姜明賀,張 鼎,朱歡歡,李方存,李麗琴,宋晨曦,陳 煒,胡躍強(qiáng)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

癡呆是一種不可逆性的疾病,可導(dǎo)致進(jìn)行性認(rèn)知能力下降,已經(jīng)成為主要的健康問題之一[1]。血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆病因[2]。雖然VaD的病因病理機(jī)制尚不清楚,但主要聚焦于神經(jīng)血管單位破壞、膽堿能功能退化、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞等諸多因素[3]。慢性腦灌注不足引起的線粒體功能障礙可導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)大量活性氧蓄積,進(jìn)而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路[4]。同時(shí),ERS是通過激活未折疊蛋白反應(yīng)來維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部的細(xì)胞穩(wěn)態(tài),且持續(xù)性的ERS能夠激活下游蛋白,如胱天蛋白酶-12、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)等,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。最新證據(jù)顯示,當(dāng)抑制VaD大鼠腦內(nèi)的ER應(yīng)激反應(yīng)可以有效改善其認(rèn)知障礙[6]。因此,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是VaD發(fā)生發(fā)展過程中的一項(xiàng)重要因素。

血管性癡呆在中醫(yī)學(xué)中并無專屬病名,然而根據(jù)其臨床表現(xiàn),中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“呆病”范疇。歷代醫(yī)家多以心血虧虛、腎精不足以致腦竅失榮論治,故在治療上多以補(bǔ)益心腎為主。本團(tuán)隊(duì)提出“從肺治腦”的理論,創(chuàng)制溫肺降濁方,施于臨床療效較好。前期的基礎(chǔ)研究顯示,該方具有抗氧化、抗凋亡和調(diào)節(jié)免疫作用,且溫肺降濁方可改善VaD大鼠的認(rèn)知障礙,對(duì)老年性大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[7-9]。然而,溫肺降濁方是否參與了沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)/ERS通路對(duì)VaD的保護(hù)作用尚不清楚。因此,提出溫肺降濁方能夠通過調(diào)節(jié)SIRT1/肌醇需求酶1α(Inositolrequiring enzyme 1α,IRE1α)/剪接型X-盒結(jié)合蛋白1(Spliced X-box binding protein 1,XBP1S)/CHOP信號(hào)通路來改善大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的假設(shè),探討其改善認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制,為后續(xù)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠,購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)(SCXK湘2019-0004)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)編號(hào)DW20230425-105。

1.1.2 主要試劑和儀器:無水乙醇(批號(hào)10009218);二甲苯(批號(hào)10023418);蘇木精(批號(hào)H9627);伊紅Y(批號(hào)71014544);中性樹膠(批號(hào)10004160);SIRT1抗體(批號(hào)ab62352);IRE1α抗體(批號(hào)ab125066);XBP1s抗體(批號(hào)ab227828);CHOP抗體(批號(hào)ab179800);彩虹180廣譜蛋白Marker(批號(hào)PR1910);顯微鏡(型號(hào)BX53,日本奧林巴斯公司);PCR梯度基因擴(kuò)增儀(型號(hào)SCI1000-G,美國(guó)賽洛捷克公司);小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號(hào)1658033,美國(guó)伯樂公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備和分組:適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠2周,體重保持在(250±30) g左右,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溫肺降濁方低劑量組、溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組,每組6只大鼠。大鼠通過雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎建立VaD模型大鼠,具體操作為40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,經(jīng)頸部正中切開,暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,輕輕分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng),用6-0號(hào)絲線結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈并剪斷。假手術(shù)組只暴露動(dòng)脈不進(jìn)行結(jié)扎和剪斷。整個(gè)手術(shù)過程操作輕柔,減少觸碰迷走神經(jīng),術(shù)后用加熱毯維持大鼠體溫。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品及制備:溫肺降濁方由制附子(先煎)20 g,黨參 15 g,干姜、田七、酒大黃各10 g,炙甘草 6 g組成。所有藥物購買于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房,本方分兩次煎煮,取汁200 ml,加熱濃縮至含有原藥材1.5 g/ml。尼莫地平片(批號(hào)211274)。

1.2.3 動(dòng)物給藥:手術(shù)后4周開始給藥,模型組、假手術(shù)組予以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,西藥組給予尼莫地平20 mg/(kg·d),溫肺降濁方低劑量組、溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組分別予以溫肺降濁湯3.75、7.5、15 g/(kg·d)灌胃給藥,持續(xù)4周。

