1.研究背景

慢性疼痛是一種實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)的一種不愉快感覺和情緒情感體驗(yàn)。這種疼痛可能是另一種疾?。ㄈ缣悄虿。┰斐傻睦^發(fā)性疼痛，也可能是治療（如化療）造成的疼痛。神經(jīng)病理性疼痛是由于軀體感覺系統(tǒng)受損，表現(xiàn)為對誘發(fā)的感覺刺激的超敏反應(yīng)（異常疼痛或痛覺過敏）以及持續(xù)的疼痛。臨床上對神經(jīng)病理性疼痛缺乏有效的鎮(zhèn)痛管理。

脊髓后角神經(jīng)元具有通過導(dǎo)致非適應(yīng)性可塑性的關(guān)鍵機(jī)制來適應(yīng)神經(jīng)元應(yīng)激的能力。這些機(jī)制可以維持興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡，但在慢性疼痛過程中，興奮性通路主要由一個(gè)促GABA能神經(jīng)興奮引起。這些感覺神經(jīng)元在壓力下如何變化尚不清楚。盡管神經(jīng)組織可以重新規(guī)劃代謝途徑維持持續(xù)的神經(jīng)元功能，但它們易受缺氧影響。血管功能紊亂常伴隨著神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展（如阿爾茨海默?。?，周圍肢體缺血與疼痛發(fā)作之間的因果關(guān)系已經(jīng)被證明。既往的研究已經(jīng)探索了神經(jīng)系統(tǒng)對血流的水平調(diào)節(jié)及其對痛覺處理和疼痛行為調(diào)節(jié)的影響。糖尿病嚙齒類動物模型中脊髓后角血流量的減少，可能是由于血管分布減少，并與疼痛超敏反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。血管完整性是由血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)家族蛋白介導(dǎo)的，通過VEGF 受體2(VEGFR2) 傳遞信號。血管內(nèi)皮生長因子是血管生成功能的主要調(diào)節(jié)因子，VEGF 表達(dá)的波動與生理功能和發(fā)病機(jī)制相關(guān)的不同的內(nèi)皮細(xì)胞活性有關(guān)。VEGF 的高表達(dá)和VEGFR2 介導(dǎo)的信號通路驅(qū)動血管異常擴(kuò)張相關(guān)，而VEGFR2 信號通路的減弱導(dǎo)致血管修剪。有趣的是，系統(tǒng)性內(nèi)皮特異性敲除VEGFR2 可降低脊髓中的血管密度，并通過減少脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化來降低關(guān)節(jié)炎動物模型中的傷害性行為超敏反應(yīng)。因此，該研究著手確定脊髓血管稀疏本身是否引發(fā)神經(jīng)病理性疼痛表型。

該研究表明脊髓微血管系統(tǒng)在維持感覺神經(jīng)元調(diào)節(jié)中至關(guān)重要，并證明對脊髓后角的血管支持的改變有助于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展。1 型糖尿病和轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物（內(nèi)皮特異性VEGFR2 基因敲除）脊髓血管減少模型表明，局限性血管變性誘導(dǎo)脊髓后角低氧微環(huán)境，導(dǎo)致神經(jīng)元激活和神經(jīng)病理性疼痛的啟動。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生依賴于低氧反應(yīng)，特別是低氧誘導(dǎo)基因的上調(diào)和碳酸氫鹽代謝的改變，而碳酸酐酶的抑制可以阻止這種改變。這些結(jié)果為鎮(zhèn)痛的發(fā)展提供了一個(gè)潛在的新的治療策略。

2.研究結(jié)果

（1）脊髓后角缺氧與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系

為了確定糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的增加是否與血管損失和缺氧有關(guān)，該研究使用了對機(jī)械性和熱性傷害行為超敏反應(yīng)的I 型大鼠模型。與對照組相比，糖尿病大鼠的缺氧脊髓后角神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，而在后角識別的神經(jīng)元總數(shù)略有減少。這些結(jié)果表明，血管缺失引起的缺氧可能是糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的誘發(fā)因素之一。

