）；一次性PVC血袋（上海輸血技術公司，批號：181229）；塑料透光擴散板（京棣工品公司）；0.22 μm無菌濾器（冰島Millipore公司，批號：R0NB16650）；15 mL無菌離心管（美國Corning公司，批號：26421043）；10 mL無菌注射器（上海康德萊公司，批號：K20210103）；一次性涂布棒（美國Biologix公司，批號：MO002890B1203）；420 nm病原體滅活箱改裝自上海輸血技術公司，含商業(yè)性420 nm LED燈珠）；紫外輻照儀計（北京師范大學光電儀器廠）；孵育箱（日本松下公司）；生物安全柜（蘇州賽默飛世爾公司）；離心機（德國Eppendorf公司）。

3 方法

3.1 透光率測量

使用420 nm輻照儀檢測病原體滅活箱中LED燈珠的輻照強度，隨后將測試材料置于LED燈珠中央，使用420 nm 輻照儀貼于測試材料正對LED燈珠的位置檢測透光后的輻照強度，每個材料檢測各3次，通過計算材料透光后的平均輻照強度與LED燈珠自身的平均輻照強度百分比比值得出透光率。

3.2 核黃素儲存液制備

精確稱量9.41 mg核黃素溶于25 mL0.9%生理鹽水中，并用無菌濾器過濾，配制成1M的核黃素儲存液，儲存瓶使用錫箔紙包裹，置于4℃冰箱保存。

3.3 大腸桿菌培養(yǎng)

將大腸桿菌（ATCC 25922）原菌接種于LB固體培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后挑取完整的單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中37℃振蕩過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后離心菌液并用生理鹽水重懸，取少量菌懸液培養(yǎng)以確定原始菌液濃度不低于107CFU/mL。

3.4 實驗分組與光照處理

按照處理方式將實驗分為三大類：第一類為只添加菌液但不做任何處理的對照組，第二類為只添加菌液并接受光照處理的光照組，第三類為添加菌液與核黃素并接受光照處理的實驗組。其中實驗組根據(jù)核黃素濃度又可細分為4個小組，即50、100、150和300 μM的核黃素濃度組，加上對照組和光照組共6組，每組樣本數(shù)為1人份。光照處理前，從光照組和各核黃素濃度組的血漿混懸液中取1 mL樣本加入12孔板并置于病原體滅活箱中分別接受420 nm可見光的光照處理，每輪光照的光照強度分別為50 mW/cm2、75 mW/cm2和100 mW/cm2，光照時間為55分鐘（分別在25、35、45和55分鐘取樣檢測）。

3.5 處理后大腸桿菌的檢測

從各組樣品中取0.1 mL加入0.9%生理鹽水進行梯度稀釋，稀釋至10-6，每個梯度取100 μL稀釋菌液涂布在LB平板上，并置于37℃孵育箱培養(yǎng)過夜后菌落計數(shù)。所有實驗均重復5次（n=6）。

3.6 評估光照強度對大腸桿菌處理效果的影響

根據(jù)在各核黃素濃度下，不同光照強度對大腸桿菌在各時間段中的下降情況建立時間-效果曲線，評估光照強度與大腸桿菌處理效果的相關性。

3.7 評估核黃素濃度對大腸桿菌處理效果的影響

根據(jù)在各光照強度下，不同核黃素濃度對大腸桿菌各時間段中的下降情況建立時間-效果曲線，評估核黃素濃度與大腸桿菌處理效果的相關性。

4 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 7軟件統(tǒng)計結果，數(shù)據(jù)以菌落數(shù)的平均值±標準差表示。實驗組與光照組中各核黃素濃度與光照強度對細菌處理效果是否存在顯著差異采用單因素方差分析，各因素與處理效果間的關系用Pearsons相關分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 420 nm可見光的基本參數(shù)和對不同材料的透光情況

病原體滅活設備的光源經(jīng)過專業(yè)設計和光譜檢測，經(jīng)驗證，該光源在420 nm處有一個明顯的吸收峰，因此符合實驗的要求[8]。實驗前對420 nm可見光對不同材料的透光情況進行評估后發(fā)現(xiàn)（表1），培養(yǎng)皿和12孔板對420 nm可見光的透過率超過95%，因此以12孔板作為血漿光照處理的儲存容器，血漿在12孔板中的液層厚度保持在約5 mm，照射期間勻速振蕩，確保獲得均勻光照。

