殷飛 倪毅 劉偉 錢煒偉 劉蕾 馬家禮 許桐林

目前乳腺癌成為了中國(guó)女性最常見的癌癥。2018 年, 乳腺癌在我國(guó)女性最常見的5 種惡性腫瘤中排第1 位, 占我國(guó)惡性腫瘤患者總數(shù)的19.2%；在女性5 種最常見的癌癥相關(guān)死亡原因中位于第4 位, 占我國(guó)癌癥總死亡人數(shù)9.1%［1］。目前早期乳腺癌患者即使給予了規(guī)范化的治療, 仍有30%～40%有可能發(fā)生轉(zhuǎn)移［2］。因此從分子層面了解乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展發(fā)病機(jī)制尤為重要。

CircRNA 是一類非線性的非編碼核糖核酸(RNA),它們通過特殊的反向拼接, 形成不含3'末端和5'末端的共價(jià)閉合連續(xù)環(huán)。1976 年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)類病毒是單鏈共價(jià)封閉的CircRNA 分子［3］。早期研究認(rèn)為CircRNA是線性信使RNA(mRNA)加工過程中誤剪接的副產(chǎn)品,沒有特殊功能［4］。隨著高通量RNA 測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用, 目前CircRNA 作為一類新的非編碼RNA 被人們重視。CircRNA 從產(chǎn)生機(jī)制上可以分為外顯子CircRNA、內(nèi)含子CircRNA、內(nèi)含子-外顯子CircRNA。CircRNA 的功能主要有：內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA), 海綿擦拭微小RNA(miRNA)；調(diào)控蛋白的表達(dá)；調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)CircRNA在乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用, 現(xiàn)就CircRNA 在乳腺癌中的研究進(jìn)展總結(jié)如下。

1 乳腺癌中CircRNA 的表達(dá)變化

CircRNA 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用, 很多學(xué)者分析和檢測(cè)了乳腺癌相關(guān)CircRNA 的表達(dá)變化。Li 等［6］使用ceRNA 微陣列技術(shù)檢測(cè)在6 對(duì)乳腺癌和相應(yīng)的癌旁組織中篩選出4370 個(gè)異常表 達(dá)CircRNA, 其 中2735 個(gè) 上 調(diào), 1995 個(gè) 下 調(diào)。進(jìn)一步使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)確認(rèn)了hsa_circ_0069094、hsa_circ_0062558、hsa_circ_0074026、hsa_circ_0079876 在乳腺癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào), hsa_circ_0017536、hsa_circ_0023302、hsa_circ_0017650、hsa_circ_0017545 表達(dá)下調(diào)。Yan 等［7］高通量測(cè)序技術(shù)在乳腺癌干細(xì)胞中篩選出27 個(gè)異常表達(dá)的CirRNA(fold change≥1.8, Pvalue ＜ 0.05), 其 中19 個(gè)表達(dá)下調(diào), 8 個(gè)表達(dá)上調(diào)；并隨機(jī)選取了circVRK1,circBRIP, circOLA, circETFA, circMED13 和circBCL11B進(jìn)行PCR 驗(yàn)證, 最終證明PCR 結(jié)果與RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)一致。Yin 等［8］從5 個(gè)乳腺癌和配對(duì)健康志愿者的血漿中利用微陣列分析發(fā)現(xiàn)41 個(gè)CircRNA 異常表達(dá)(fold change≥2), 其中19 個(gè)上調(diào)和22 個(gè)下調(diào), 通過PCR 確認(rèn)了hsa_circ_0001785、hsa_circ_0108942 上調(diào)和hsa_circ_0068033 下調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血中表達(dá)術(shù)后明顯低于術(shù)前。Yuan 等［9］利用微陣列技術(shù)在激素受體陽性的乳腺癌組織中鑒別出3653 個(gè)異常CircRNA, 其中1953 個(gè) circRNAs 表達(dá)上調(diào), 1700 個(gè)circRNA 表達(dá)下調(diào)；后續(xù)利用定量PCR技 術(shù), 驗(yàn) 證 了hsa_circ_0072304, hsa_circ_0087378 和hsa_circ_0087377 在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。He 等［10］對(duì)3 個(gè)三陰性乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、MDAMB-468 和BT549)和1 個(gè)HME 細(xì) 胞 系(MCF-10A)進(jìn)行了高通量微陣列分析, 發(fā)現(xiàn)174 個(gè)CircRNA 表達(dá)下 調(diào), 93 個(gè)CircRNA 表 達(dá) 上 調(diào)(P＜0.05, FDR＜0.05)。Fu 等［11］利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)比較了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系231 和對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231, 發(fā) 現(xiàn) 共 有215 個(gè)circRNA 上 調(diào), 191 個(gè)circRNA 下調(diào), 進(jìn)一步PCR 驗(yàn)證了hsa_circ_0001944、hsa_circ_0001481、hsa_circ_0000646、hsa_circ_0001006和hsa_circ_0000732 上 調(diào), hsa_circ_0001910、hsa_circ_0008285 和hsa_circ_0000002 下 調(diào)。Gao 等［12］通過微陣列技術(shù)從阿霉素耐藥MCF-7 乳腺癌細(xì)胞和親本MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中鑒別出18 個(gè)表達(dá)變化的Circ RNA, 其中hsa_circ_0002113、hsa_circ _0001667、hsa_circ_0006528 等12 個(gè) 上 調(diào), hsa_circ_0008131、hsa_circ_0003838、hsa_circ _0007551 等6 個(gè)下調(diào)。