1.2.4 Morris水迷宮試驗(yàn):給藥4周后,采用Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)估大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮試驗(yàn)的設(shè)備由一個(gè)黑色圓形池、一個(gè)逃生平臺(tái)和記錄系統(tǒng)組成,圓形池中加入無毒黑色墨水,加熱使水溫保持在(23±1) ℃,將圓形池分成四個(gè)相等的象限。將逃生平臺(tái)放置在目標(biāo)象限中心的水面以下2 cm處。定位航行試驗(yàn)中,大鼠每天從4個(gè)不同的位置被釋放,持續(xù)5 d。記錄大鼠逃避潛伏期和總路程。每個(gè)象限測(cè)試時(shí)間為60 s。若大鼠成功登臺(tái),停留15 s,未成功登臺(tái)則人工引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)停留20 s。第6天進(jìn)行空間探索試驗(yàn),取出逃生平臺(tái),將平臺(tái)所在象限設(shè)為目標(biāo)區(qū),從目標(biāo)區(qū)對(duì)側(cè)象限將老鼠放入水中,自由游動(dòng)60 s,記錄大鼠在目標(biāo)象限上的停留時(shí)間、原始平臺(tái)位置的穿越次數(shù)。

1.2.5 HE染色和尼氏染色:水迷宮測(cè)試結(jié)束后進(jìn)行取材,取材前各組大鼠禁食禁水24 h,用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔過量麻醉后,每組取3只大鼠,進(jìn)行心臟灌注,立刻斷頭取腦,用4%多聚甲醛溶液浸泡24 h,然后用石蠟包埋,制作3 mm厚的切片。脫蠟后,進(jìn)行HE染色和尼氏染色,最后用中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織形態(tài)。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達(dá)水平:總RNA嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說明提取,微量分光光度計(jì)測(cè)定OD值,計(jì)算RNA的純度和濃度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件為42 ℃、2 min,50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增程序分為兩步95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸45 s。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算最終mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由武漢伯韜生物科技有限公司合成,引物序列,見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測(cè)SIRT1、IRE1α、p-IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白水平:從-80 ℃冰箱取出各組大鼠海馬組織,剪出一部分海馬組織放入裝有鋼珠的1.5 ml EP管中,自動(dòng)制冷勻漿機(jī)勻漿,加RIPA裂解液,加入PMSF蛋白酶抑制劑,BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量分析。根據(jù)分子量制備相應(yīng)分離膠,通過電泳、轉(zhuǎn)膜、5% BSA封閉,TBST洗膜,一抗主要有SIRT1(1∶2000)、IRE1α(1∶2000)、XBP1s(1∶2000)、CHOP(1∶2000)孵育,4 ℃過夜;TBST洗膜3次,每次10 min,稀釋二抗比例為1∶5000,將PVDF膜放置于二抗中,37 ℃搖床孵育1.5 h,TBST洗膜,超敏ECL顯色后曝光,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見表2(圖1)。術(shù)后4周,與假手術(shù)組比較,模型組、西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),模型組、西藥組、溫肺降濁方各劑量組之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后8周,溫肺降濁方低劑量組逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。溫肺降濁方中劑量組、溫肺降濁方高劑量組和西藥組逃避潛伏期均短于模型組,穿越平臺(tái)次數(shù)則增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。西藥組上述觀察項(xiàng)與溫肺降濁方高劑量組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

表2 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.2 各組大鼠病理學(xué)表現(xiàn)比較 見圖2、3。假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列規(guī)則緊密,細(xì)胞數(shù)目較多,形態(tài)大圓飽滿,胞漿滿布尼氏小體;模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列雜亂松散,細(xì)胞數(shù)量較少,形態(tài)不規(guī)則,部分出現(xiàn)細(xì)胞核深染固縮,甚至破碎消失,尼氏小體含量明顯減少;與模型組比較,西藥組和溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷減輕,細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加完整,存活的神經(jīng)元數(shù)量增加,尼氏小體含量增多,其中以西藥組和溫肺降濁方高劑量組最顯著。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

2.3 各組大鼠SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達(dá)比較 見表3。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬組織SIRT1 mRNA表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬組織SIRT1 mRNA表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬組織IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠SIRT1、IRE1α、XBP1s、CHOP mRNA表達(dá)比較

2.4 各組大鼠SIRT1、IRE1α、p-IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白表達(dá)比較 見表4(圖4)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬組織中SIRT1蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬組織中p-IRE1α/IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,西藥組、溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)升高,且西藥組、溫肺降濁方高劑量組大鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。西藥組與溫肺降濁方高劑量組SIRT1蛋白表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比,西藥組、溫肺降濁方各劑量組p-IRE1α/IRE1α、XBP1s、CHOP蛋白下降,且西藥組、溫肺降濁方高劑量組大鼠各項(xiàng)蛋白表達(dá)最低,但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:西藥組;D:溫肺降濁方低劑量組;E:溫肺降濁方中劑量組;F:溫肺降濁方高劑量組

表4 各組大鼠海馬區(qū)各項(xiàng)蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

VaD好發(fā)于老年人,且多繼發(fā)于腦血管病之后,隨著人口老齡化及社會(huì)科學(xué)技術(shù)發(fā)展,VaD的發(fā)病率逐年升高[10-11]。目前,西醫(yī)治療VaD主要是抗血小板聚集、預(yù)防腦血栓形成、擴(kuò)張血管、改善腦供血和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等,但其療效有限,且會(huì)產(chǎn)生一定不良反應(yīng),而中醫(yī)藥治療VaD,因其多靶點(diǎn)效應(yīng),治療效果較好,具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12-13]。

