高志強(qiáng)，汪 琳，劉 環(huán)，白子龍，趙相鵬，蒲 靜，張 偉

（中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬，是唯一能感染禽鳥的正黏病毒。A 型流感病毒可感染多種禽鳥，而水禽是其主要貯存宿主。目前已發(fā)現(xiàn)AIV 有18種血凝素（haemagglutinin，HA）亞型和9 種神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）亞型。迄今為止，自然發(fā)生的高致病性禽流感疫情均由H5 或H7 亞型AIV 引起。而禽類中廣泛存在的低致病性H5 或H7 亞型AIV 可因基因突變而轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧虏⌒远局?，而且很可能發(fā)生外溢，跨種感染人類和哺乳動物，一直備受關(guān)注[1]。

在對AIV 進(jìn)行檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查時，檢測的時效性和準(zhǔn)確性缺一不可，特別是在疫情暴發(fā)時進(jìn)行分子溯源和快速全基因組測序，對于疫情控制起著至關(guān)重要的作用。常規(guī)的禽流感分子流行病學(xué)調(diào)查需要進(jìn)行病毒分離鑒定，通過RT-PCR擴(kuò)增各基因片段并進(jìn)行Sanger 測序，或者通過以Illumina 平臺為主的二代建庫測序[2-3]。基于病毒分離后進(jìn)行的全基因組測序，對生物安全條件要求較高，往往需要生物安全三級以上條件；同時一、二代測序技術(shù)讀長短，測序時間長，文庫制備和數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，因此測序時間較長，常常需要2～3 周甚至更長時間。近年來，納米孔測序技術(shù)憑借其操作簡便、長讀長，以及快速和實(shí)時讀取測序數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，在病原測序領(lǐng)域廣受青睞[4-5]。針對樣品中的病原體，采用“疊瓦式”靶向富集技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)低豐度病毒的快速全基因組測序[6]；進(jìn)一步采用滅活型采樣技術(shù)，可以降低AIV 分子溯源的生物安全風(fēng)險，極大提高AIV 分子溯源的便利性。

本研究選取實(shí)驗(yàn)室保存的AIV 核酸陽性滅活拭子樣品，提取病毒基因組，應(yīng)用靶向引物池對病毒全基因組進(jìn)行富集后，使用納米孔測序技術(shù)進(jìn)行快速測序，在6 h 內(nèi)獲得了樣品中病毒的全基因組序列，經(jīng)序列分析比對，表明其為H5N5 亞型AIV，序列覆蓋度為96.44%，是一種基因重配病毒。本研究首次采用靶向納米孔測序技術(shù)直接進(jìn)行拭子樣品中AIV 的全基因組測序，為口岸動物及產(chǎn)品的精準(zhǔn)檢測提供了新的可靠方法。

1 材料和方法

1.1 被檢樣品

滅活A(yù)IV 核酸陽性鴨泄殖腔拭子樣品，來自某鴨場送檢，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒（DP3165），購自天根生化科技有限公司；A 型流感病毒全基因組靶向捕獲試劑盒（BK-WIFA024），連接法測序多樣本DNA 建庫輔助試劑盒（BK-AUX024），購自杭州柏熠科技有限公司；連接測序試劑盒（SQK-LSK110）、無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒（EXP-NBD104），芯片清洗試劑盒（EXP-WSH004），Spot-ON Flow Cell 測序芯片（FLO-MIN106D），均購自NANOPORE 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑，購自Promega 公司；HSTaqDNA聚合酶、dNTP 等，購自TaKaRa 公司；引物及雙標(biāo)記探針，均委托生工生物工程（上海）股份有限公合成。

1.3 主要設(shè)備

Qubit Flex 熒光計(jì)、QuantStudio 5 熒光定量PCR 儀，為Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；GridIONx5納米孔測序儀，為NANOPORE 公司產(chǎn)品。

1.4 核酸提取

測序當(dāng)天，充分振蕩拭子樣品，然后吸取200 μL 使用商品化病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒提取核酸，洗脫于60 μL 無核酸酶水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光RT-PCR 檢測

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27539—2011[7]合成引物探針，配制反應(yīng)體系，進(jìn)行A 型流感病毒通用熒光RT-PCR 檢測，確定Ct 值范圍。

1.6 A 型流感病毒全基因組靶向捕獲

使用Qubit Flex 熒光計(jì)測定核酸濃度后，應(yīng)用A 型流感病毒全基因組靶向捕獲試劑盒，按照操作說明進(jìn)行全基因組序列的靶向捕獲。

1.7 AIV Nanopore 文庫構(gòu)建

首先將約300 ng 捕獲產(chǎn)物使用連接法測序多樣本DNA 建庫輔助試劑盒，按照說明進(jìn)行末端修復(fù)，修復(fù)后使用試劑盒中的配套磁珠純化試劑純化產(chǎn)物，應(yīng)用無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒中的NB01 和NB02 條形碼，按照說明分別對純化產(chǎn)物進(jìn)行條形碼連接；連接結(jié)束后，使用試劑盒中配套磁珠純化試劑純化產(chǎn)物，將NB01 和NB02 兩管產(chǎn)物混合后連接Adapter，反應(yīng)結(jié)束后再次使用試劑盒中配套磁珠純化試劑純化產(chǎn)物，即為構(gòu)建的文庫。