CircRNA 在乳腺癌組織、干細(xì)胞、外周血以及不同的分子分型中、乳腺癌轉(zhuǎn)移及耐藥均有表達(dá)變化, 說明CircRNA 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移及治療過程中均起到重要作用, 因此研究乳腺癌中表達(dá)變化CircRNA 的功能, 對(duì)進(jìn)一步了解乳腺癌的病變機(jī)制及治療有著重要作用。

2 CircRNA 在乳腺癌中的生物學(xué)功能及調(diào)控

miRNA 在乳腺癌致癌過程中調(diào)節(jié)基因表達(dá), 調(diào)節(jié)惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。CircRNA 在乳腺作用miRNA 的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA, 海綿吸附MirRNA 調(diào)節(jié)下游蛋白的表達(dá), 形成CircRNA/miRNA/蛋白軸。Pan等［13］發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0061825 (circ-TFF1)在乳腺癌中表達(dá)上調(diào), 功能上海綿吸附miR-326 上調(diào)TFF1 表達(dá), 通過miR-326/TFF1 軸介導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展, 敲除Circ-TFF1 阻礙乳腺癌細(xì)胞在體外的增殖、遷移、侵襲。Tang 等［14］發(fā)現(xiàn) CirKIF4A 在三陰性乳腺癌中表達(dá)上調(diào), 功能上作為Mir-375 的海綿調(diào)節(jié)KIF4A 的表達(dá),形成 CirKIF4A/miR-375/KIF4A 軸調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。Xiao 等［15］發(fā)現(xiàn)CircAHNAK1 在三陰性乳腺中表達(dá)顯著下調(diào), CircAHNAK1 作為miR-421 海綿, 減弱miR-421 對(duì)其靶基因RASA1 的抑制作用, 過表達(dá)Circ AHNAK1 可抑制三陰性乳腺癌的增殖、遷移以及體外侵襲。Zhou 等［16］發(fā)現(xiàn)CircFBXL5(hsa_circ_0125597)在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移組織中上表達(dá)上調(diào), 功能上作為海綿與miR-660 結(jié)合調(diào)節(jié)SRSF6 表達(dá), 功能分析提示敲除CircFBXL5, 能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和向肺的遷移。Sang 等［17］發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0025202 他莫昔芬耐藥的MCF-7 細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào), 功能上作為miR-182-5p 的 海 綿, 調(diào) 控miR-182- 5p/FOXO3a 軸,能抑制細(xì)胞增殖、集落形成和遷移, 增加細(xì)胞凋亡和對(duì)他莫昔芬的敏感性。