中醫(yī)學(xué)中呆病多見呆傻愚笨、智能低下、善忘等神志異常癥狀,其病位主要在腦,與五臟功能失調(diào)相關(guān)[14]。本研究認(rèn)為,肺臟功能失調(diào)與癡呆發(fā)病關(guān)系密切,肺藏氣,氣舍魄,肺氣虧虛,魄無所舍,可導(dǎo)致癡呆。肺主宣發(fā)肅降,參與全身水液代謝,若肺陽氣虧虛,則水液不能正常布散,聚濕生痰,蒙蔽清竅,導(dǎo)致癡呆。肺的肅降還影響腎的蟄藏功能,若肺失肅降,則腎不能正常藏精,無以濡養(yǎng)清竅,可發(fā)為癡呆。肺朝百脈,助心行血,肺陽氣虧虛,可導(dǎo)致血行不暢,血脈瘀滯,阻塞腦絡(luò),清竅失養(yǎng),發(fā)為癡呆。此外,肺與大腸相表里,肺失宣降則大腸傳導(dǎo)功能失司,糟粕結(jié)于腸道,化生濁毒,上干腦竅,亦可發(fā)為癡呆。故治療應(yīng)予以溫肺降濁之法,方用溫肺降濁湯,方中附子、干姜溫肺散寒為君藥,黨參補(bǔ)益肺氣為臣藥;田七活血化瘀,酒大黃下瘀血、破積聚、蕩滌腸胃、推陳致新、通利水谷、安和五臟共為佐藥;炙甘草補(bǔ)中緩急、潤(rùn)肺降逆、調(diào)和諸藥為使;全方共奏溫肺降濁之功。

Morris水迷宮試驗(yàn)是檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的首選試驗(yàn)[15]。本研究結(jié)果顯示,術(shù)后4周模型組、西藥組和溫肺降濁方各劑量組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少,說明VaD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯下降,造模成功。應(yīng)用溫肺降濁方干預(yù)后,術(shù)后8周水迷宮結(jié)果顯示,溫肺降濁方中劑量組和溫肺降濁方高劑量組大鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加,且溫肺降濁方高劑量組療效與尼莫地平組相當(dāng),說明溫肺降濁方可改善VaD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

海馬CA1區(qū)與學(xué)習(xí)和記憶能力密切相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較模型組大鼠海馬CA1區(qū)病理損傷嚴(yán)重,神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少,且排列疏松紊亂。應(yīng)用溫肺降濁方干預(yù)后,溫肺降濁方各劑量組大鼠海馬CA1區(qū)病理損傷較模型組不同程度減輕,神經(jīng)元細(xì)胞明顯增加,且排列緊密有序,說明海馬CA1區(qū)病理損傷與VaD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降有關(guān),且溫肺降濁方可減輕VaD大鼠海馬CA1區(qū)病理損傷。

有研究表明,ERS與VaD中的學(xué)習(xí)及記憶缺陷程度相關(guān)[17]。ERS通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)來維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[18]。IRE1α是激活ERS的關(guān)鍵因子。當(dāng)UPR發(fā)生時(shí),蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、IRE1α和激活轉(zhuǎn)錄因子6(Activating transcription factor 6,ATF6)三條ERS途徑被激活以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[19-21]。當(dāng)UPR超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷時(shí),會(huì)激活XBP1s,并被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以外進(jìn)而激活CHOP蛋白,導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[22]。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶,被認(rèn)為參與細(xì)胞衰老和老化的調(diào)節(jié),在神經(jīng)變性疾病中起關(guān)鍵作用[23]。SIRT1可調(diào)節(jié)樹突和軸突生長(zhǎng),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用,并對(duì)記憶和突觸可塑性具有調(diào)節(jié)作用[24]。有研究發(fā)現(xiàn),提高大鼠體內(nèi)SIRT1表達(dá)可以改善其認(rèn)知及學(xué)習(xí)水平,減少神經(jīng)元損失,抑制炎癥,并且抑制VaD大鼠海馬中細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。此外,多項(xiàng)報(bào)道已經(jīng)證實(shí),SIRT1的激活可以減輕由ERS引起的細(xì)胞損傷,并且下調(diào)ERS通路表達(dá)水平[17-19]。還有研究證實(shí),SIRT1可以使真核生物起始因子2a脫乙?；?以減少神經(jīng)細(xì)胞由ERS引起的損傷[25]。本研究顯示,在VaD模型組大鼠中SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降,IRE1α、XBP1S、CHOP mRNA和XBP1S、CHOP蛋白以及p-IRE1α/IRE1α水平明顯升高,說明VaD發(fā)生時(shí)ERS被顯著激活。溫肺降濁方通過激活SIRT1,下調(diào)IRE1α/XBP1s/CHOP通路,從而抑制ERS。