既往研究證明，VEGFR2ECKO小鼠與野生小鼠相比，對傷害性的反應(yīng)無明顯變化，但是對關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)引起的痛覺過敏和異常疼痛有抵抗作用。為了確定VEGFR2ECKO小鼠是否有血管密度、缺氧和細(xì)胞數(shù)量的變化，使用三苯氧胺對脊髓進(jìn)行染色。與對照組相比，VEGFR2ECKO小鼠膠原袖的數(shù)量增加，表明血管稀疏。盡管VEGFR2ECKO不影響脊髓后角神經(jīng)元數(shù)量，但后角低氧探針標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，表明低氧是VEGFR2ECKO帶來的結(jié)果。與野生型小鼠相比，VEGFR2ECKO小鼠對熱的戒斷潛伏期較低。

血管存活需要內(nèi)源性VEGFR2 激活，包括食管、皮膚、唾液腺以及其他組織。然而，形成部分血腦屏障的脊髓血管是否需要VEGFR2 信號傳導(dǎo)尚不清楚。因此，該研究試圖確定脊髓VEGFR2 信號在脊髓微血管中是否完整。已知VEGF-A165a直接作用于脊髓后角，可通過活體顯像測量血管通透性。與被VEGFR2 抑制劑ZM323881 阻斷的載體對照相比，VEGF-A165 增加了血液-脊髓屏障的溶質(zhì)通透性。

（2）脊髓限制性后角血管病變誘發(fā)慢性疼痛

既往探索的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪窍到y(tǒng)性血管病變嚙齒動物模型，這意味著大腦和外周的疼痛處理可能會改變，從而影響敏感性。為了確定脊髓血管本身是否能調(diào)節(jié)傷害性反應(yīng)，研究建立了一個(gè)精細(xì)的模型，誘導(dǎo)了局限于脊髓的血管病變。從WT 小鼠和VEGFR2CreERT2小鼠脊髓中提取內(nèi)皮細(xì)胞，4-羥基他莫西芬(OHT)處理后測定細(xì)胞活力。與WT 小鼠相比，4-羥基他莫西芬(OHT)處理導(dǎo)致VEGFR2CreERT2小鼠脊髓內(nèi)皮細(xì)胞活力顯著降低，呈濃度依賴性。為了確定在體內(nèi)是否也是明顯的，將OHT 鞘內(nèi)注射到腰椎膨大區(qū)產(chǎn)生脊髓內(nèi)皮特異性VEGFR2 敲除(VEGFR2scECKO) 小鼠。與WT 小鼠相比，VEGFR2scECKO小鼠脊髓中的內(nèi)皮標(biāo)志物VE-cadherin、CD31 和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 含量也降低。此外，VEGFR2scECKO小鼠的內(nèi)皮標(biāo)記物的蛋白表達(dá)減少。值得注意的是，這些內(nèi)皮標(biāo)記物（ZO1 和CD31）在WT 或VEGFR2scECKO小鼠L3～L5背根神經(jīng)節(jié)中的蛋白表達(dá)沒有變化，表明這種誘導(dǎo)僅限于脊髓。

鞘內(nèi)OHT 治療導(dǎo)致VEGFR2scECKO小鼠脊髓后角微血管顯著變性，血管直徑和總血管覆蓋體積減小。此外，VEGFR2scECKO小鼠的脊髓后角血管灌注減少，表現(xiàn)為Tritc 葡聚糖標(biāo)記的血管減少。這種血管灌注的減少伴隨著脊髓后角1～5 層中低氧探針標(biāo)記的神經(jīng)元的增加。在WT 小鼠和VEGFR2scECKO小鼠中，后角神經(jīng)元總數(shù)沒有變化。VEGFR2scECKO小鼠有熱超敏反應(yīng)，但機(jī)械戒斷閾值或運(yùn)動行為沒有變化。WT 小鼠在OHT 處理后熱戒斷潛伏期和機(jī)械戒斷閾值沒有變化。

（3）缺氧信號在后角神經(jīng)元中的誘導(dǎo)

VEGFR2scECKO小鼠在后角神經(jīng)元（用神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN 標(biāo)記）顯示缺氧誘導(dǎo)因子1A (HIF1α)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3 (GLUT3)的表達(dá)增加，HIF1αmRNA和缺氧反應(yīng)基因碳酸酐酶VII (CA7)和GLUT3 顯著增加。有趣的是，在I 型嚙齒動物和2 型嚙齒動物糖尿病模型中，HIF1α 的增加也有所增加。