表1 420 nm可見光透光率情況

2 不同光照強度下各核黃素濃度對血漿中大腸桿菌的處理效果

血漿中的大腸桿菌在接受不同強度光照處理55 min后，各核黃素濃度下血漿中的大腸桿菌濃度均出現(xiàn)了不同程度的下降，下降梯度分別為1.7～3.5 log（50 mW/cm2），2.8～≥4.4 log（75 mW/cm2），4.0～≥4.7 log（100 mW/cm2），其中300 μM的核黃素濃度在各光照強度下都顯示出至少＞3 log的處理效果（圖1）?？傮w來看，不同光照強度之間對大腸桿菌的處理效果存在顯著性差異（F=16.39，P＜0.000 1），其中在50，100和150 μM核黃素濃度下，高強度的光照（100 mW/cm2）對大腸桿菌的處理效果要顯著高于低強度的光照（50 mW/cm2）（P＜0.05）。而不同的核黃素濃度組之間對大腸桿菌處理效果也存在顯著性差異（F=4.06，P=0.004 9），其中，在低強度光照下（50 mW/cm2），300 μM核黃素濃度對大腸桿菌的處理效果要顯著高于50 μM核黃素濃度（P＜0.05）（圖1）。

圖1 血漿中各核黃素濃度的大腸桿菌在接受不同光照強度光照處理55 min后的下降情況比較（n=6）

3 不同光照強度隨時間變化對大腸桿菌的影響

通過對上述實驗結果進行分析后發(fā)現(xiàn)，各組中接受光照處理的大腸桿菌下降梯度都隨著光照時間的增加而升高，而在各核黃素濃度處理下，不同的光照強度對大腸桿菌的影響也各不相同。高強度的光照（100 mW/cm2）與低強度光照（50 mW/cm2）相比，大腸桿菌的梯度下降更快，兩者在150 μM核黃素濃度處理光照35 min時對大腸桿菌的處理效果最大差異可達2.72 log（圖2）。

圖2 各核黃素濃度下不同光照強度在各時間段對大腸桿菌的影響

相關性分析顯示在各核黃素濃度下，光照強度與血漿中的大腸桿菌處理效果間呈較強的正相關（r2=0.45～1.00）（P=0.003 1～0.53）（圖3）。

圖3 各核黃素濃度下不同光照強度與大腸桿菌處理效果間的關系

4 不同核黃素濃度隨時間變化對大腸桿菌的影響

在特定光照強度下，不同核黃素濃度對大腸桿菌的處理效果也隨著光照時間的增加而增加，其中高濃度核黃素（300 μM）較低濃度核黃素（50 μM）對大腸桿菌有更好的處理效果，其在75 mW/cm2光照45分鐘時兩者對大腸桿菌處理效果上的差異可達2.22 log（圖4）。

圖4 各光照強度下不同核黃素濃度在各時間段對大腸桿菌的影響

相關性分析顯示在50 mW/cm2和75 mW/cm2的光照強度下，核黃素濃度與血漿中的大腸桿菌處理效果間呈正相關（r2=0.84和0.66，P=0.084和0.19），而在100 mW/cm2高光照強度下，兩者則無明顯相關性（r2=0.01，P=0.87）（圖5）。

圖5 不同光照強度下核黃素濃度與大腸桿菌處理效果間的關系

討 論

核黃素是一種多環(huán)平面結構的芳香族化合物，其有四個吸收峰，其中三個在紫外光波段，1個在可見光波段。當核黃素在符合其吸收峰的范圍內受到光照能最大程度上激發(fā)其光化學反應，并通過反應中所產(chǎn)生的電子轉移和氧化作用對病原體的核酸造成不可逆的損傷，從而阻止其復制和轉錄，達到滅活病原體的目的[10-11]。而紫外光因其良好的病原體滅活特性和熟知度而被廣泛應用，如國外已投入應用的Mirasol病原體滅活系統(tǒng)主要依賴核黃素結合廣譜紫外光（265～370 nm）對病原體進行滅活。然而由于紫外光攜帶更高的光子能量，其在對病原體產(chǎn)生更強殺傷的同時也會對血液成分的功能和質量產(chǎn)生負面影響[12-13]。此外，紫外光對塑料制品和碳氫化合物裝置的破壞也是不可忽略的問題之一[14-15]。因此，考慮使用可見光作為另一種替代光源或許可以在一定程度上彌補紫外光在這些方面所存在的短板。以420 nm可見光為例，其同樣處在核黃素的吸收峰之中，在被光照激活后有著和紫外光相似的光化學反應和光照產(chǎn)物[16]；其在病原體滅活方面也有著不俗的表現(xiàn)，已有研究證實可見光可有效滅活鼠白血病病毒（MLV），HBV，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌等病原體[17-20]；另外可見光本身發(fā)射的能量較小，有助于減小對血液成分的影響[21]。因此，這些優(yōu)勢和實驗基礎為本研究的開展提供了理論支持。

