楊友洋, 張丹鳳, 王永海, 馬志桃, 葉應(yīng)旺

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

黃曲霉菌(Aspergillusflavus)是一種土壤腐殖真菌,玉米、花生等谷類收獲前后都會(huì)腐爛作物的種子[1]。黃曲霉最適生長溫度范圍為25～42 ℃,其中最適毒素產(chǎn)生溫度為28 ℃[2]。這些真菌會(huì)導(dǎo)致食物變質(zhì),甚至還會(huì)產(chǎn)生有劇毒的毒素,其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)因其對(duì)肝的毒性和極強(qiáng)的致癌性而備受關(guān)注。動(dòng)物食用含有黃曲霉毒素的谷物,嚴(yán)重情況可導(dǎo)致死亡,人類長時(shí)間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認(rèn)為是導(dǎo)致胃癌、肝癌、腸癌等疾病的主要原因[3]。黃曲霉毒素對(duì)人類和牲畜造成嚴(yán)重的健康問題,因此超過100多個(gè)國家在食品與飼料中嚴(yán)格限制毒素水平,其中用于人類和奶牛的玉米受到最嚴(yán)格限制,為20/1 000 000 000[4]。近年來,盡管引進(jìn)了新的抗真菌藥物和防腐劑,但是由于耐藥性和環(huán)境污染逐漸增加,尋找安全可靠的抗真菌藥物引起全世界研究者的興趣。

姜黃素(C21H20O6)是從姜黃根莖中提取的小分子量疏水多酚類化合物,也是姜黃的主要成分,具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[5-6]。姜黃素被世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織歸列為食品添加劑[7],也是我國在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—1981)中最早頒布的,是在食品中被允許使用的9種天然色素之一[8]。姜黃素作為天然光敏劑,對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、擬莖點(diǎn)霉、灰霉等致病菌均有抑制效果[9]。由于姜黃素良好的抑菌效果,在食品安全領(lǐng)域得到人們的關(guān)注和重視。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料和試劑

黃曲霉菌株(JXZS-117-1)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油作物研究所惠贈(zèng);姜黃素(純度≥98%)購自Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子萌發(fā)率和芽管長度

參考文獻(xiàn)[10]的方法,在90 mm的培養(yǎng)皿中加入10 mL的PDA,取100 μL收集的孢子液并用玻璃涂布棒在平板表面涂抹均勻。放置在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察萌發(fā)情況。記錄和計(jì)算平板上孢子的芽管長度和萌發(fā)率,萌發(fā)率計(jì)算公式如下:

其中:S1為總的孢子個(gè)數(shù);S2為萌發(fā)的孢子個(gè)數(shù)。

1.2.2 抑菌劑對(duì)致病菌生長抑制效果

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法,將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d正常生長的黃曲霉使用5 mm打孔器,取菌餅于含0.3 mmol/L的姜黃素PDA的培養(yǎng)皿正中央,在空白對(duì)照組中只加入PDA。將樣品放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。觀察并測量黃曲霉菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次,進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 毒素檢測

根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法并稍作改動(dòng)。在10 mL的試管中加入5 mL的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(potato dextrose broth,PDB),添加姜黃素使最終濃度為0.3 mmol/L,加入100 μL已過濾的5×105個(gè)/mL的黃曲霉孢子液,然后放置在轉(zhuǎn)速為180 r/min、溫度為28 ℃的恒溫?fù)u床中。在搖床中培養(yǎng)7 d后收集菌絲和培養(yǎng)液。將收集的菌絲在50 ℃的烘箱中烘干水分并不時(shí)地記錄菌絲質(zhì)量,待質(zhì)量不再變化記錄最終菌絲干重。

將去除菌絲的培養(yǎng)液加入到50 mL的離心管中并加入1 g NaCl,用pH=7的磷酸緩沖液稀釋至25 mL,將溶液震蕩混勻并超聲30 min,過濾備用。準(zhǔn)確量取5 mL濾液加入到免疫親和柱中,然后將免疫親和柱接到5 mL的注射器下,調(diào)整注射器流速使溶液以2 mL/min的流速緩慢流過免疫親和柱,再以2 mL/min的流速用0.1%吐溫/PBS清洗,用10 mL的蒸餾水清洗2次。棄去全部流出的液體,并將3 mL的空氣注入免疫親和柱,再用2 mL的色譜級(jí)甲醇洗脫毒素,收集洗脫液。洗脫液用0.22 μm的有機(jī)相過濾器過濾收集。準(zhǔn)確吸取300 μL的樣品加入樣品收集瓶中待測。液相條件為:流動(dòng)相為甲醇和水(體積比為70∶30),流速1 mL/min,柱溫40 ℃。熒光檢測激發(fā)波長360 nm,發(fā)射波長440 nm。

