李群真,李 軍,郭樹繁,燕 茹,董學(xué)娜,馬鳳梅

(河北省中醫(yī)院耳鼻喉科,河北 石家莊 050011)

慢性鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)是一種常見的上呼吸道疾病,主要特征是鼻竇黏膜的慢性炎癥和黏液分泌增加。CRS嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)。CRS的治療措施主要包括抗生素、抗炎藥物和手術(shù)等[1]。在目前的研究中,對(duì)CRS的病理生理機(jī)制已有一定了解,但仍存在一些局限性。首先,傳統(tǒng)的治療方法主要針對(duì)炎癥反應(yīng)和黏液過度分泌進(jìn)行干預(yù),缺乏對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的全面認(rèn)識(shí)。其次,現(xiàn)有的治療方法往往只能緩解癥狀,無(wú)法從根本上改變疾病進(jìn)程[2]。因此,有必要尋找新的治療方法,深入研究慢性鼻竇炎的發(fā)病機(jī)制,提高治療效果。辛芷通竅顆粒作為一種傳統(tǒng)中藥方劑,由辛夷、蒼耳子、白芷、薄荷、麻黃、金銀花、黃芩、石膏、魚腥草、川芎、陳皮、甘草等組成,具有疏風(fēng)通竅、清熱解毒功效,主要用于治療過敏性鼻炎[3]。有臨床研究表明,辛芷通竅顆粒可顯著改善CRS患者癥狀,減輕炎癥反應(yīng),提高生活質(zhì)量,但具體機(jī)制尚不清楚[4-5]。因此,本研究旨在探討辛芷通竅顆粒對(duì)CRS小鼠鼻竇黏膜的保護(hù)作用及機(jī)制,以期為辛芷通竅顆粒的科學(xué)應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:50只6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,平均體重(22±2)g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2008-0016]。遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則,所有小鼠均在相對(duì)濕度70%,環(huán)境溫度(24±2)℃,12 h明暗交替條件下喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑:BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)P0010,碧云天生物技術(shù)有限公司);RIPA裂解液(貨號(hào)P0013B,碧云天生物技術(shù)有限公司);4×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào)RM00101,武漢愛博泰克生物科技有限公司);SDS-PAGE凝膠配劑盒(貨號(hào)G2003-50T,賽維爾生物科技有限公司);TRIzol試劑(貨號(hào)QN2070,北京百普賽斯生物科技股份有限公司);肺炎鏈球菌液(貨號(hào)B80921,寧波明舟生物科技有限公司);辛芷通竅顆粒(貨號(hào)Z20073039,四川同人泰藥業(yè)股份有限公司);ELISA試劑盒(貨號(hào)EKHU3748,迪信泰檢測(cè)科技有限公司)。一抗TNF-α(貨號(hào)3707,美國(guó)CST公司)、IL-6(貨號(hào)12153,美國(guó)CST公司)、IL-10(貨號(hào)12163,美國(guó)CST公司)、IL-16(貨號(hào)87477,美國(guó)CST公司)、IFN-γ(貨號(hào)98139,美國(guó)CST公司)、HMGB1(貨號(hào)3935,美國(guó)CST公司)、NLRP3(貨號(hào)15101,美國(guó)CST公司)、ASC(貨號(hào)67824,美國(guó)CST公司)、Cleaved caspase-1(貨號(hào)89332,美國(guó)CST公司)、GAPDH(貨號(hào)92310,美國(guó)CST公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠模型建立及給藥:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠分籠飼養(yǎng),每籠至多5只小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫22～25 ℃,自由飲水飲食,晝夜12 h交替,定期更換墊料。采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只小鼠分為假手術(shù)組、模型組、辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組。采用開放上頜竇后接種3型莢膜型肺炎鏈球菌方法建立CRS小鼠模型。小鼠麻醉滿意后,于小鼠鼻背正中處做一橫行約3 mm的切口,鈍性分離皮下組織,暴露上頜竇腔,于上頜竇左右兩側(cè)開口處磨一個(gè)直徑約為1 mm的小孔。將含1 μl肺炎鏈球菌菌液的膨脹海綿植入竇腔內(nèi),逐層縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠手術(shù)方式同模型組,但不植入含肺炎鏈球菌菌液的膨脹海綿。造模后第8周,記錄小鼠一般情況及癥狀評(píng)分,總分≥5分認(rèn)為造模成功。辛芷通竅低劑量組予以1.4 g/kg辛芷通竅顆粒、中劑量組予以2.8 g/kg辛芷通竅顆粒、高劑量組予以5.6 g/kg辛芷通竅顆粒,均灌胃治療,相當(dāng)于臨床用量的0.8、1.6、3.2倍,假手術(shù)組及模型組小鼠灌胃等量0.9%氯化鈉溶液。每天給藥1次,連續(xù)給藥2周。