上述研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中CircRNA 作為miRNA海綿在乳腺發(fā)生、分子分型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及耐藥過程中發(fā)揮調(diào)控作用, 但是也有一部通過部分研究提示CircRNA 通過其他方式調(diào)控乳腺癌, 如調(diào)控信號(hào)通路、編 碼 蛋 白。Zhou 等［18］發(fā) 現(xiàn)hsa_circ_0011946/RFC3信號(hào)通路可抑制乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Ma 等［19］發(fā)現(xiàn)在對(duì)紫杉醇耐藥的三陰性乳腺癌細(xì)胞系中CircAMOTL1 具有調(diào)節(jié)AKT 通路的功能, 通過激活A(yù)KT 產(chǎn)生磷酸化的AKT, 抑制細(xì)胞凋亡, 促進(jìn)細(xì)胞存活。Wang 等［20］研究發(fā)現(xiàn)circ_0067934 在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào), 具有調(diào)控蛋白的功能, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除circ_0067934, 發(fā)現(xiàn)MCL-1 表達(dá)降低；通過上調(diào)蛋白MCL-1 來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖, 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。Ye 等［21］發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中CircFBXW7 具有編碼的FBXW7-185AA 蛋白的功能, 通過上調(diào)FBXW7的表達(dá)來抑制三陰性乳腺癌的進(jìn)展。Du 等［22］發(fā)現(xiàn)circSKA3 在乳腺癌細(xì)胞系表達(dá)上調(diào), 功能上可以結(jié)合TKS5 和Integrinβ1, 誘導(dǎo)侵襲性偽足的形成, 促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。目前乳腺癌CircRNA 相關(guān)的上游調(diào)控機(jī)制研究較少, Zheng 等［23］發(fā)現(xiàn)E2F1 和EIF4A3 分別結(jié)合了SEPT9 基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄前體RNA, 對(duì)CircSEPT9 的生成有調(diào)控作用。

綜上可知, CircRNA 對(duì)乳腺癌的調(diào)控是多途徑, 可以作為miRNA 海綿, 可以調(diào)節(jié)乳腺癌的相關(guān)信號(hào)通路,可以編碼相應(yīng)的蛋白, 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用。

3 CircRNA 在乳腺癌臨床診療中的應(yīng)用

3.1 CircRNA 成為乳腺癌潛在的診斷及判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物 早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是目前降低乳腺癌死亡率, 提高治愈率的關(guān)鍵。目前乳腺癌主要診斷方法包括超聲、鉬靶和穿刺活檢等是侵入性或昂貴的, 因此微創(chuàng)和便宜的方法是迫切需要的。此外, 乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)乳腺癌的術(shù)后治療起到重要指導(dǎo)作用。Li 等［6］發(fā)現(xiàn)CircRNA 在乳腺癌患者血漿與正常人血漿表達(dá)水平的顯著差異, hsa_circ_0069094、hsa_circ_0079876 上 調(diào), hsa_circ_0017650 和hsa_circ_0017536 下調(diào), 因此可以作為乳腺癌診斷潛在血液標(biāo)記物。Yin 等［8］研究示提了與健康人群比較, 乳腺癌患者外周血中hsa_circ_0001785、hsa_circ_0108942上調(diào)和hsa_circ_0068033 下調(diào), 受試者工作特征曲線(ROC)顯示hsa_circ_0001785 的診斷價(jià)值［曲線下面積(AUC)=0.771］優(yōu)于其他CircRNA；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001785 在乳腺癌患者血中表達(dá)術(shù)后明顯低于術(shù)前, 因此hsa_circ_0001785 有成為乳腺癌潛在診斷標(biāo)記物的價(jià)值。Liu 等［24］研究提示hsa_circ_001783 在乳腺癌中表達(dá)上調(diào), 高水平的hsa_circ_001783 與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān), 因此可作為乳腺癌的一種新的預(yù)后標(biāo)記物。Zeng 等［25］研究發(fā)現(xiàn)circANKS1B 在三陰性乳腺癌中表達(dá)增加與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及晚期臨床密切相關(guān), 是乳腺癌患者整體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Li 等［26］發(fā)現(xiàn)circ-VRK1 在乳腺癌組織及細(xì)胞系中下調(diào), 具有抑制細(xì)胞增殖, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用, 可作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Yan 等［27］發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織比,hsa_circ_0072309 在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào), 具有抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的功能, 可以作為判斷乳腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。

