汪洪冰，郭永祥，張朝陽(yáng)，黃建龍，張 坤，林 源

（湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410014）

布魯氏菌病（brucellosis，以下簡(jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮偌?xì)菌感染導(dǎo)致的人獸共患傳染病，在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康并影響畜牧業(yè)發(fā)展[1]。血清學(xué)診斷是布病初篩和確診的主要臨床診斷方法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）推薦的布病血清學(xué)診斷方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。然而近些年，膠體金免疫層析技術(shù)作為一種新型快速發(fā)展的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，因其成本低廉、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果可靠，無(wú)需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物病毒、細(xì)菌等病原檢測(cè)，并已成為獸醫(yī)臨床診斷動(dòng)物疫病最簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一。盡管早期已有相關(guān)研究將此技術(shù)與其他布魯氏菌檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，但同時(shí)運(yùn)用不同品牌膠體金免疫層析試紙條/卡（簡(jiǎn)稱試紙條/卡）檢測(cè)牛羊布魯氏菌的報(bào)道較少見。本研究為比較不同品牌試紙條/卡檢測(cè)性能，利用抗體布魯氏菌陰陽(yáng)性血清，對(duì)6 種試紙條/卡的準(zhǔn)確性及敏感性進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)經(jīng)RBPT 初篩和競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）復(fù)核的臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)，以期為利用試紙條/卡進(jìn)行布魯氏菌快速檢測(cè)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

布魯氏菌企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽(yáng)性血清（以下簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清），批號(hào)50042308，有效期至2023 年12 月14 日，購(gòu)自青島立見生物科技有限公司；臨床血清樣品，來(lái)自某實(shí)驗(yàn)室，其中羊血清34 份（陰陽(yáng)各17 份）、牛血清44 份（陰陽(yáng)各22 份）。所有血清樣品均已按GB/T 18646—2018 標(biāo)準(zhǔn)完成了RBPT 初篩和cELISA 復(fù)核，無(wú)明顯溶血等情況。

1.2 試劑

在有效期內(nèi)的6 個(gè)品牌（A—F）試紙條/卡，購(gòu)自湖南省政府采購(gòu)電子賣場(chǎng)某供應(yīng)商。

1.3 方法

1.3.1 準(zhǔn)確性比較 直接選取標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清，按試紙條/卡使用說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，每種試紙條/卡重復(fù)檢測(cè)3 次，以了解不同品牌試紙條/卡對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.3.2 檢出限試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清按比例依次稀釋到1:256，選擇不同稀釋倍數(shù)陽(yáng)性血清，按試紙條/卡使用說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，以了解試紙條/卡對(duì)陽(yáng)性血清檢測(cè)的靈敏度。

1.3.3 臨床樣品檢測(cè) 選取經(jīng)RBPT 初篩和cELISA 復(fù)核的臨床血清樣品，分羊、牛不同畜種，按試紙條/卡使用說(shuō)明書對(duì)臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，以了解不同品牌試紙條/卡對(duì)臨床樣品的檢測(cè)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)確性

經(jīng)3 次重復(fù)檢測(cè)，各試紙條/卡對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清的檢出率均為100%，表明各品牌試紙條/卡的檢測(cè)準(zhǔn)確率高，穩(wěn)定性好。

2.2 靈敏度

如表1 所示：各試紙條/卡對(duì)不同倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果不同，C、D 試紙條/卡敏感性最高，對(duì)1:2～1:256 不同倍比稀釋的陽(yáng)性血清檢出率均為100%；B 試紙條/卡敏感性一般，對(duì)1:2～1:16 不同倍比稀釋的陽(yáng)性血清檢出率為100%；A、F 試紙條/卡敏感性較差，僅能檢出1:2～1:4 低倍比稀釋的陽(yáng)性血清；E 試紙條/卡敏感性和穩(wěn)定性相比最差。

表1 不同品牌試紙條/卡對(duì)不同倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

2.3 臨床血清樣品檢測(cè)

