張文廣,李 琴,星 媛

(青海省中醫(yī)院風(fēng)濕科,青海 西寧 810001)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,以邪氣痹阻經(jīng)脈而致氣血虧虛、肝腎不足、筋骨失養(yǎng)為主要病機[1]?！杜R證指南醫(yī)案》中對于“痹證”的闡述提示瘀血與痰濁互結(jié)貫穿RA整個病程,因此通過治瘀能夠控制RA病情發(fā)展[2]。中醫(yī)實施個體化的辨證論治,已運用多種重要有效成分和復(fù)方湯劑治療RA并在阻止病情發(fā)展上取得較大優(yōu)勢。雷公藤、姜黃素等有效成分已被作為RA治療的重要藥物[3-4]。復(fù)方湯劑中生地苦參湯可以協(xié)同艾拉莫德緩解RA患者的炎性癥狀,桂枝芍藥知母湯能夠有效改善RA患者關(guān)節(jié)腫痛,均表現(xiàn)出中醫(yī)治療RA的安全性和有效性[5-6]。

紅景天苷是從藥用植物紅景天中提取出的有效藥物成分,具有補腎、行氣養(yǎng)血、扶正固本的療效,而且紅景天苷抗腫瘤、抗疲勞、均衡調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、抗應(yīng)激、抗缺氧功效較好[7]。本研究旨在通過RA模型小鼠探究紅景天苷緩解RA炎癥的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物基本情況與飼養(yǎng)條件:40只C57BL/6雄性小鼠6～8周齡,體重20～24 g,平均(22±2)g,購自青海生物藥品廠有限公司,許可證號SYXK(青)2023-0002。所有小鼠均在無病原菌的干凈籠子中喂養(yǎng),籠內(nèi)添加墊料,給予充足飼料和飲水,保證小鼠能夠自由走動與攝食,所有飲用水和食物均進行了高壓滅菌。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃、濕度(55±5)%,12 h晝夜循環(huán)照明,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要實驗試劑:紅景天苷(貨號10338-51-9),弗氏完全佐劑(貨號7009),弗氏不完全佐劑(貨號7002),TRIzol(貨號15596-026),cDNA合成試劑盒(貨號6110A),定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑(貨號RR036Q)。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA檢測試劑盒(貨號MTA00B),白介素-6(Interleukin-6,IL-6)ELISA檢測試劑盒(貨號M6000B),蘇木素伊紅染液(貨號C0105S),蛋白酶抑制劑PMSF(貨號ST505),蛋白質(zhì)裂解液RIPA(貨號P0013B),BCA試劑盒(貨號P0009)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模方法與評價:構(gòu)建膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)模型小鼠。2 mg/ml牛Ⅱ型膠原5 ml與等體積的弗氏完全佐劑混合后反復(fù)抽吸乳化,向小鼠尾基部皮內(nèi)注射200 μl弗氏完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原進行免疫后,在第21天于尾基部另一部位皮內(nèi)注射200 μl弗氏不完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原加強免疫。按照文獻描述[8]對小鼠關(guān)節(jié)炎進行評分分級,最高等級為16分?；緲?biāo)準(zhǔn)設(shè)定為每只爪子從0～4分表示關(guān)節(jié)炎嚴重程度:0分為正常關(guān)節(jié);1分為輕微腫脹或拇指紅斑;2分為腳部皮膚發(fā)紅,輕微腫脹;3分為中度腫脹和紅斑;4分為累及整個后爪或全身的嚴重腫脹和紅斑。將評分超過6分的小鼠判定為造模成功。

1.2.2 分組方法與給藥:隨機抽取10只僅正常攝食飲水而不做任何處理的小鼠作為空白組。30只CIA模型構(gòu)建成功的小鼠被隨機分成模型組、對照組、實驗組,各組10只。模型組不進行藥物注射僅正常攝食飲水;對照組以5 g/(kg·d)的0.9%氯化鈉溶液灌胃;將25 mg紅景天苷粉末溶解于無菌PBS中配制成5 mg/ml工作液,實驗組使用紅景天苷工作液以5 g/(kg·d)劑量胃內(nèi)給藥。各組小鼠在第一次免疫后第70天用戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射,進行安樂死,從小鼠身上收集膝關(guān)節(jié)滑膜組織。

