李杳瑤,劉 華,孫銅林,伍 靜,孟小莎,伍夢(mèng)思,,蘇聯(lián)軍

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208)

肝癌(Hepatic carcinoma,HCC)是我國(guó)第三大最常見的癌癥。化療耐藥引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肝癌管理改善臨床結(jié)果的主要挑戰(zhàn)[1-2]。肝轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)切除后的5年生存率為25%～55%,且在大多數(shù)患者中觀察到癌癥復(fù)發(fā)[3]。因此,需要更多的研究來(lái)推進(jìn)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高且對(duì)當(dāng)前療法反應(yīng)率低的HCC。惡性腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制研究表明,黏著斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)通過(guò)控制細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用有助于癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲性活動(dòng)[4]。FAK將底物磷酸化為支架,局灶黏附誘導(dǎo)促進(jìn)基質(zhì)金屬酶(Matrix metalloenzymes,MMP)分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,導(dǎo)致ECM底物降解并增加ECM底物上的腫瘤細(xì)胞黏附。此外,除了與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)外,雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路還參與細(xì)胞的存活和分化,以及它們的侵襲潛力。此外,許多研究表明,mTOR信號(hào)傳導(dǎo)有助于調(diào)節(jié)MMP-2/-9活性[5-7]。鱉甲煎丸是治療體內(nèi)腫塊的經(jīng)典方劑,來(lái)源于《文一倫》一書。方中鱉甲、烏扇炮、黃芩、鼠婦熬用于分解積聚和消除瘀血,干姜、大黃、桂枝起到尋找和清除病原體作用,石韋、厚樸、瞿麥、紫葳擅長(zhǎng)軟化腫瘤硬度,阿膠、柴胡、蜣螂熬滋肝陰,甘草是各藥的調(diào)劑。作為傳統(tǒng)中藥,鱉甲煎丸已被證明對(duì)多種腫瘤具有抗腫瘤活性,如肺癌、乳腺癌和肝癌[8]。迄今為止,多項(xiàng)研究表明鱉甲煎丸具有加速細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)自噬、促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力[9]。然而,關(guān)于鱉甲煎丸治療肝癌壞死性凋亡的研究很少。本研究擬探討鱉甲煎丸對(duì)HCC大鼠病理?yè)p傷及FAK、mTORC1蛋白表達(dá)的影響,為HCC治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:體重18～22 g的Sprague-Dawley(SD)大鼠100只獲自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心[許可證編號(hào)SCXK(云)2019-0012,合格證號(hào)SCXK(云)2019-0013]。大鼠喂養(yǎng)環(huán)境為(22±2)℃,12 h光-暗循環(huán)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器:5-氟尿嘧啶組(批號(hào)45896.36,20 mg/kg)、TRIzol試劑(批號(hào)DC-45896.36)、Thermo script RT系統(tǒng)試劑(批號(hào)MN-52636.36)、Power SYBRGREEN PCR MasterMix試劑(批號(hào)VB-45896.36)、BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)BC-4896.36)、聚偏二氟乙烯膜(批號(hào)526987.36)。FAK、mTORC1一抗(中國(guó)碧云天生物科技,批號(hào)CI-636985.36、854635.54);HRP偶聯(lián)的二抗(批號(hào)45874585.3);VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白Quantikine ELISA試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司,批號(hào)69696.36、47852.54、48965.25、52419.65、95487.25)。Applied Biosystems序列檢測(cè)系統(tǒng)7900(ABI Prism7900HT)、化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Biosciences)。

1.1.3 鱉甲煎丸配方:炙鱉甲、烏扇炮、黃芩、鼠婦熬、干姜、大黃、桂枝、石韋去毛、厚樸、瞿麥、紫葳、阿膠各3 g,柴胡、蜣螂熬各6 g,芍藥、牡丹去心、蟲熬各5 g,蜂窠炙4 g,赤硝12 g,桃仁2 g,人參、半夏,葶藶各1 g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組:根據(jù)大鼠體重隨機(jī)分成五組,正常組、模型組、5-氟尿嘧啶組(20 mg/kg)、鱉甲煎丸低劑量組(40 mg/kg)、鱉甲煎丸高劑量組(80 mg/kg),每組20只,雌雄各半。

1.2.2 各組大鼠模型建立:模型組、5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組用HepG2(1×107)細(xì)胞皮下注射到大鼠右腋皮下,10 d后,腫瘤體積達(dá)到50 mm3說(shuō)明建模成功。24 h后5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組給予相應(yīng)藥物灌胃,持續(xù)4周,正常組、模型組均給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.2.3 各組大鼠肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率測(cè)定:采用游標(biāo)卡尺檢測(cè)其長(zhǎng)短徑,計(jì)算腫瘤抑制率及腫瘤組織體積。腫瘤抑制率=[(模型組腫瘤體積-其他組腫瘤體積)/模型組腫瘤體積]×100%。腫瘤組織體積=(腫瘤組織長(zhǎng)徑×腫瘤組織短徑2)/2。