根據(jù)核黃素結合紫外光實驗方法建立的相關研究發(fā)現(xiàn)，可能影響血液成分病原體處理效果的因素有包括光照強度、光照時間、核黃素濃度、細菌種類和濃度等[22-24]，這為本研究的設計提供了方法指引。為了更好地了解不同條件對核黃素可見光處理效果的影響，本研究主要對光照強度、光照時間、核黃素濃度進行重點研究，結果證實核黃素結合420 nm可見光對血漿中的大腸桿菌有一定的處理效果，綜合來看，高強度的光照（100 mW/cm2）協(xié)同高濃度的核黃素（150 μM和300 μM）能夠有效降低血漿中大腸桿菌的濃度達到4 log以上。根據(jù)時間效果曲線的分析，光照強度對大腸桿菌的處理效果有著重要影響，在同一核黃素濃度處理組中，接受高強度的光照處理在各時間點相較于低強度光照大腸桿菌梯度下降速度更快，濃度差異更大，而在較高的核黃素處理組中，這種差異更為顯著，最大差異可達到2 log以上。相關性分析也證實光照強度與大腸桿菌的處理效果間存在明顯的正相關，即大腸桿菌的處理效果伴隨著光照強度的增加而增強。另一方面，核黃素濃度對大腸桿菌的處理效果也有一定的影響，不過這種影響范圍較窄，主要體現(xiàn)在高濃度的核黃素處理組（150和300 μM）中，在部分時間段高濃度與低濃度核黃素對大腸桿菌處理效果上的差異也可達到2 log以上。進一步分析證實核黃素濃度與大腸桿菌的處理效果也存在一定相關性，雖然100 mW/cm2的高光照強度中并未體現(xiàn)出這一相關性，其原因可能是除了核黃素以外，其他物理因素如光照產(chǎn)生的熱量也對大腸桿菌產(chǎn)生了影響。值得注意的是，在一些紫外光協(xié)同核黃素的相關研究中，50μM以上濃度的核黃素對VSV的影響很小，這與本研究中可見光協(xié)同核黃素的結果存在矛盾，推測這可能是因為紫外光的穿透力較差，而過量核黃素會阻止紫外線穿透至液體溶液的深層[25]，而可見光相較于紫外光有著更強的穿透力，因此能使更高濃度的核黃素發(fā)揮其病原體滅活的作用。

因此，根據(jù)目前的實驗條件和數(shù)據(jù)，高強度光照協(xié)同高濃度核黃素在420 nm可見光的光照處理后可有效降低血漿中的大腸桿菌達4 log以上，這為今后進一步評估和完善病原體滅活方法的有效性，以及開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的核黃素光化學病原體滅活技術提供了一定的理論依據(jù)。該研究也存在一些局限性，首先研究中僅使用大腸桿菌作為實驗菌，尚未評估該方法對多種細菌的處理效果；其次，目前尚未對血液成分的功能影響進行深入研究，根據(jù)周子瑜等人[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在使用400～500 nm可見光對添加了1 500μM核黃素的含有HBV病毒的紅細胞進行光照處理后能夠顯著降低病毒DNA拷貝數(shù)。同時，也未發(fā)現(xiàn)其對紅細胞的功能產(chǎn)生顯著影響，而其他相關研究也顯示，接受405 nm可見光光照（無核黃素）5 h后的血小板雖然出現(xiàn)代謝變化（葡萄糖降低，乳酸增加）和線粒體呼吸功能的降低（基礎呼吸，ATP產(chǎn)量，最大呼吸），不過都處在可接受范圍，且可通過添加抗氧化劑改善血小板的線粒體狀態(tài)[26]，這些積極的結果為后期的功能研究提供了良好的實踐基礎。最后，其他可能影響大腸桿菌處理效果的因素如細菌濃度、細菌種類、液面厚度、光照距離等并未納入本次研究的考量范圍，有必要進行進一步的深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突