（4）缺氧誘導(dǎo)與慢性疼痛的發(fā)病

這些結(jié)果都提示由于血管丟失而導(dǎo)致的缺氧可誘發(fā)行為超敏反應(yīng)。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，在WT 小鼠鞘內(nèi)注射化學(xué)缺氧模擬DMOG。鞘內(nèi)注射DMOG后24 小時(shí)，與對照相比，機(jī)械刺激縮足閾值和熱縮足潛伏期顯著降低。脊髓神經(jīng)元CA7 表達(dá)增高，GLUT3 和HIF1α 表達(dá)增高。此外，鞘內(nèi)注射DMOG 后，表達(dá)FOS 免疫反應(yīng)的后角神經(jīng)元數(shù)量增加。此外，與對照處理的樣本相比，在模擬缺氧處理24 小時(shí)后，分離的脊髓神經(jīng)元表現(xiàn)出氯化鉀誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流增加。在脊髓切片上使用多電極陣列，發(fā)現(xiàn)DMOG 處理后在脊髓后角方面與載藥處理的腰段脊髓切片相比，基線神經(jīng)元活性增加。在脊髓腰段的分離神經(jīng)元暴露于不同的環(huán)境氧條件下，常氧和缺氧導(dǎo)致HIF1α、CA7 和GLUT3 增加。此外，KCC2 被下調(diào)。

（5）碳酸酐酶介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的慢性疼痛

該研究通過敲除VEGFR2 基因發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)后脊髓內(nèi)皮細(xì)胞CA7 上調(diào)。為了確定這是否介導(dǎo)了神經(jīng)元超敏反應(yīng)，該研究用DMOG 處理24 小時(shí)，結(jié)果顯示與載體處理相比，HIF1α 和CA7 的蛋白表達(dá)增加。同樣，鞘內(nèi)注射DMOG 導(dǎo)致HIF1α 和CA7蛋白表達(dá)增加。非選擇性碳酸酐酶抑制劑ACZ 腹腔注射可減輕DMOG 引起的傷害性行為超敏反應(yīng)。乙酰唑胺增加機(jī)械戒斷閾值，恢復(fù)到與對照組相同的閾值。同樣，在DMOG 處理的實(shí)驗(yàn)隊(duì)列中，熱退出潛伏期增加到正常值。乙酰唑胺還增加了VEGFR2scECKO小鼠的戒斷潛伏期，部分恢復(fù)了它們對對照治療的反應(yīng)。

3.討論

慢性疼痛是通過神經(jīng)元活動的改變引起的，其中血管系統(tǒng)通過誘導(dǎo)炎癥信號在長期疼痛過敏的表現(xiàn)中起著關(guān)鍵作用。該研究在這里探討了血管功能障礙如何通過減少血流量和隨后的脊髓水平的缺氧來調(diào)節(jié)傷害感受加工。目前，這些與中樞敏化誘導(dǎo)相關(guān)的機(jī)制是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展的基礎(chǔ)，氯化物和碳酸氫鹽穩(wěn)態(tài)是GABA 介導(dǎo)的興奮的組成部分。在這項(xiàng)研究中，該研究發(fā)現(xiàn)脊髓血液灌注減少可誘導(dǎo)缺氧介導(dǎo)的后角脊髓神經(jīng)元激活和慢性疼痛表現(xiàn)。重要的是，慢性疼痛行為是通過抑制碳酸酐酶活性來抑制的。

（1）血管病變、VEGFR2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與傷害性感覺

神經(jīng)系統(tǒng)血流的損害與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展密切相關(guān)，如阿爾茨海默病，也是神經(jīng)系統(tǒng)缺血性疾?。ㄈ缱渲校┑母驹颉Ｖ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中的體感系統(tǒng)適應(yīng)微環(huán)境中這種波動的潛在機(jī)制尚不清楚。這里提出的研究表明，脊髓血管供應(yīng)的減少足以引發(fā)疼痛。