1.8 測序及芯片清洗

按照操作說明將試劑盒中Flush Tether 和Flush Buffer 混合均勻，制備成測序芯片緩沖液，將測序芯片排氣后，將緩沖液從Priming port 勻速推入管路；將構(gòu)建的文庫與試劑盒中適當(dāng)體積的測序Buffer 及Loading Beads 混勻后，勻速滴入芯片SpotON sample port 孔中；關(guān)閉各個閥門，將芯片裝載到GridIONx5測序儀上進(jìn)行測序。測序結(jié)束后，使用芯片清洗試劑盒，按照說明對測序后的芯片進(jìn)行清洗，清洗后加入Buffer 置于4 ℃正向密封保存。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

測序過程中可實(shí)時進(jìn)行堿基識別（basecalling），運(yùn)行1 h 后，將輸出文件夾中的barcode01 和barcode02 文件夾中的*. fastq 文件整合到一個文件夾中，導(dǎo)入BAIYITECH 流感病毒全基因組分析模塊進(jìn)行序列拼接和初步分析，初步確定測序覆蓋率和毒株亞型。

1.10 進(jìn)化分析

在GISAID 網(wǎng)站通過BLAST 分析拼接到的序列，確定各片段最大核苷酸相似性最大的毒株，并下載相應(yīng)參考毒株HA和NA基因片段核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。用MAFFT 7.52 軟件進(jìn)行序列比對，采用 Geneious 9.0 軟件的UPGMA 方法構(gòu)建病毒序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 熒光RT-PCR 檢測與核酸質(zhì)量濃度定量

該陽性樣品經(jīng)熒光RT-PCR 檢測，結(jié)果Ct 值為21.97（圖1），陽性對照為AIVM基因體外轉(zhuǎn)錄RNA。經(jīng)Qubit Flex 熒光計(jì)定量，核酸質(zhì)量濃度為4.54 ng/μL，吸取10 μL 提取的RNA 進(jìn)行靶向捕獲和后續(xù)的文庫構(gòu)建和序列測定。

圖1 陽性樣品熒光RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 樣品中AIV 測序

將序列數(shù)據(jù)導(dǎo)入BAIYITECH 流感病毒全基因組分析模塊進(jìn)行序列組裝和初步分析。序列鑒定結(jié)果顯示，樣本中的病毒為H5N5 亞型AIV，序列覆蓋度為96.44%。鑒定?；鶊D見圖2，產(chǎn)生數(shù)據(jù)堿基數(shù)與讀長分布見圖3，測序覆蓋度匯總見表1。

表1 測序覆蓋度匯總

圖2 序列鑒定?；鶊D

圖3 堿基數(shù)與讀長分布

2.3 樣品中毒株分子特征分析

本研究采用納米孔測序獲得樣品中AIV 的8個基因片段序列基本信息見表2（包括各基因長度、編碼氨基酸序列長度及相似性最高毒株），其中PB1基因中有約480 bp 的序列未被測出，未能對其氨基酸序列長度進(jìn)行推導(dǎo)；各基因片段序列Blast 分析均顯示，樣品中的病毒為鴨源H5N5 亞型AIV，與樣品已知信息相符。HA 氨基酸裂解位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，序列為PLREKRRKR/GLF，具有5 個連續(xù)的堿性氨基酸，為高致病性AIV 分子特征[1]，未發(fā)現(xiàn)向SAα2-6Gal 轉(zhuǎn)變的氨基酸突變[8]。

表2 各個基因片段序列基本信息

2.4 進(jìn)化分析

根據(jù)GISAID 網(wǎng)站Blast 比對結(jié)果以及該網(wǎng)站公布的H5 亞型病毒相關(guān)不同譜系毒株序列，經(jīng)MAFFT 比對后，采用Geneious 內(nèi)置UPGMA方法，分別針對HA和NA基因繪制進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，該病毒HA和NA基因分別與A/duck/Eastern China/031/2009（H5N5）和A/duck/Eastern China/008/2008（H5N5）親緣關(guān)系最近，位于同一分支。HA譜系劃分為2.3.4，NA為歐亞譜系。HA和NA基因進(jìn)化分析結(jié)果分別見圖4 和圖5。

