● 朱 偉 王 敏 張元兵 蘭智慧 付向春 劉良徛▲

?

不同提取方法對溫肺化纖湯提取物的抗氧化活性評價※

● 朱 偉1*王 敏1張元兵2蘭智慧2付向春2劉良徛2▲

目的：比較不同提取方法制備的溫肺化纖湯提取物的體外抗氧化活性。方法：分別采用水提取法和不同條件乙醇回流提取法制備溫肺化纖湯的提取物，采用DPPH法、ABTS法和還原力測定法，以維生素C為陽性對照，測定不同溫肺化纖湯提取物的抗氧化作用強度。結(jié)果：陽性對照(維生素C)清除DPPH、ABTS+IC50值分別為7.42、22.75μg·mL-1，還原力EC50值為65.81μg·mL-1，溫肺化纖湯的60%乙醇提取物具有最強的體外抗氧化活性，其清除DPPH、ABTS+IC50值分別為247.11、440.41μg·mL-1，還原力EC50值為972.60μg·mL-1。結(jié)論：溫肺化纖湯具有一定的抗氧化活性，這為溫肺化纖湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并為其新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

溫肺化纖湯 抗氧化 DPPH ABTS+ 還原力

肺間質(zhì)纖維化是由多種原因引起的彌漫性肺部炎性疾病，病變主要累及肺間質(zhì)，常累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管，其發(fā)病率在我國呈明顯上升的趨勢。肺間質(zhì)纖維化的病死率高，中位存活期為3.2年，早期即使對糖皮質(zhì)激素有效，5年生存率也不足50%[1-2]。溫肺化纖湯是在治療陰疽的古方——陽和湯基礎(chǔ)上，增加土鱉蟲、桃仁、紅花等藥而組成的中藥復(fù)方，具有溫陽散寒、化痰行瘀之功效，臨床應(yīng)用治療肺間質(zhì)纖維化取得良好效果[3]。本研究對不同提取方法制備的溫肺化纖湯提取物的抗氧化活性進(jìn)行評價，并深入探討其抗肺間質(zhì)纖維化的作用機制。

1 實驗方法

1.1藥品與試劑1，1—二苯—2—苦基肼(DPPH，阿拉丁公司，D109423-250mg)，2，2’—聯(lián)氮—二—(3—乙基—苯并噻唑啉—磺酸)(ABTS，SIGMA公司，A1888—1G)，抗壞血酸(VitaminC，批號：20120418，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、甲醇等皆為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器紫外雙光束分光光度計(型號：U—2910，日本HITACI公司)，電子天平(型號:BS224S，0.0001g，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(精宏XMTD—8222，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，醫(yī)用離心機(白洋B600A，安新縣白洋離心機廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號：Rotavapor R-215，BUCHI)。

1.3供試藥材中藥飲片生麻黃為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStapf的草質(zhì)莖，鹿角霜為鹿科動物梅花鹿CervusNipponTemminck鹿角去除膠質(zhì)的角塊，肉桂為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl干燥樹皮，炮姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.干燥根莖的炮制品，熟地為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosah.塊根的炮制品、白芥子為十字花科植物白芥子Brassicaalba(L.)Boiss.的干燥種子，地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)的干燥體，土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉EupolYphagasinensisWalker的干燥體，桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch的干燥種子，紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.干燥花，川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuangXiongHort.的根莖。以上中藥統(tǒng)一購自廣東康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)院黃志海主任中藥師鑒定符合《中華人民共和國藥典》(2010版)標(biāo)準(zhǔn)，樣品憑證標(biāo)本存于我科中藥標(biāo)本室。

1.4溫肺化纖湯不同提取方法提取物的制備將各種藥材按方劑比例稱重：生麻黃10g，鹿角霜15g，肉桂4g，炮姜10g，熟地20g，白芥子10g，地龍10g，土鱉蟲10g，桃仁10g，紅花10g，川芎10g。