慢性疼痛是一種非常普遍的病理狀態(tài)，影響著大部分人群，其發(fā)病和嚴(yán)重程度與年齡或疾病的進(jìn)展有關(guān)。毛細(xì)血管健康也受到年齡和疾病的很大影響，血管數(shù)量減少和血管收縮張力頻率增加與神經(jīng)病理有關(guān)。脊髓毛細(xì)血管網(wǎng)的內(nèi)皮變性與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展有關(guān)，內(nèi)皮特異性VEGFR2 信號的丟失高度歸因于疼痛超敏反應(yīng)的增強(qiáng)。在健康和疾病中，血管內(nèi)皮生長因子2 信號通過成熟的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)和血管通透性的調(diào)節(jié)對血管功能的發(fā)展和維持是不可或缺的。在神經(jīng)疾病中，VEGFR2 信號的改變導(dǎo)致血管缺損，從而導(dǎo)致神經(jīng)元功能下降。此外，補(bǔ)充VEGF-A 已被證明可以防止神經(jīng)系統(tǒng)血管病變的發(fā)展，從而抑制神經(jīng)疾病。在脊髓方面，VEGFR2 的表達(dá)和活性通過調(diào)節(jié)血管通透性與脊髓內(nèi)皮功能有關(guān)。因此，研究表明VEGFR2 在脊髓內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的缺失導(dǎo)致了整個(gè)后角毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的減少，支持了VEGFR2 在維持毛細(xì)血管健康中的整體作用。先前的研究探索了系統(tǒng)的VEGFR2 敲除，似乎影響了與體感網(wǎng)絡(luò)有關(guān)的更廣泛的背景。目前的認(rèn)識表明，脊髓內(nèi)的微血管功能通過在后角內(nèi)形成一個(gè)明顯的促炎環(huán)境來誘導(dǎo)疼痛超敏性。最近的證據(jù)強(qiáng)調(diào)內(nèi)皮源性緊密連接蛋白的丟失和炎細(xì)胞黏附的增強(qiáng)推動了脊髓血管通透性的增加。因此，脊髓內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2 依賴性功能的損傷阻止了血管通透性，并抑制了促炎源性疼痛超敏性的發(fā)生。在本研究中，VEGFR2 敲除僅限于脊髓內(nèi)皮，能夠探究血管和神經(jīng)元系統(tǒng)之間與疼痛調(diào)制有關(guān)的相互作用。誘導(dǎo)VEGFR2 特異性地在脊髓內(nèi)皮細(xì)胞中被擊倒導(dǎo)致熱傷害性超敏反應(yīng)。

（2）缺氧性慢性疼痛

在慢性疼痛的嚙齒類動物模型中，脊髓后角微血管的丟失和隨后毛細(xì)血管灌注的丟失與缺氧信號的誘導(dǎo)有關(guān)。神經(jīng)元組織代謝活躍；神經(jīng)元的活動與營養(yǎng)支持的提供相結(jié)合，因此，神經(jīng)組織的血供是至關(guān)重要的。而且神經(jīng)元對氧和營養(yǎng)輸送的波動高度敏感，神經(jīng)元的完整性因營養(yǎng)支持的減少而受到損害。神經(jīng)組織環(huán)境的改變，如組織氧水平的降低，損害了神經(jīng)組織的完整性，改變了神經(jīng)元的活動，導(dǎo)致病理性神經(jīng)殘疾、癲癇和認(rèn)知障礙。在誘導(dǎo)血管變性和誘導(dǎo)缺氧機(jī)制后，后角神經(jīng)元的神經(jīng)元活動水平增加。在慢性疼痛的嚙齒類動物模型和糖尿病神經(jīng)病理性疼痛病人的脊髓損傷中觀察到了這種活性。此外，本研究強(qiáng)調(diào)的缺氧是疼痛過敏發(fā)作的一個(gè)重要誘因。然而，其他因素（包括代謝紊亂和炎癥）也是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展的罪魁禍?zhǔn)祝谔悄虿∩窠?jīng)病理性疼痛的時(shí)間過程中需要考慮。向外周感覺神經(jīng)系統(tǒng)的血流受損導(dǎo)致嚙齒類動物疼痛行為加劇，伴隨著外周感覺活動增強(qiáng)典型的血管阻塞后慢性疼痛狀態(tài)的開始。目前，關(guān)于脊髓水平的后角神經(jīng)元與血流量減少之間關(guān)系的研究很少。然而，血流量和組織氧水平的減少會損害運(yùn)動神經(jīng)元的活動，這是血流量對神經(jīng)元功能的意義的基礎(chǔ)。在這項(xiàng)研究中，使用引起慢性疼痛的血管病變嚙齒類動物模型，證明了脊髓后角明顯的缺氧信號，與神經(jīng)元激活有關(guān)。c-fos（神經(jīng)元激活標(biāo)志物）的表達(dá)增加伴隨著HIF1a、GLUT3 和CA7 等缺氧標(biāo)志物的表達(dá)水平升高。前人對低氧對感覺神經(jīng)元影響的研究表明，背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元在低氧條件下是激活的。此外，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展與神經(jīng)血管破壞和感覺神經(jīng)退行性變導(dǎo)致的氧減少內(nèi)在地相關(guān)。后角神經(jīng)元的活動以前被證明受到缺氧和HIF1α 激活的影響。在外周感覺神經(jīng)元激活后，背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元中HIF1α 表達(dá)的減少與c-fos表達(dá)神經(jīng)元數(shù)量的減少有關(guān)。然而，缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元特異性GLUT3 和CAR7 的表達(dá)強(qiáng)調(diào)了脊髓后角神經(jīng)元對組織微環(huán)境變化的假定適應(yīng)，突觸可塑性可能演變?yōu)槁蕴弁幢憩F(xiàn)的可能途徑。有趣的是，該研究在VEGFR2scECKO中沒有看到DRG 血管標(biāo)記物的變化，但疼痛行為發(fā)生了變化，這表明盡管DRG 可能有所貢獻(xiàn)，但也有明顯的脊髓受累。