3.2 CircRNA 具有成為乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)的可能目前, 許多circRNA 已被證明與乳腺癌的增殖和進(jìn)展有關(guān), 表明它們有在乳腺癌治療中作為靶點(diǎn)的潛在作用。CircRNA 有望為乳腺癌治療提供新的途徑, 目前,一些技術(shù)為部分或完全去除致癌CircRNA 提供了可能,如小干擾RNA(siRNA)的技術(shù)。Zhou 等［16］發(fā)現(xiàn)敲除CircFBXL5, 能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和向肺的遷移,可以作為乳腺癌肺轉(zhuǎn)移治療潛在靶點(diǎn)。Zeng 等［25］證明在三陰性乳腺中ESRP1/CircANKS1B/miR-148a/152-3p/USF1 通路通過誘導(dǎo)TGF-β1介導(dǎo)的乳腺癌上皮間質(zhì)化, 促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移, CircANKS1B 作為治療靶點(diǎn)可更好地預(yù)防乳腺癌轉(zhuǎn)移。

3.3 CircRNA 具有逆轉(zhuǎn)乳腺治療耐藥的可能 化療、內(nèi)分泌治療是乳腺癌全身治療的主要方法, 但是內(nèi)分泌或化療耐藥性而降低臨床治療效果, 導(dǎo)致相關(guān)乳癌患者預(yù)后差。因此了解乳腺癌發(fā)病過程中引起耐藥的分子途徑是至關(guān)重要。Ma 等［19］發(fā)現(xiàn)CircAMOTL1 在對(duì)紫杉醇耐藥的三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào), 能夠增加細(xì)胞活力, 減少細(xì)胞凋亡, 增強(qiáng)侵襲能力, 通過調(diào)節(jié)AKT 途徑、促進(jìn)抗凋亡蛋白和抑制促凋亡蛋白, 能降低紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷。Gao等［12］從阿霉素耐藥的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào), 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Circ0006528/miR-7-5p/Raf1 軸在乳腺癌阿霉素耐藥中起到調(diào)節(jié)作用。Liang 等［28］發(fā)現(xiàn)在有轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中CircBMPR2 的表達(dá)下調(diào)。在功能上, 敲除CircBMPR2 有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外, 敲除CircBMPR2 通過抑制他莫昔芬誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥性,CircBMPR2 表達(dá)上調(diào)能降低他莫昔芬耐藥性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CircBMPR2 海綿擦拭miR-553, 減輕USP4的抑制作用, 以抑制乳腺癌的進(jìn)展和他莫昔芬的耐藥性。Sang 等［17］在他莫昔芬耐藥的乳腺癌MCF-7 篩查出hsa_circ_0025202 表達(dá)下調(diào), 功能有增加他莫昔芬的敏感性作用。Liu 等［29］在Monastrol 耐藥的乳腺癌細(xì)胞系中篩選出CircRNA-MTO1 (hsa_circRNA_007874)在細(xì)胞系中下調(diào), 提高circRNA-MTO1 表達(dá)能增加Monastrol 的作用, 逆轉(zhuǎn)耐藥。因此抑制表達(dá)上調(diào)的耐藥CircRNA 或上調(diào)表達(dá)下調(diào)的藥敏circRNA 具有逆轉(zhuǎn)臨床乳腺癌治療耐藥的可能。

CircRNA 剛發(fā)現(xiàn)時(shí)認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接的無功能產(chǎn)物,但目前研究發(fā)現(xiàn)CircRNA 具有包括海綿、翻譯等多種功能。根據(jù)本文綜述可知CircRNA 參與乳腺癌的各種生物學(xué)過程, 包括增殖、遷移、侵襲、凋亡和轉(zhuǎn)移, 可以作為乳腺癌診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)。CircRNA 為乳腺癌的診斷和治療提供了新的視角, 然而目前研究中仍有很多不足。盡管目前已經(jīng)發(fā)表了很多關(guān)于乳腺癌CircRNA 研究的文章, 但關(guān)于CircRNA 在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中的確切機(jī)制還需深入研究。目前乳腺癌CircRNA 的研究主要集中于組織樣本, 對(duì)血液中及循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的研究尚有不足。CircRNA 的功能研究主要集中在其下游調(diào)控機(jī)制及作用, 其上游調(diào)控機(jī)制目前研究較少。CircRNA 具有成為潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物潛力,但其臨床意義還進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量的研究。CircRNA具有作為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)可能, 如何有效的增加具有抑癌作用CircRNA 的表達(dá), 或降低或敲除具有促癌作用CircRNA 的表達(dá)滿足臨床治療的需要仍有待進(jìn)一步研究。隨著技術(shù)進(jìn)步, 未來CircRNA 在臨床應(yīng)用將為癌癥治療帶來巨大的進(jìn)步。