1.2.4 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1基因測(cè)定:使用TRIzol試劑從肝癌組織中分離總RNA,并使用TRIzol試劑提取總RNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明,通過(guò)Thermo script RT系統(tǒng)試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用Applied Biosystems序列檢測(cè)系統(tǒng)7900(ABI Prism7900HT)與10 μl由Power SYBRGREEN PCR Master Mix、500 nmol每個(gè)引物和300 ngcDNA模板。反應(yīng)條件為95 ℃下初始變性5 min,然后是60個(gè)循環(huán),94 ℃下20 s,60 ℃下20 s和72 ℃下40 s,再以0.1 ℃/s速度從72 ℃升溫至95 ℃之前,包括在72 ℃下進(jìn)行5 min最終延伸,并進(jìn)行連續(xù)熒光采集。對(duì)于定量RT-qPCR的每個(gè)實(shí)例,復(fù)制每個(gè)cDNA樣本,并使用2-ΔΔCt方法確定平均相對(duì)倍數(shù)mRNA表達(dá),其中檢測(cè)到GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。RT-qPCR中使用的引物序列,見表1。

表1 FAK、mTORC1基因引物序列

1.2.5 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1蛋白測(cè)定:肝癌組織用裂解緩沖液(20 ml Tris-HCl、1 m MEDTA、1 ml EGTA、1 ml釩酸鈉、0.2 ml苯甲基磺酰氟、0.5%NP-40、1 μg/ml亮抑酶肽、1 μg/ml抑肽酶和1 μg/ml胃酶抑素A)裂解。用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將等量的總細(xì)胞裂解物30 μg溶解在樣品緩沖液中,并在變性SDS-PAGE凝膠(5%濃縮凝膠和8%～12%分離凝膠)電泳,然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。用FAK、mTORC1一抗探測(cè)印跡,然后用HRP偶聯(lián)的二抗探測(cè),通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察抗原-抗體復(fù)合物。

1.2.6 各組大鼠肝癌組織VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α蛋白水平測(cè)定:使用Quantikine ELISA試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書測(cè)量肝癌組織VEGFR-2、VEGF、IL-4、IL-8、TNF-α水平。用分光光度法分別在450、459、468、652、548 nm處測(cè)量吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率比較 見表2。與正常組比較,模型組肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠肝癌組織重量、肝癌組織體積、肝癌組織抑瘤率比較

2.2 各組大鼠肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)比較 見表3。與正常組比較,模型組肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠肝癌組織VEGFR-2、VEGF蛋白表達(dá)比較(ng/g)

2.3 各組大鼠肝癌結(jié)構(gòu)比較 正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常;模型組肝癌細(xì)胞異型性增生,有明顯增生灶結(jié)節(jié),可見脂肪變性、細(xì)胞核增大出血及壞死細(xì)胞,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;經(jīng)過(guò)5-氟尿嘧啶、各劑量的鱉甲煎丸干預(yù)后,肝癌面積減少,癌細(xì)胞異型性增生減弱,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖1)。

A:正常組;B:模型組;C:5-氟尿嘧啶組;D:鱉甲煎丸低劑量組;E:鱉甲煎丸高劑量組

2.4 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達(dá)比較 見表4。與正常組比較,模型組肝癌FAK、mTORC1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達(dá)降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達(dá)低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1 mRNA表達(dá)比較

2.5 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1蛋白表達(dá)比較 見表5(圖2)。與正常組比較,模型組肝癌FAK、mTORC1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌FAK、mTORC1蛋白表達(dá)降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌FAK、mTORC1蛋白表達(dá)低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:正常組;B:模型組;C:5-氟尿嘧啶組;D:鱉甲煎丸低劑量組;E:鱉甲煎丸高劑量組

表5 各組大鼠肝癌組織FAK、mTORC1蛋白表達(dá)比較

2.6 各組大鼠肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α比較 見表6。與正常組比較,模型組肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α升高(P<0.05)。與模型組比較,5-氟尿嘧啶組、鱉甲煎丸低劑量組、鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α水平降低,且鱉甲煎丸高劑量組肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α低于鱉甲煎丸低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠肝癌組織IL-4、IL-8、TNF-α水平比較(ng/g)