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(RT-qPCR):將小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織在研缽中碾碎,用TRIzol提取小鼠滑膜組織總RNA。按照cDNA合成試劑盒的說明進行逆轉(zhuǎn)錄,之后使用引物和定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-qPCR,GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.2.4 HE染色:將從小鼠關(guān)節(jié)處分離的滑膜組織固定于4%多聚甲醛后包埋于石蠟中,通過石蠟切片機切成厚度為4 μm的均勻切片。將石蠟切片放在60 ℃烤箱中加熱1 h,依次放入二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、95%酒精5 min、75%酒精5 min中進行脫蠟處理,再用蒸餾水洗滌。用蘇木素染液浸染8 min,蒸餾水沖洗,加1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒后,蒸餾水沖洗,0.6%氨水返藍,流動清水下沖洗。再將切片放入伊紅染液中染色3 min,蒸餾水沖洗后依次放入95%乙醇Ⅰ 5 min、95%酒精Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min中脫水至透明,切片晾干后用中性樹膠封片。

1.2.5 組織病理學(xué)評分[9]:用光學(xué)顯微鏡觀察HE染色后病理切片,從滑膜細胞增殖、炎癥細胞浸潤和血管翳形成進行分項評分,分值越高表示損傷越嚴重?；ぜ毎鲋吃u分標(biāo)準(zhǔn):0分表示無增殖;1分表示2～4層滑膜細胞,輕微增殖;2分表示4層以上滑膜細胞,中度增殖;3分表示滑膜細胞過度增殖,侵蝕軟骨和骨。炎癥細胞浸潤評分標(biāo)準(zhǔn):0分表示正常;1分可見少數(shù)分散的白細胞浸潤;2分可見2個或2個以上白細胞聚集;3分可見白細胞融合,分散浸潤明顯。血管翳形成的評分標(biāo)準(zhǔn):0分無血管翳形成;1分有2個部位出現(xiàn)血管翳;2分有4個部位出現(xiàn)血管翳;3分有4個以上部位出現(xiàn)血管翳。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA):將小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織在研缽中碾碎后,使用含有PMSF的蛋白裂解液RIPA進行蛋白質(zhì)提取,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)試劑盒制造商的說明,通過ELISA檢測小鼠滑膜組織中TNF-α、IL-6的含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評分比較 見表2。模型組CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評分均高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。對照組與模型組的關(guān)節(jié)炎評分比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組小鼠在紅景天苷治療10 d后關(guān)節(jié)炎評分開始下降,治療30 d后關(guān)節(jié)炎評分表現(xiàn)出顯著的下降趨勢,實驗組各時間點的關(guān)節(jié)炎評分均低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組CIA小鼠關(guān)節(jié)炎評分比較(分)

2.2 各組關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織病理變化比較 見表3。通過HE染色對小鼠滑膜組織進行病理學(xué)評分,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織存在明顯的滑膜細胞增殖、炎癥細胞浸潤、血管翳形成等病理表現(xiàn)。從各組評分情況來看,模型組小鼠滑膜組織病理學(xué)各項評分均高于空白組小鼠的評分,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組相比,實驗組小鼠在紅景天苷治療后,滑膜增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成均得到改善,實驗組各項評分均低于對照組、模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組CIA小鼠滑膜組織病理改變程度評分(分)

2.3 各組關(guān)節(jié)炎小鼠促炎因子比較 見表4。通過ELISA測定滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6表達。與空白組比較,模型組、對照組、實驗組CIA模型小鼠滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6的水平均高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組CIA模型小鼠滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6的水平高于對照組、實驗組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組小鼠通過紅景天苷干預(yù)后抑制了TNF-α、IL-6的過度產(chǎn)生,實驗組TNF-α、IL-6水平均低于對照組、模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表4 各組小鼠滑膜組織中炎癥因子水平比較