計(jì)算單位質(zhì)量菌絲產(chǎn)生的毒素,計(jì)算公式為:

其中:T為單位菌絲產(chǎn)生的毒素量;c為毒素的檢測濃度;m為菌絲的干質(zhì)量。

1.2.4 洋蔥穿透實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[13]的方法,準(zhǔn)備一個(gè)新鮮、無損傷的洋蔥,用刀片在內(nèi)表皮上切出一個(gè)邊長1 cm的正方形,用無菌的鑷子剝?nèi)パ笫[的表皮,將撕下的洋蔥內(nèi)表皮裝入含有50 mL無菌水的培養(yǎng)瓶中。密封之后將培養(yǎng)瓶放置在68 ℃的水浴鍋中加熱1 h以殺死洋蔥細(xì)胞。加熱結(jié)束后使用無菌蒸餾水將內(nèi)表皮清洗2遍,清除表皮上的多余組織。配制5×105個(gè)/mL的黃曲霉孢子液,并在孢子液中加入姜黃素使其濃度為0.3 mmol/L,設(shè)置不含有姜黃素的空白對(duì)照。然后用移液槍取100 μL的孢子液加入到洋蔥表皮,將孢子液在表皮涂抹均勻。將處理后的洋蔥表皮放置在培養(yǎng)皿中保濕、避光、室溫下孵育12 h后,加入0.25%的臺(tái)盼藍(lán)染液染色4 min,然后用移液槍小心地除去染液,再吸取無菌蒸餾水吹洗掉剩余的染液。最后制片在普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 侵染花生實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[14]的方法,并且稍作改進(jìn)。準(zhǔn)備孢子懸浮液并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),制成5×105個(gè)/mL的孢子液100 mL。將花生粒稱重記錄,用1%的次氯酸鈉浸泡1 min,取出后用無菌水沖洗2次,放置在超凈臺(tái)吹干。將花生放入孢子液中浸泡30 s,取出后放置在含少量無菌水濾紙的培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。對(duì)照組是用未處理的黃曲霉孢子液浸泡,設(shè)置空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次,進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 花生感官評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)姜黃素的加入對(duì)花生的感官是否會(huì)產(chǎn)生影響,參考文獻(xiàn)[15]的方法,對(duì)加入姜黃素的花生進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。具體操作為:將花生加入到0.3 mmol/L的姜黃素中進(jìn)行浸泡,使用清水浸泡的花生做空白對(duì)照,浸泡結(jié)束后將花生放置在通風(fēng)處晾干,2 d后將部分姜黃素處理的花生進(jìn)行清水清洗。實(shí)驗(yàn)邀請(qǐng)13位人員對(duì)花生進(jìn)行感官評(píng)價(jià),通過對(duì)樣品仔細(xì)觀察、嗅聞和品嘗,對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分,具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1所列。

表1 花生感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.7 抑菌劑對(duì)病原菌形態(tài)學(xué)的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法并稍作修改,從7 d正常生長的黃曲霉菌板中截取菌餅,加入到含無菌水的培養(yǎng)瓶中,振蕩充分,用兩層擦鏡紙進(jìn)行過濾,取10 μL菌液放置在血球計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù),獲得5×105個(gè)/mL的孢子液;然后在添加0.3 mmol/L姜黃素的PDA培養(yǎng)皿中,吸取100 μL的孢子液加到培養(yǎng)皿中,用玻璃涂布棒將孢子液涂抹均勻,放置在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d;再將處理后的黃曲霉菌重新提取孢子,加入含姜黃素的平板中,進(jìn)行連續(xù)3代的培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)和色素產(chǎn)生情況。每個(gè)處理重復(fù)3次,進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 黃曲霉菌對(duì)姜黃素的耐受性分析