如表2、3 所示：各試紙條/卡對(duì)臨床陰性血清樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確率均為100%。對(duì)臨床羊陽(yáng)性血清樣品的檢測(cè)結(jié)果差異較大，其中B 試紙條/卡陽(yáng)性檢出率最高（70.59%），其次為F 試紙條/卡陽(yáng)性檢出率（64.71%），A 試紙條/卡陽(yáng)性檢出率最低（5.88%）；對(duì)臨床牛陽(yáng)性血清樣品的檢測(cè)結(jié)果整體優(yōu)于羊陽(yáng)性血清樣品，但不同試紙條/卡的檢測(cè)結(jié)果仍然存在差異，E、F 試紙條/卡陽(yáng)性檢出率最高（100%），其次為A、D 試紙條/卡（68.18%），B、C 試紙條/卡最低（50.00%）。

表2 不同品牌試紙條/卡對(duì)臨床羊血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

表3 不同品牌試紙條/卡對(duì)臨床牛血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

膠體金免疫層析法是將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和蛋白層析技術(shù)相結(jié)合的以硝酸纖維膜為載體的固相膜免疫分析技術(shù)[5]，具有簡(jiǎn)便、省時(shí)、樣本用量少、結(jié)果易判讀等特點(diǎn)，常在資源匱乏或非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行目標(biāo)物的定性、半定量和定量檢測(cè)。應(yīng)用范圍包括生物醫(yī)學(xué)中的病原體、藥物、激素和代謝物檢測(cè)，植物檢疫，獸醫(yī)、飼料/食品和環(huán)境指標(biāo)的測(cè)試。2019 年，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布《布魯氏菌病診斷》（WS269—2019），新增了膠體金免疫層析法診斷布病的參考標(biāo)準(zhǔn)，并將其作為布病初篩試驗(yàn)之一。在動(dòng)物疾病的臨床檢測(cè)及防控上，膠體金免疫層析技術(shù)近年來(lái)也有大量的創(chuàng)新和應(yīng)用，新材料、新儀器和新技術(shù)的發(fā)展給膠體金免疫層析技術(shù)帶來(lái)更多可能[6]。全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)對(duì)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18648—2018）進(jìn)行修訂立項(xiàng)，在新修訂的征求意見稿[7]中將免疫層析抗體檢測(cè)方法列入布病的免疫學(xué)診斷方法。這預(yù)示著膠體金免疫層析技術(shù)在布病診斷上將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

在早期報(bào)道中，有研究者對(duì)膠體金免疫層析法與其他布病診斷方法進(jìn)行了比較[8-13]，也有用膠體金免疫層析法橫向比較牛/羊血清樣品檢測(cè)效果的研究[14-16]，結(jié)果均顯示膠體金免疫層析法具有較高的特異性和敏感性，適應(yīng)于布病初篩。本研究發(fā)現(xiàn)不同品牌試紙條/卡對(duì)企業(yè)提供的標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌陰陽(yáng)性血清均敏感，但檢出限并不一致，這說(shuō)明即使是同一種檢測(cè)方法，不同試紙條/卡的檢測(cè)結(jié)果也存在差異。同時(shí)，應(yīng)用同一品牌試紙條/卡分別檢測(cè)牛羊陽(yáng)性血清時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果也不相同。B 試紙條/卡對(duì)臨床羊陽(yáng)性血清樣品的檢出率達(dá)70.59%，對(duì)臨床牛陽(yáng)性血清樣品的檢出率僅為50%；A 試紙條/卡對(duì)臨床羊陽(yáng)性血清樣品檢出率僅為5.88%，但對(duì)臨床牛陽(yáng)性血清樣品的檢出率卻達(dá)68.18%；E、F 試紙條/卡對(duì)臨床羊陽(yáng)性血清樣品的平均檢出率為61.76%，但對(duì)臨床牛陽(yáng)性血清樣品卻100%檢出。這與劉麗婭等[16]在對(duì)布病不同初篩方法及診斷試劑檢測(cè)差異性分析時(shí)所發(fā)現(xiàn)的“應(yīng)用同一方法，采用不同試劑結(jié)果存有差異；應(yīng)用同廠家試劑，檢測(cè)牛、羊血清，敏感及特異性結(jié)果也有不同”，具有相似性。準(zhǔn)確檢疫和快速診斷是預(yù)防和控制布病的關(guān)鍵。在開展布病凈化時(shí)，建議先通過(guò)動(dòng)物布病國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)與試紙條/卡進(jìn)行效果比對(duì)，根據(jù)對(duì)比結(jié)果選擇敏感性較好、準(zhǔn)確性較高的商品化試紙條/卡用于快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)診斷。但初篩完成后，仍需用敏感性、特異性均好的其他檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)檢，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