2.4 各組CIA小鼠缺氧狀態(tài)比較 見表5。RA滑膜組織中的病理特征是缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是缺氧適應(yīng)反應(yīng)中的主要調(diào)節(jié)因子。通過RT-qPCR檢測CIA小鼠缺氧情況,見表5。CIA小鼠滑膜組織中HIF-1α mRNA顯著上調(diào),Nrf2 mRNA則降低,表明造模后小鼠滑膜組織存在缺氧狀態(tài)。實驗組小鼠在紅景天苷干預(yù)后HIF-1α mRNA降低而Nrf2 mRNA升高,且與對照組、模型組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表5 各組CIA小鼠缺氧相關(guān)因子mRNA比較

2.5 各組CIA小鼠PHD2、PP2A、MAPK的mRNA比較 見表6。CIA小鼠模型中PHD2、PP2A和MAPK的mRNA水平顯著上調(diào),模型組與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),表明RA誘導(dǎo)小鼠滑膜組織中PHD2/PP2A/MAPK信號的過度激活。實驗組小鼠在紅景天苷干預(yù)后滑膜組織中PHD2、PP2A、MAPK的mRNA水平均降低,且與模型組、對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表6 各組CIA小鼠PHD2、PP2A、MAPK的mRNA比較

3 討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作為病因不明的慢性侵襲性自身免疫性疾病,基本病理變化為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成[10]。全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的疼痛、關(guān)節(jié)腫脹和僵硬則大大降低患者生活質(zhì)量,由于目前缺乏治愈方案,緩解癥狀是治療RA的首要任務(wù),因此減輕臨床癥狀且耐受性較好的治療方案至關(guān)重要。

滑膜成纖維細胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖和新生血管生成是RA病情發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。缺氧是RA滑膜炎癥發(fā)展的重要因素。有研究表明,由于缺氧誘導(dǎo)HIF-1α在滑膜組織中高表達,有助于滑膜中炎癥基因表達和細胞存活[11-12]。鑒于缺氧環(huán)境下RA關(guān)節(jié)滑膜中浸潤的免疫細胞會上調(diào)HIF-1α并誘導(dǎo)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成而加劇滑膜炎癥,因此氧化應(yīng)激藥物有助于緩解RA炎性癥狀[13]。紅景天為多年生草本植物,主要生長在高海拔的嚴寒、缺氧、晝夜溫差大地區(qū),紅景天苷為其主要有效成分[14]。多項研究證明,減輕缺氧誘導(dǎo)的疾病癥狀可通過抑制氧化應(yīng)激實現(xiàn),如應(yīng)用于糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的治療[15-16]。氧化應(yīng)激藥物通過調(diào)節(jié)HIF-1α相關(guān)信號,抑制膽囊癌細胞增殖[17]。氧化應(yīng)激藥物通過PI3K、HIF-1途徑保護急性缺氧性神經(jīng)細胞免受損傷[18-19]。本研究結(jié)果證實,紅景天苷能有效緩解CIA模型小鼠的缺氧狀態(tài),緩解RA滑膜組織增生、血管再生和炎性癥狀。

RA的疾病進程不外乎因痰瘀致虛,痰瘀膠著關(guān)節(jié),閉阻經(jīng)絡(luò),中醫(yī)辨證認為需以化痰通絡(luò)、祛除風(fēng)寒濕邪為主要治療目的[20]。血瘀而致氣虛,在某種程度上可認為是滑膜微血管中氧灌注量減少的表現(xiàn),免疫炎癥細胞代償性激活炎癥信號以實現(xiàn)適應(yīng)性生存,導(dǎo)致滑膜的炎性侵襲及代謝減弱。紅景天苷因抗缺氧功效和抗炎功能發(fā)揮通經(jīng)舒絡(luò)、活血益氣功效,是緩解RA癥狀的有效藥物。