水提法：將以上中藥加10倍量清水浸泡1h，武火煎煮沸騰后，文火再煎40min，共煎2次，合并提取液，靜置24h，過濾，常壓濃縮至500mL(即每毫升藥液含0.258g原藥)，平行共制備6份樣品，冷卻后密封，置于冰箱4℃?zhèn)溆么郎y。

醇提法：將以上中藥分別加10倍量的30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇浸泡1h，回流提取1h，共提取2次，合并提取液，靜置24h，過濾，常壓濃縮至500mL(即每毫升藥液含0.258g原藥)，平行共制備6份樣品，冷卻后密封，置于冰箱4℃?zhèn)溆么郎y。

1.5陽性對照溶液的配制精密稱取10mg維生素C，予蒸餾水定容于10mL，即得1mg·mL-1的維生素C溶液，再予無水甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為6.25、12.5、25、50、100μg·mL-1的維生素C溶液，置于冰箱4℃?zhèn)溆么郎y。

1.6清除DPPH自由基活性測定DPPH溶液制備：參照文獻(xiàn)實驗方法[4]，精密稱取約0.1g DPPH，溶于1000 mL無水甲醇中，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的DPPH溶液，置于冰箱中避光冷藏保存(臨用時配，只能穩(wěn)定存在5h，深藍(lán)色)。取供試液2mL，加入濃度為0.1 mg·mL-1的DPPH溶液2mL，避光反應(yīng)30min，于517nm處測定其吸光度Am。同時設(shè)定溶劑空白組(An，DPPH溶液用等體積甲醇代替)，樣品空白組(Ao，樣品溶液用等體積甲醇代替)和陽性對照組。實驗平行操作3次，根據(jù)下列公式計算提取液對DPPH的清除率：抑制率(%)=(1-(Am-An)·Ao[-1])×100%。

1.7清除ABTS+活性測定ABTS+溶液制備：參照文獻(xiàn)實驗方法[5]，將25mL的7mM ABTS和440ul的140 mM過硫酸鉀混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成ABTS+ 儲備液。臨用前用無水甲醇稀釋成工作液，控制其在734nm波長下的吸光度為(0.70±0.02)。取供試液0.4mL，加入ABTS+溶液4mL，反應(yīng)6min，于734nm處測定其吸光度Ai。同時設(shè)定溶劑空白組(Aj，ABTS+溶液用等體積甲醇代替)，樣品空白組(Ah，樣品溶液用等體積甲醇代替)和陽性對照組。實驗平行操作3次，根據(jù)下列公式計算提取液對ABTS+的清除率：抑制率(%)=(1-(Ai-Aj)·Ah-1)×100%。

1.8還原力測定參照文獻(xiàn)實驗方法[6]，取供試液0.8mL，加入2mL磷酸鹽緩沖液(PH=6.6)和2mL 1%鐵氫化鉀，50℃水浴20min，加2mL 10%三氯乙酸，3000rpm，離心10min，取2mL上清加2mL去離子水，0.4mL 0.1%三氯化鐵，反應(yīng)5min，于700nm處測吸光度值，以維生素C為陽性對照，實驗平行操作3次，測得的吸光度值越大表示還原能力越強。

1.9數(shù)據(jù)處理根據(jù)溫肺化纖方提取物溶液的質(zhì)量濃度(X，ug·mL-1)與清除率(Y，%)的關(guān)系擬合方程，得出相關(guān)系數(shù)r，并計算出各提取物清除率為50%時藥物濃度(IC50)，通過IC50值比較抗氧化活性大小。

2 結(jié)果

2.1不同提取方法制備的溫肺化纖湯提取物清除DPPH自由基能力DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，它在517nm處有一強吸收，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)量呈定量關(guān)系，因而國內(nèi)外廣泛將此法用于自由基清除劑的篩選研究。由表1可知，溫肺化纖湯四種提取物均具有一定的清除DPPH自由基的能力，且在一定濃度范圍內(nèi)清除率與濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，其中，溫肺化纖湯水、30%、60%、90%乙醇提取物對DPPH自由基清除能力的大小為：60%乙醇提取物>90%乙醇提取物>水提取物>30%乙醇提取物，陽性對照維生素C清除DPPH自由基的能力明顯強于溫肺化纖湯各提取物(P<0.01)，其IC50為7.42μg·mL-1。