圖4 樣品中病毒（A/duck/BJHK/22）HA 基因進(jìn)化分析結(jié)果

圖5 樣品中病毒（A/duck/BJHK/22）NA 基因進(jìn)化分析結(jié)果

3 討論

隨著候鳥遷徙和人類活動，高致病性禽流感在全球范圍內(nèi)時有發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)和人類健康帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)。高致病性禽流感不僅可對養(yǎng)禽業(yè)造成致命打擊，而且一些毒株經(jīng)過不斷變異累積，遺傳特征可發(fā)生演變，進(jìn)而突破種間屏障傳播給人和其他哺乳動物，甚至發(fā)生人際傳播。因此聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）以及世界衛(wèi)生組織（WHO）均將禽流感監(jiān)測作為三方聯(lián)盟的優(yōu)先事項(xiàng)之一，呼吁世界各國加強(qiáng)監(jiān)測[9]。

由于高致病性AIV 生物安全等級較高，常規(guī)的血清學(xué)以及基于核酸擴(kuò)增的方法盡管可以對禽流感作出確診，但由于AIV 的高變異特性，難以對其進(jìn)行精確亞型鑒別以及致病性分子特征分析。盡管目前涌現(xiàn)了很多針對HA 或NA 亞型鑒別的熒光RT-PCR 方法，但由于AIV 同一亞型不同株型序列差異大，因此這些方法僅適用于一定時間和地域范圍內(nèi)的流行株檢測[10-12]。此外，對于檢測到的病毒陽性樣品，及時開展分子溯源意義重大，不僅可以推測病毒來源，還可以對HA 氨基酸裂解位點(diǎn)序列以及HA 蛋白的受體結(jié)合特性進(jìn)行評估，這對于疫情擴(kuò)散風(fēng)險研判與防控策略制定都具有重要指導(dǎo)意義。對病毒基因進(jìn)行測序無疑是最直接有效的分子溯源方法，而常規(guī)非靶向測序方法往往需要較高的病毒濃度，需要進(jìn)行病毒分離后再測序，生物安全風(fēng)險較大。而基于靶向富集的納米孔測序技術(shù)，不僅簡單、快速，而且無需病毒培養(yǎng)，可顯著降低生物安全防護(hù)水平。當(dāng)然，盡管納米孔測序技術(shù)有許多優(yōu)勢，但仍然存在設(shè)備價格高，測序完成需要配套數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列拼裝，生物信息學(xué)分析能力要求高門檻等問題，因而限制了本技術(shù)的推廣應(yīng)用。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的1 份AIV 滅活拭子樣品作為研究對象，結(jié)合靶向富集技術(shù)，對樣品中的病毒全基因組核酸序列進(jìn)行了測定和序列分析，發(fā)現(xiàn)10×序列覆蓋度達(dá)到96.44%，僅PB1基因約480 bp 序列未被有效測出，推測可能是該區(qū)域靶向引物擴(kuò)增效率不高所致，提示富集方法需進(jìn)一步優(yōu)化。測到的序列覆蓋所有關(guān)鍵序列和位點(diǎn)信息，因此可有效對該病毒進(jìn)行分子溯源。溯源信息顯示，該毒株是源自我國南方的鴨源病毒，其HA基因?yàn)?.3.4 譜系。H5N1 亞型的2.3.4 譜系早在2005 年就在國內(nèi)傳播，而N5 為歐亞譜系，因此本次測定到的H5N5 亞型毒株譜系可溯源至2009 年我國東部檢測到的基因重排毒株。氨基酸裂解位點(diǎn)分析顯示，樣品中的病毒具有高致病性AIV 分子特征，但仍保持SAα2-3 Gal 受體結(jié)合位點(diǎn)特征，未發(fā)現(xiàn)向SAα2-6 Gal 轉(zhuǎn)變的氨基酸突變，提示該樣品中的病毒不具備向人傳播的能力[8]。另一方面，基于納米孔測序的靶向富集技術(shù)一般采用 “疊瓦式” PCR方法進(jìn)行靶核酸富集，由于富集體系中至少含有幾十條引物，不同引物擴(kuò)增效率存在差異，因此根據(jù)樣品中病毒核酸質(zhì)量濃度的不同，采用不同的循環(huán)擴(kuò)增次數(shù)，對于含量相對較高的模板（Ct ＜30），往往采取低于30 次的循環(huán)次數(shù)，以避免部分?jǐn)U增產(chǎn)物占比過高，影響測序結(jié)果的覆蓋度。本研究測序樣品中的病毒核酸質(zhì)量濃度較高，Ct ＜30，因此富集循環(huán)次數(shù)設(shè)定在25，取得了較為滿意的測序覆蓋度。

4 結(jié)論

本研究對滅活拭子樣品中的病毒核酸進(jìn)行靶向富集后，采用納米孔技術(shù)進(jìn)行了全基因組序列測定，確定樣品中病毒為H5N5 亞型高致病性AIV，其HA基因?yàn)?.3.4 譜系，NA基因?yàn)闅W亞譜系，表明靶向納米孔測序技術(shù)可直接用于拭子樣品中流感病毒的全基因組測序，其快速、便捷，適用于動物流感病毒的快速分子鑒定與溯源。