1.2.2 HE染色:小鼠鼻竇黏膜組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,梯度濃度的乙醇脫水,石蠟包埋。將組織塊切成5 μm厚的切片,依次進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、乙醇脫水,再經(jīng)二甲苯透明,滴加樹膠、封片,在光鏡下觀察鼻竇黏膜組織病理改變。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)外周血炎癥因子水平:末次給藥24 h后,采集小鼠腹主動(dòng)脈無(wú)菌血。靜置1 h,室溫、3000 r/min條件下離心10 min,收集上層血清,-80 ℃保存。根據(jù)制造商說(shuō)明采用ELISA法測(cè)定小鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ表達(dá)水平。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè):根據(jù)制造商方案,使用Trizol試劑分離,提取鼻竇黏膜組織中總RNA。使用PrimerScript RT試劑盒(#RR037A,Takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Premix Ex TaqTMTM Ⅱ檢測(cè)相應(yīng)目的基因表達(dá)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性10 min,循環(huán)40次(95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s),以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量,基因引物序列,見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè):將小鼠鼻竇黏膜組織置于冰上加入裂解液進(jìn)行裂解,提取總蛋白并定量。以40 μg蛋白/孔的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳,電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,用牛血清白蛋白溶液封閉,與抗TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ、HMGB1、NLRP3、ASC、Cleaved caspase-1、GAPDH的一抗共同孵育,在4 ℃條件下孵育過夜。以GAPDH作為內(nèi)參。用TBST洗膜3次,與二抗孵育1 h后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)檢測(cè)蛋白印跡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)至少3次,采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較 造模前,各組小鼠精神狀態(tài)良好,皮毛健康有光澤,飲食飲水規(guī)律。造模后,各組小鼠飲食飲水明顯較少,且出現(xiàn)鼻水流出、頻繁撓鼻、打噴嚏、煩躁不安等癥狀,鼻腔內(nèi)有少量分泌物出現(xiàn),伴有不同程度的結(jié)膜水腫、眼角溢淚等表現(xiàn)。經(jīng)過6周的藥物干預(yù)后,假手術(shù)組癥狀評(píng)分為(0.09±0.02)分、模型組癥狀評(píng)分為(8.49±0.61)分、辛芷通竅低劑量組癥狀評(píng)分為(3.19±0.45)分、辛芷通竅中劑量組癥狀評(píng)分為(2.56±0.39)分、辛芷通竅高劑量組癥狀評(píng)分為(2.09±0.22)分,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.32,P<0.05)。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分均低于給藥前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),且辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分最低,辛芷通竅方呈明顯的劑量依賴性。

2.2 各組小鼠鼻竇黏膜病理情況比較 見圖1。假手術(shù)組小鼠鼻竇黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,黏膜及黏膜下層有未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠鼻竇黏膜上皮纖毛脫落、炎癥細(xì)胞滲入、腺體損傷、血管擴(kuò)張和水腫。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇黏膜中上皮纖毛及腺體損傷現(xiàn)象,但與模型組相比,炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度、血管擴(kuò)張和水腫程度相對(duì)較輕,鼻竇黏膜上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊,且辛芷通竅顆粒干預(yù)濃度越高,病變改善程度越明顯。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:辛芷通竅低劑量組;D:辛芷通竅中劑量組;E:辛芷通竅高劑量組

2.3 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較 見表2。與假手術(shù)組相比,模型組小鼠外周血中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠外周血炎癥因子水平低于給藥前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且辛芷通竅高劑量組小鼠外周血炎癥因子水平最低,辛芷通竅中劑量組外周血炎癥因子水平次之,辛芷通竅低劑量組小鼠外周血炎癥因子水平最高,辛芷通竅方表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

表2 各組小鼠外周血炎癥因子比較(pg/ml)

2.4 各組小鼠鼻竇組織中炎癥因子水平比較 見表3(圖2)。從本次觀察可見,RT-qPCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組小鼠鼻竇黏膜組織中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-16、IFN-γ的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇黏膜組織炎癥因子低于模型組小鼠水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且辛芷通竅顆粒呈劑量依賴性地抑制鼻竇黏膜組織中炎癥因子表達(dá)。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:辛芷通竅低劑量組;D:辛芷通竅中劑量組;E:辛芷通竅高劑量組