3 討 論

鱉甲煎丸的抗腫瘤作用集中體現(xiàn)在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、侵襲和遷移抑制以及細(xì)胞周期停滯[10]。近期報(bào)道,鱉甲煎丸通過(guò)抑制多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而具有抗癌活性[11]。據(jù)報(bào)道,鱉甲煎丸可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系中的壞死性凋亡[12]。研究發(fā)現(xiàn),鱉甲煎丸通過(guò)抑制NF-κB和NF-κB調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物抑制人胰腺腫瘤的生長(zhǎng)并增強(qiáng)吉西他濱的抗腫瘤作用[13]。此外,鱉甲煎丸通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞[14]。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),鱉甲煎丸可通過(guò)激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在用鱉甲煎丸處理的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中,Caspase-8蛋白質(zhì)水平降低[15]。根據(jù)中草藥配伍原則,結(jié)合肝癌病理特點(diǎn),鱉甲煎丸在三家散的基礎(chǔ)上選用黃芪支持氣機(jī)運(yùn)行,去除了黃蟬、蟬科,代替了姜黃以加強(qiáng)祛血功效,減去白芍,代之以紫芍、紅花,增強(qiáng)當(dāng)歸的活血、養(yǎng)陰功效。鱉甲煎丸能促進(jìn)血液循環(huán),對(duì)體內(nèi)腫塊表現(xiàn)明顯抑制作用,因此可用于治療肝硬化、肝細(xì)胞癌等。此外,臨床應(yīng)用表明鱉甲煎丸對(duì)肝硬化或HCC療效較好,肝功能指標(biāo)、門靜脈直徑均得到改善。然而,鱉甲煎丸對(duì)HCC的潛在機(jī)制仍然知之甚少。本研究中鱉甲煎丸對(duì)VEGFR-2、VEGF蛋白表現(xiàn)出直接抑制作用,說(shuō)明鱉甲煎丸對(duì)大鼠肝癌具有抑制作用,這與前述討論一致。此外,高劑量的鱉甲煎丸與5-氟尿嘧啶效果一致,提示加大鱉甲煎丸劑量可達(dá)到更好療效。病理研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常,模型組肝癌細(xì)胞異型性增生,細(xì)胞排列密集,核大見分裂,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;經(jīng)過(guò)5-氟尿嘧啶、各劑量的鱉甲煎丸干預(yù)后,肝癌面積減少,癌細(xì)胞異型性增生減弱,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少,說(shuō)明鱉甲煎丸能減輕大鼠肝癌所致的病理?yè)p傷。

最近報(bào)告表明,MMP-9和FAK與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)時(shí)相關(guān),并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲。EGF/EGFR信號(hào)傳導(dǎo)被確定為包括乳腺癌、肺癌在內(nèi)的多種腫瘤類型的重要參與者。當(dāng)FAK與179-kDa EGFR結(jié)合時(shí),受體激活涉及與其他EGFR家族成員的同源和異質(zhì)二聚化,以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和MAPK途徑激活,這些途徑增強(qiáng)了腫瘤生長(zhǎng)和侵襲。此外,EGFR/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)mTOR靶標(biāo),稱為癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵控制器。mTOR信號(hào)通路能抑制F-肌動(dòng)蛋白重組和FAK磷酸化,這是細(xì)胞遷移的功能指標(biāo)。mTORC1最近已被證明與壞死性凋亡有關(guān)。FAK和mTORC1通過(guò)它們的RIP同型相互作用基序(RHIM)域相互作用,形成FAK/mTORC1復(fù)合物,介導(dǎo)經(jīng)典的壞死性凋亡[16]。近期研究發(fā)現(xiàn),5-氟尿嘧啶在mRNA水平上抑制mTORC1轉(zhuǎn)錄,降低mTORC1表達(dá)和磷酸化[17-18]。在mTORC1-/-MEF和mTORC1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的凋亡被顯著降低。因此,5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的凋亡可定義為mTORC1依賴性壞死性凋亡[19-22]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中的ROS生成和線粒體功能障礙顯著觸發(fā)細(xì)胞凋亡[23-25],環(huán)磷酰胺引起壞死性凋亡來(lái)抑制體內(nèi)和體外肺癌細(xì)胞生長(zhǎng),mTORC1的激活使S358處的MLKL磷酸化并衍生其寡聚化,這直接破壞了壞死性凋亡過(guò)程中的膜完整性。因此,MLKL在5-氟尿嘧啶處理后被mTORC1磷酸化,并通過(guò)與mTORC1的相互作用被招募形成壞死體。本研究結(jié)果說(shuō)明,鱉甲煎丸能抑制肝癌FAK、mTORC1表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。這與上述研究一致。