為了探究黃曲霉菌對(duì)姜黃素的長期處理會(huì)不會(huì)產(chǎn)生耐受性,在含有0.3 mmol/L姜黃素的PDA 平板上培養(yǎng)黃曲霉菌,待產(chǎn)孢后觀察菌落形態(tài)并收集孢子,用無菌水過濾黃曲霉孢子,制成5×105個(gè)/mL的黃曲霉孢子懸浮液;取100 μL孢子懸浮液加入到含姜黃素和不含姜黃素的PDA板中,然后用玻璃涂布棒涂抹均勻。將接種好的平板放置在28 ℃的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)7 d。第7天收集平板上的孢子過濾,得到第1代姜黃素處理的孢子液;繼續(xù)將得到的孢子液在姜黃素處理的平板中連續(xù)培養(yǎng)3代,獲得第3代姜黃素處理后的黃曲霉孢子。然后使用第3代孢子進(jìn)行花生侵染實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)3次,進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)使用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算,并用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析(ANOVA),計(jì)算平均值之間是否存在顯著性差異用Duncan多重檢驗(yàn)法,P<0.05認(rèn)為差異顯著,不同字母表示不同處理之間具有顯著性差異。文中柱狀圖使用Origin 8.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子萌發(fā)率和芽管長度分析

真菌侵染花生、玉米等主要通過如下途經(jīng)孢子附著在其表面、在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下萌發(fā)、菌絲不斷擴(kuò)張,從而導(dǎo)致食物污染。抑制孢子萌發(fā)率和芽管長度是抑制真菌污染的重要指標(biāo)。

姜黃素連續(xù)處理對(duì)黃曲霉的孢子萌發(fā)率和芽管長度抑制情況如圖1所示。

圖1 姜黃素對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)率和芽管長度的抑制作用

由圖1可知:與污染陽性對(duì)照組相比,姜黃素處理組的黃曲霉孢子萌發(fā)率和芽管長度降低;污染陽性對(duì)照組的黃曲霉孢子萌發(fā)率為92.7%,姜黃素處理組的黃曲霉孢子萌發(fā)率為81.3%,降低了11.4%;黃曲霉孢子芽管長度實(shí)驗(yàn)中污染陽性對(duì)照組長度為45.8 μm,姜黃素處理組為32.6 μm,芽管長度降低了28.8%。結(jié)果表明,姜黃素連續(xù)處理可以在一定程度上抑制黃曲霉孢子萌發(fā)率和芽管長度(P<0.05)。

2.2 抑菌劑對(duì)病原菌抑制效果

為了探究姜黃素對(duì)黃曲霉是否抑制,首先在體外實(shí)驗(yàn)中,通過平板實(shí)驗(yàn),在培養(yǎng)基中加入姜黃素觀察其對(duì)黃曲霉菌落的生長情況。

姜黃素對(duì)黃曲霉的抑制情況如圖2所示。從圖2可以看出:姜黃素處理后明顯地抑制了黃曲霉菌落的生長;相對(duì)于污染陽性對(duì)照組,黃曲霉正常生長直徑平均為14 cm,而姜黃素處理組的黃曲霉生長直徑為11 cm,抑制生長率為21.4%?？梢钥闯?加入姜黃素對(duì)黃曲霉的生長具有抑制作用(P<0.05)。

圖2 姜黃素對(duì)黃曲霉生長抑制情況

2.3 姜黃素對(duì)AFB1產(chǎn)生量的抑制作用

農(nóng)產(chǎn)品遭受黃曲霉的污染主要是由于其能夠產(chǎn)生致命性黃曲霉毒素B1,通過檢測黃曲霉毒素B1含量,能夠進(jìn)一步評(píng)估姜黃素對(duì)黃曲霉的抑制作用。樣品經(jīng)過濾處理后,通過免疫親和柱的富集,再經(jīng)過三氟乙酸進(jìn)行柱前衍生,樣品置于高效液相色譜(high performance liquid chromatogrphy,HPLC)熒光檢測器檢測。黃曲霉毒素B1產(chǎn)量如圖3所示。

圖3 姜黃素對(duì)AFB1產(chǎn)生量的抑制作用

由圖3可知:姜黃素處理組的黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生量為23.8 ng/g,污染陽性對(duì)照組的產(chǎn)生量為47.5 ng/g;相比之下,姜黃素處理組毒素降低了46.9%。分析結(jié)果可知,姜黃素能夠顯著降低黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生(P<0.05)。因此,姜黃素作為天然的抑菌劑具有極大的開發(fā)潛力。

2.4 洋蔥穿透實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黃曲霉在發(fā)生侵染時(shí),本文首先通過芽孢萌發(fā)產(chǎn)生菌絲,然后通過菌絲汲取生存所需要的養(yǎng)分。菌絲的活力強(qiáng)弱會(huì)影響黃曲霉侵染的嚴(yán)重程度。通過對(duì)菌絲做洋蔥表皮穿透實(shí)驗(yàn),測試菌絲活力。