識別那些負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能和突觸可塑性的神經(jīng)元適應(yīng)機(jī)制對于理解慢性疼痛是如何發(fā)展的是不可或缺的。GABA 能信號的失調(diào)通過對氯、鉀和重碳酸氫鹽穩(wěn)態(tài)的差異調(diào)節(jié)在慢性疼痛狀態(tài)的發(fā)展中被廣泛認(rèn)識。脊髓中氯化鉀共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 (KCC2)的嚴(yán)重丟失導(dǎo)致慢性疼痛和后角神經(jīng)元興奮的發(fā)生。氯化鉀共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 的抑制或下調(diào)（如在病理性疼痛和缺氧時(shí)KCC2 活性降低）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氯化物的積累。隨后GABA 受體A(GABAA)的激活導(dǎo)致氯化物外排，導(dǎo)致后角神經(jīng)元興奮。GABAA功能的紊亂，涉及KCC2 的表達(dá)和活性，在脊髓水平參與了糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展。然而，最近的證據(jù)表明氯化物和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)影響了脊髓神經(jīng)元的激活和慢性疼痛狀態(tài)。GABA受體A 不僅誘導(dǎo)氯化物外排，而且碳酸氫鹽也被轉(zhuǎn)運(yùn)出神經(jīng)元。因此，通過給予ACZ 抑制碳酸酐酶活性的碳酸氫鹽合成抑制了脊髓水平上的后角神經(jīng)元活動和傷害性感覺。乙酰唑胺抑制脊髓后角神經(jīng)元功能，與糖尿病神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)的抑制有關(guān)。同樣，研究表明ACZ 治療可以改善缺氧引起的疼痛，這部分是由缺氧引起的CA7 表達(dá)上調(diào)驅(qū)動的。碳酸酐酶7 是一種利用二氧化碳和水合成碳酸氫鹽的細(xì)胞質(zhì)異構(gòu)體。在神經(jīng)元功能方面，已確定在海馬中，GABAA介導(dǎo)的神經(jīng)興奮依賴于由胞漿碳酸酐酶活性維持的細(xì)胞內(nèi)碳酸氫鹽水平，CA7 與引起癲癇發(fā)作的異常海馬神經(jīng)活動有關(guān)。此外，CA7 在脊髓中表達(dá)主要在興奮性神經(jīng)元中，與膜結(jié)合的CA12 一起，然而，CA7 基因敲除小鼠與對照組小鼠相比，在傷害性感受行為方面沒有表現(xiàn)出改變。值得注意的是，這項(xiàng)研究探索了幼小的動物，該研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了CA7 在這種情況下的低水平表達(dá)。在缺氧引起的病理性疼痛狀態(tài)下，如糖尿病，誘導(dǎo)GABA 去抑制是誘導(dǎo)CA7 依賴性感覺神經(jīng)興奮所必需的。

該研究提出了一種新的機(jī)制，激活脊髓中的興奮性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)來啟動慢性疼痛。通過了解感覺神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)在的可塑性與特定疾病狀態(tài)對軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的影響之間的關(guān)系，可以極大地促進(jìn)新型止痛藥療法的發(fā)展。