表1 溫肺化纖湯提取物清除DPPH自由基活性

注：與水提取組比較，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；與60%乙醇提取物組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2不同提取方法制備的溫肺化纖湯提取物清除ABTS+能力較DPPH這種有機性的自由基而言，ABTS能溶于水相和酸性的乙醇介質(zhì)中，因此，ABTS法既可測定親水性，又可測定親脂性物質(zhì)的抗氧化能力。表2的結(jié)果顯示，溫肺化纖湯四種提取物對ABTS+的清除能力亦存在量效關(guān)系，通過比較IC50值，可知溫肺化纖湯的60%乙醇提取物對ABTS+清除能力要明顯強于其它三種提取物(P<0.01)，從大到小的排列順序為：60%乙醇提取物>90%乙醇提取物>30%乙醇提取物>水提取物，但均比陽性對照維生素C弱(P<0.01)。

表2 溫肺化纖湯提取物清除ABTS+活性

注：與水提取組比較，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；與60%乙醇提取物組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3不同提取方法制備的溫肺化纖湯提取物還原力能力測定還原能力在一定程度上可以反映樣品的抗氧化活性。如表3所示，溫肺化纖湯的四種提取物都具有一定的還原力，且在一定濃度范圍內(nèi)還原能力與濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。溫肺化纖湯的60%乙醇提取物的還原力要明顯強于其它三種提取物(P<0.01)，但和陽性對照維生素C比較，則明顯為弱(P<0.01)。

表3 溫肺化纖湯提取物還原力測定

注：與水提取組比較，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01；與60%乙醇提取物組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

肺間質(zhì)纖維化的病理特點以慢性炎癥和纖維素滲出為主，基質(zhì)膠原進(jìn)行性沉積并逐步取代正常肺組織，最終引起患者不同程度的缺氧、呼吸困難，最后因呼吸衰竭而死亡。肺間質(zhì)纖維化中醫(yī)學(xué)屬“肺痿”范疇[7]，我們在繼承歷代醫(yī)家學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，結(jié)合數(shù)十年臨床實踐，認(rèn)為肺間質(zhì)纖維化是一個本虛標(biāo)實之證，陽虛是本病的內(nèi)因，痰和瘀是本病的繼發(fā)因素，自創(chuàng)溫肺化纖湯治療肺間質(zhì)纖維化獲得較好療效[8]。毒性氧化物是目前被證實的最主要的致?lián)p傷物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病機理中起著非常重要的作用。當(dāng)患肺間質(zhì)纖維化時，炎癥細(xì)胞釋放大量氧化物質(zhì)，使機體氧化抗氧化失衡，谷胱甘肽(GSH)水平降低，它所造成的廣泛肺損傷是肺間質(zhì)纖維化發(fā)病中的重要環(huán)節(jié)[9-10]。臨床研究結(jié)果顯示N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作為GSH的前體，在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為GSH，增強肺組織內(nèi)抗氧化和毒物損傷的能力[11-13]。溫肺化纖湯的藥理學(xué)效應(yīng)的重要組成部分是否是清除氧自由基能力，其中又是何種成分群發(fā)揮抗氧化作用，這使得要在分子水平闡明其藥理作用受到很大限制。

本研究采用三種抗氧化評價方法，以維生素C為陽性對照，測定不同提取方法溫肺化纖湯提取物的抗氧化作用強度，結(jié)果顯示，溫肺化纖湯的不同提取物均具有一定的抗氧化活性，其中溫肺化纖湯的60%乙醇提取物具有最強的抗氧化效果，雖然清除效果和維生素C比較還有很大的差距，但其是混合物，有效成分含量低，雜質(zhì)多，有待我們更深入地開展溫肺化纖湯的分離純化及其抗氧化作用的研究。

[1]Idiopathic Pulmonary Fibrosis Clinical Research Network.A controlled trial of sildenafil in advanced idiopathic pulmonary fibrosis[J].N Engl J Med,2010,363:620-628.