臺(tái)盼藍(lán)染色后在顯微鏡下觀察,孢子穿透洋蔥表皮如圖4所示。從圖4可以看出,污染陽性對(duì)照組在萌發(fā)生長后,菌絲穿透洋蔥表皮進(jìn)入洋蔥細(xì)胞內(nèi),這會(huì)導(dǎo)致在洋蔥細(xì)胞外部的菌絲會(huì)被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色,而留在內(nèi)部的菌絲未被染色。姜黃素處理組的黃曲霉菌絲大都被染上了藍(lán)色,黃曲霉的菌絲活性降低,說明姜黃素降低了黃曲霉菌絲的穿透能力。

圖4 姜黃素對(duì)黃曲霉菌絲穿透力的影響

2.5 侵染花生實(shí)驗(yàn)結(jié)果

因?yàn)榛ㄉ资茳S曲霉的侵染,所以在之前平板抑制實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步評(píng)估姜黃素對(duì)黃曲霉的防控效果。黃曲霉侵染花生情況如圖5所示。

圖5 姜黃素對(duì)花生黃曲霉病的抑制作用

從圖5可以看出,培養(yǎng)7 d后,污染陽性對(duì)照組花生全部發(fā)病,而姜黃素處理組的花生僅是輕微感染,發(fā)病情況明顯低于污染陽性對(duì)照組,因此姜黃素具有開發(fā)為新型抑菌劑控制食品和飼料原料中黃曲霉污染的前景。

2.6 花生感官評(píng)價(jià)結(jié)果

花生感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表2所列。由表2可知,濃度為0.3 mmol/L姜黃素的加入并不會(huì)顯著影響花生的口感和氣味(P>0.05),但是對(duì)于花生的色澤產(chǎn)生了顯著性的影響(P<0.05),使用清水清洗后會(huì)顯著減少姜黃素對(duì)花生色澤的影響(P<0.05)。結(jié)果表明,姜黃素的加入并不會(huì)影響花生的氣味和口感,對(duì)姜黃素應(yīng)用具有重要的意義。

表2 花生感官評(píng)價(jià)結(jié)果

2.7 抑菌劑對(duì)病原菌形態(tài)學(xué)的影響

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),姜黃素連續(xù)處理3代對(duì)黃曲霉形態(tài)的影響如圖6所示。由圖6可知,在添加抑菌劑的黃曲霉中,姜黃素處理組連續(xù)處理3代孢子的顏色呈現(xiàn)出乳白色,而污染陽性對(duì)照組培養(yǎng)連續(xù)3代仍然呈現(xiàn)黃綠色。結(jié)果表明,姜黃素會(huì)抑制黃曲霉孢子色素的合成。

圖6 姜黃素連續(xù)處理3代對(duì)黃曲霉形態(tài)的影響

2.8 黃曲霉對(duì)姜黃素的耐受性

為了探究黃曲霉對(duì)姜黃素的耐受性,通過對(duì)黃曲霉3代的不斷培養(yǎng),第3代孢子感染花生情況如圖7所示。

圖7 姜黃素平板連續(xù)培養(yǎng)3代黃曲霉侵染花生發(fā)病情況

從圖7可以看出,在污染陽性對(duì)照組中花生全部發(fā)病,而在姜黃素處理組中,花生僅部分感染。這說明經(jīng)過姜黃素處理3代后的黃曲霉孢子侵染能力明顯下降。結(jié)果表明,經(jīng)過姜黃素處理后產(chǎn)生的黃曲霉孢子的活性同樣受到一定的抑制作用,黃曲霉對(duì)姜黃素并沒有產(chǎn)生耐受性,因此姜黃素具有作為一種長期抑菌劑的潛力。

3 結(jié) 論

本文主要研究了姜黃素對(duì)黃曲霉的抗真菌效果。通過姜黃素對(duì)黃曲霉抑制效果、形態(tài)學(xué)影響、菌絲的活力檢驗(yàn)、毒素產(chǎn)量檢測、侵染花生實(shí)驗(yàn)以及黃曲霉對(duì)姜黃素的耐受性實(shí)驗(yàn),初步證明姜黃素對(duì)黃曲霉具有抑制作用。下一步實(shí)驗(yàn)將對(duì)相關(guān)抑制機(jī)理進(jìn)行研究,以期對(duì)黃曲霉抑制提供新的思路。