膠體金免疫層析法是根據(jù)待測(cè)物與相應(yīng)抗體劑量-反應(yīng)曲線進(jìn)行定性和定量檢測(cè)的，因此為了得到準(zhǔn)確結(jié)果，必須有相對(duì)于待測(cè)物的過(guò)量抗體，包括捕獲抗體和金標(biāo)抗體（免疫膠體金）[17-19]。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道布魯氏菌抗原間交叉反應(yīng)，類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體等內(nèi)源性干擾物質(zhì)，標(biāo)本凝固不全便開始離心，血清中殘留的纖維蛋白原粘附硝酸纖維素膜（NC 膜）等外源性因素，以及試紙條/卡本身質(zhì)量問(wèn)題、溶血、乳糜血等原因，均可對(duì)膠體金檢測(cè)結(jié)果造成干擾。因此選擇高質(zhì)量試紙條/卡的同時(shí)，規(guī)范的樣品采集、預(yù)處理方法，合適的分析物濃度等對(duì)提高檢測(cè)靈敏度至關(guān)重要[20]。本研究發(fā)現(xiàn)不同品牌試紙條/卡對(duì)臨床陽(yáng)性血清樣品的檢測(cè)結(jié)果差異性較大，這可能與各品牌試紙條/卡在生產(chǎn)過(guò)程中膠體金顆粒大小的均勻度、濃度，抗原抗體比例，以及NC 膜、金標(biāo)墊等材料質(zhì)量密切相關(guān)[21]。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)不同品牌試紙條/卡對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、臨床陽(yáng)性血清樣品的檢測(cè)結(jié)果差異較大，這可能與標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清制備以及檢驗(yàn)的程序化、制度化密切相關(guān)，相比臨床陰陽(yáng)性血清，標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清的均勻性、穩(wěn)定性優(yōu)勢(shì)更加明顯。建議各相關(guān)生產(chǎn)廠家應(yīng)建立統(tǒng)一的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)程序和判讀標(biāo)準(zhǔn)，從膠體金、抗體等原料的質(zhì)量，膜材的處理，到試紙的組裝、儲(chǔ)存等加強(qiáng)品控管理，確保生產(chǎn)出特異、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的試紙條/卡，以利于生產(chǎn)實(shí)際中布病的初步檢測(cè)和大批量篩查[16]。

檢測(cè)結(jié)果除與試紙條/卡產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊有關(guān)外，還可能與采樣動(dòng)物的健康狀況、近期飼料添加劑及藥品使用情況，染疫動(dòng)物體內(nèi)抗體消長(zhǎng)變化情況，以及臨床樣品的前期處理和檢測(cè)時(shí)的環(huán)境溫度、試劑溫度、樣品溫度、判讀時(shí)間和加樣量等具有一定相關(guān)性[19]。在獸醫(yī)臨床快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)診斷中，建議詳實(shí)了解采樣動(dòng)物飼養(yǎng)背景、健康狀況，采用規(guī)范的采樣方法和血液樣品預(yù)處理方法，嚴(yán)格對(duì)照試紙條/卡產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)操作，以便充分發(fā)揮膠體金免疫層析檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。