[2]Raghu G,Collard HR, Egan JJ,et al.An Official ATS/ERS/JRS/ALAT Statement: Idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management[J].Am J Respir Crit Care Med,2011,183(6):788-824.

[3]劉良徛，聞海菊，李少峰.溫肺化纖湯治療肺間質(zhì)纖維化6例分析[J].中醫(yī)藥通報，2011，10(6)：55-58.

[4]Chen Z,Bertin R,Froldi G.EC50 estimation of antioxidant activity in DPPH? assay using several statistical programs[J].Food Chem,2013,138(1):414-420.

[5]廖月霞,卜 平.半枝蓮乙醇提取物體外抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23(3):520-523.

[6]周向軍，高義霞，袁毅君，等.烏龍茶茶褐素提取工藝的優(yōu)化及抗氧化研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(4)：36-40.

[7]鄭 嵐，鄭建平.中醫(yī)藥治療肺間質(zhì)纖維化近10年研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2011，26(1)：188-191.

[8]蘭智慧，張元兵，朱 偉，等.從陽虛論治肺間質(zhì)纖維化探討[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(7)：1940-1942.

[9]Hecker L,Cheng J,Thannickal VJ.Targeting NOX enzymes in pulmonary fibrosis[J].Cell Mol Life Sci,2012,69(14):2365-2371.

[10]O'Connell OJ,Kennedy MP,Henry MT.Idiopathic pulmonary fibrosis: treatment update[J].Adv Ther,2011,28(11):986-999.

[11]Idiopathic Pulmonary Fibrosis Clinical Research Network,Raghu G,Anstrom KJ,et al.Prednisone, azathioprine, and N-acetylcysteine forpulmonary fibrosis[J].N Engl J Med,2012,366(21):1968-1977.

[12]Homma S,Azuma A,Taniguchi H,et al.EfficacY of inhaled N-acetylcysteine monotherapy in patients with early stage idiopathic pulmonary fibrosis[J].Respirology,2012,17(3):467-477.

[13]Bando M,Hosono T,Mato N,et al. Long-term efficacy of inhaled N-acetylcysteine in patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J].Intern Med,2010,49(21):2289-2296.

醫(yī)論

勞逸有方

車牛多骨立，驛馬多早斃，休息少也。山禽與野獸，不為人獵取，從無見有自死者，散逸多也。牛馬有病，役于人也。禽獸無病，得自由也。易曰∶天行健，君子自強不息。人可飽食不事事乎？但不可過勞，不可焦心。黎明至午，應(yīng)行之事，只管去做；午后不妨休息養(yǎng)神。

夫牛馬之勞，本非所愿，為畜于人，欲罷不能；山禽野獸，一巢一穴之外，惟覓食不饑則已。人能若是乎，大則為國為民，小則謀食謀衣，各行其志，亦各有所樂。故雖勞能臻上壽，頹惰自甘者，亦未必延齡也。外廄之馬，田家之牛，芻豢得宜，勞逸得中，亦何嘗骨立而早斃耶？前作攝生一卷，每言靜養(yǎng)。然人之于事，豈可盡廢。故書此可參閱之。

(摘自清·黃凱鈞·《友漁齋醫(yī)話》)

國家自然科學(xué)基金(No.81260537)；江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜媱濏椖?No.KJLD13063)；江西省自然科學(xué)基金(No.20132BAB205093)；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計劃(No.2012Z004)；江西省科技廳科技計劃項目(No.20111BBG70020-6)；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計劃(重點)(No.2013Z001)

朱偉，男，博士，研究員。主要從事中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

▲通訊作者劉良徛，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師。主要從事中醫(yī)肺系病的臨床和基礎(chǔ)研究。E-mail：llj6505@163.com

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(510006)；江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科(330006)