本實驗構(gòu)建了膠原蛋白誘導(dǎo)的RA小鼠模型,通過對比模型組和空白組的關(guān)節(jié)炎評分差異,確定膠原誘導(dǎo)的CIA模型構(gòu)建成功。再用紅景天苷對CIA模型小鼠進行治療,通過關(guān)節(jié)炎評分差異證明紅景天對緩解CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀有明顯改善效果?；ぱ荇栊纬墒荝A的核心病理變化,血管新生是產(chǎn)生血管翳的必要條件,內(nèi)皮細胞的增殖和游走形成新的血管,在RA的早期,炎癥細胞向關(guān)節(jié)腔遷移和侵襲,滑膜絨毛增生并伴隨著新生血管的形成滑膜增生和炎癥造成關(guān)節(jié)腔內(nèi)缺氧狀態(tài),致使HIF-1α激活。接著通過HE染色對比紅景天苷治療與否的CIA小鼠滑膜組織的病理程度改變,結(jié)果顯示紅景天苷能顯著減輕CIA小鼠滑膜組織中細胞增殖、炎癥細胞浸潤、血管翳形成,通過ELISA驗證了紅景天苷治療能顯著降低滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6的表達,進一步實驗結(jié)果證實紅景天苷能下調(diào)HIF-1α水平,表現(xiàn)為有效緩解CIA模型小鼠的缺氧狀態(tài)。因此紅景天苷通過緩解RA滑膜組織增生、血管再生、炎性癥狀和改善缺氧達到治療RA的作用?；そM織中FLS缺氧是RA疾病進展的重要因素,缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α信號通路上調(diào)對于疾病發(fā)展起著重要調(diào)節(jié)作用,因此以HIF-1α信號為靶點的藥物對RA癥狀有明顯改善效果。本研究結(jié)果表明,紅景天對HIF-1αmRNA水平有顯著抑制作用,于是之后對其中的分子機制進行探究。

脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白(Prolyl hydroxylase domain proteins,PHD)是利用氧靶向HIF-1、HIF-2的α亞基進行蛋白酶體降解的酶,缺氧誘導(dǎo)PHD活性下降從而實現(xiàn)HIF蛋白穩(wěn)定性,啟動包括血管生成、ROS清除等適應(yīng)性反應(yīng)[21]。已有證據(jù)表明,PHD2活化是由蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)介導(dǎo),在血管生成中發(fā)揮重要作用[22]。PP2A在細胞凋亡、增殖等多種細胞過程中具有調(diào)節(jié)作用,涉及的途徑包括抑制MAPK途徑調(diào)節(jié)足細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、PP2A可以與MAPK相互作用調(diào)節(jié)促進心臟干細胞遷移[23-24]。紅景天苷可提高高原環(huán)境下機體的血氧飽和度,增強機體對高原低氧環(huán)境的耐受能力,并可抑制氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)PHD2/HIF-1α水平[25]。本研究測定了紅景天苷干預(yù)后CIA模型小鼠HIF-1α水平變化,結(jié)果顯示HIF-1α降低,說明紅景天苷對缺氧的改善效果較好。基于PHD2對HIF-1α轉(zhuǎn)錄調(diào)控[26],本研究進一步驗證了紅景天苷對PHD2/PP2A/MAPK信號通路的抑制作用,且通過體內(nèi)研究數(shù)據(jù)結(jié)果表明,部分通過PHD2/PP2A/MAPK信號通路調(diào)節(jié)。

綜上所述,紅景天苷在緩解CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎癥和滑膜組織增生中效果較好,其中的分子涉及PHD2/PP2A/MAPK信號通路調(diào)節(jié)。本研究尚未明確紅景天苷抑制PHD2/PP2A/MAPK信號通路的具體分子機制以及對缺氧相關(guān)因子的調(diào)控是否為通路;紅景天苷是否可以通過其他信號緩解RA炎性癥狀、改善缺氧狀態(tài),這些都需要進一步研究。