表3 各組小鼠鼻竇黏膜組織中炎癥因子mRNA表達(dá)比較

2.5 各組小鼠鼻竇黏膜HMGB1/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá) 見圖3。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組小鼠黏膜組織中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達(dá)升高。與模型組相比,辛芷通竅低劑量組、辛芷通竅中劑量組、辛芷通竅高劑量組小鼠鼻竇黏膜組織中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1 蛋白表達(dá)降低,且呈辛芷通竅顆粒劑量依賴性。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:辛芷通竅低劑量組;D:辛芷通竅中劑量組;E:辛芷通竅高劑量組

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為,鼻竇是人體衛(wèi)氣之源,與肺經(jīng)關(guān)系緊密[6-8]。生理情況下,鼻竇內(nèi)的氣血運(yùn)行順暢,能夠保持呼吸通暢以及鼻腔黏膜的正常功能,當(dāng)外邪侵入或體內(nèi)邪氣聚集-導(dǎo)致鼻竇黏膜受損,氣血瘀滯不暢,即會(huì)引發(fā)CRS[9-12]。辛芷通竅顆粒是一種中藥制劑,具有祛邪解表、宣發(fā)散寒作用,能夠祛除風(fēng)寒邪氣,促進(jìn)鼻竇血液循環(huán),改善鼻竇黏膜的炎癥[13-15]。

本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠的正常鼻竇黏膜組織結(jié)構(gòu)被顯著破壞,外周血炎癥因子水平最高;辛芷通竅顆粒各劑量組小鼠鼻竇黏膜中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、血管擴(kuò)張、水腫程度相對(duì)較輕,鼻竇黏膜上皮細(xì)胞排列相對(duì)整齊,外周血炎癥因子水平較低,且辛芷通竅顆粒干預(yù)濃度越高,病變改善程度越明顯,表明辛芷通竅顆粒中的活性成分具有鼻竇黏膜損傷的保護(hù)作用?？赡艿臋C(jī)制包括辛芷通竅顆粒中的活性成分具有抗炎作用,能夠減輕炎癥細(xì)胞滲出。炎癥細(xì)胞的積聚會(huì)產(chǎn)生炎癥介質(zhì),如TNF-α、IL-6等,這些介質(zhì)會(huì)引起局部血管擴(kuò)張和水腫。辛芷通竅顆粒通過抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,減輕血管擴(kuò)張和水腫程度;辛芷通竅顆粒也可能對(duì)鼻竇黏膜上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[16]。鼻竇黏膜上皮細(xì)胞的纖毛脫落是慢性鼻竇炎的典型特征,而辛芷通竅顆粒通過促進(jìn)纖毛再生或抑制纖毛脫落過程,減輕鼻竇黏膜上皮纖毛損傷[17-18]。此外,辛芷通竅顆粒還能保護(hù)鼻竇黏膜腺體,減輕其受損程度。

HMGB1/NLRP3信號(hào)通路在CRS的病情進(jìn)展中具有重要作用[12]。HMGB1是一種核蛋白,在細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)中釋放,并參與調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[19]。NLRP3是一種炎癥小體成分,參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡調(diào)控[20-23]。在包括CRS在內(nèi)的慢性炎癥發(fā)展過程中,HMGB1和NLRP3的異?；罨c炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在密切相關(guān),二者的激活可以導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在[24]。促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),進(jìn)一步加劇局部組織的炎癥反應(yīng)。同時(shí),HMGB1和NLRP3的異?；罨烧T導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷,誘導(dǎo)鼻竇黏膜的結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙,加重CRS嚴(yán)重程度[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn),辛芷通竅顆?？捎行б种菩∈蟊歉]黏膜中HMGB1/NLRP3信號(hào)通路激活,表明HMGB1/NLRP3信號(hào)通路是辛芷通竅顆粒治療CRS的重要靶點(diǎn),通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)失衡,抑制炎癥因子的持續(xù)改善。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)辛芷通竅顆粒呈劑量依賴性地抑制HMGB1/NLRP3信號(hào)通路激活,抑制CRS小鼠鼻竇黏膜炎癥水平。然而,CRS的發(fā)生發(fā)展涉及眾多因素,機(jī)制復(fù)雜,因此辛芷通竅顆粒改善CRS癥狀的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。