隋 明，朱克永,張崇軍,王靜霞，唐賢華,周榮清

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川都江堰 611830；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都 610000)

黃曲霉毒素主要由曲霉屬真菌中黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1等10多種，其中以黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)。黃曲霉菌廣泛存在環(huán)境中的土壤、植物果實(shí)中，主要以發(fā)霉及污染的玉米和花生中黃曲霉毒素含量較高，對(duì)人和動(dòng)物具有致畸、致癌、致突變作用[1-3]。當(dāng)人攝入過(guò)量的黃曲霉毒素時(shí),會(huì)引發(fā)人的急性中毒及致癌，當(dāng)動(dòng)物采食了含有黃曲霉毒素飼料，導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)性能和生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡，食品和飼料中黃曲霉毒素給人和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重的威脅[4-6]。因此，世界各國(guó)對(duì)食品和飼料中黃曲霉毒素的含量進(jìn)行嚴(yán)格的控制。中草藥種類繁多且富含多種活性成分物質(zhì)，具有清熱解毒、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、清除內(nèi)毒素、低殘留、無(wú)毒副作用、使用安全、綠色無(wú)害等多種優(yōu)點(diǎn)[7]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于清熱解毒中藥抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)特性研究較少，因此，本試驗(yàn)選用了10種清熱解毒中藥水提物對(duì)黃曲霉菌體外生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，測(cè)定其對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率、黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率和黃曲霉菌產(chǎn)毒量，為進(jìn)一步研發(fā)去除食品和飼料中黃曲霉菌復(fù)方中藥制劑及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 黃曲霉菌CGMCC3.4408標(biāo)準(zhǔn)菌株由四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 黃連、連翹、穿心蓮、金銀花、大青葉、蒲公英、板藍(lán)根、射干、紫花地丁、白頭翁10種清熱解毒類中藥購(gòu)于成都市同仁醫(yī)藥有限公司；PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、產(chǎn)毒培養(yǎng)基，北京奧星生物技術(shù)公司產(chǎn)品；AFB1檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀由德國(guó)Eppendourf公司生產(chǎn)；PBST、培養(yǎng)皿、EP管、移液槍、分析天平及分析純等常規(guī)試劑及儀器由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 中藥水提物的藥液的制備 用水提法制備中草藥藥液，將中藥在烘干箱烘干，稱量50 g，加入5倍～10倍的蒸餾水浸泡1 h～1.5 h，煮開(kāi)后用文火再煎煮30 min，用12層紗布過(guò)濾，再加入5倍蒸餾水煮沸，用文火再煎煮20 min過(guò)濾藥液。將兩次所煮藥液合并濃縮為每毫升含原藥為1 g。離心后并調(diào)整其pH為7.2～7.4，分裝、121℃滅菌10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃曲霉菌活化培養(yǎng) 黃曲霉菌CGMCC 3.4408標(biāo)準(zhǔn)菌株取出，在生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)，將菌株室溫解凍后，在無(wú)菌的條件下接種PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4 d～8 d后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3 黃曲霉菌孢子計(jì)數(shù) 生物安全實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌的條件下，取擴(kuò)大培養(yǎng)的黃曲霉菌培養(yǎng)基，加入一定量的無(wú)菌的PBST，將用黃曲霉菌洗脫后，收集到EP管中，用無(wú)菌的PBST 8 000 r/min 5 min洗滌3次后，再用無(wú)菌紗布過(guò)濾3次除去黃曲霉菌孢子的菌絲，進(jìn)行計(jì)數(shù)。用無(wú)菌的PBST調(diào)整黃曲霉菌孢子濃度為1×107cfu/mL備用。

1.2.4 黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率測(cè)定 生物安全實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌的條件下，取不同種類的中藥水提物藥液1 mL分別涂布PDA培養(yǎng)基上，待中藥水提物藥液液體完全被吸收后，在PDA培養(yǎng)基中心按照中藥水提物藥液與黃曲霉菌孢子懸液1∶50比例，接種20 μL黃曲霉菌孢子懸液(1×107cfu/mL)，對(duì)照組不添加任何藥物接種等量的黃曲霉菌孢子懸液，28℃恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，分別在黃曲霉菌培養(yǎng)后48、72、96 h測(cè)量菌落大小。每種中藥水提物做3個(gè)重復(fù)并3次試驗(yàn)結(jié)果平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與計(jì)算不同種類中藥水提物對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制率。霉菌生長(zhǎng)抑制率(%)=(空白對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑)/空白對(duì)照組菌落直徑×100。

1.2.5 黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率測(cè)定 在生物安全實(shí)驗(yàn)室中，取2.5 mL的察氏培養(yǎng)基分別加入等量的不同種類的中藥水提物藥液，分別接種500 μL的黃曲霉胞子孢液(1×107cfu/mL)，每種中藥水提物做3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組不添加中藥水提物，28℃振蕩培養(yǎng)，分別在振蕩培養(yǎng)后的6、18、24 h取每種藥水提物藥液試驗(yàn)組及對(duì)照組培養(yǎng)液0.1 mL均勻涂布PDA平板，28℃培養(yǎng)4 d～8 d后，對(duì)黃曲霉菌孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，黃曲霉菌胞子孢生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式為：抑制率(%)=(空白對(duì)照組孢子數(shù)-試驗(yàn)組孢子數(shù))/空白對(duì)照組孢子數(shù)×100。

1.2.6 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測(cè)定 在無(wú)菌條件下，向產(chǎn)毒培養(yǎng)基中均勻涂布2 mL甘油水溶液，待液體完全被吸收，分別接種黃曲霉菌孢子。將不同種類的中藥水提物培養(yǎng)液0.1 mL分別接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6、18、24 h，同時(shí)需做空白對(duì)照組。將無(wú)菌的生理鹽水和黃曲霉孢子懸液(1×107cfu/mL)按照1∶1比例配合均勻后，取0.1 mL用同樣方法接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)15 d～20 d。每種中藥水提物及空白對(duì)照做3個(gè)重復(fù)并3次試驗(yàn)結(jié)果平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。提取黃曲霉毒素，并按照AFB1檢測(cè)試劑盒測(cè)定其產(chǎn)毒量。霉菌產(chǎn)毒量抑制率(%)=(空白對(duì)照組產(chǎn)毒量-試驗(yàn)組產(chǎn)毒量)/空白對(duì)照組產(chǎn)毒量×100。

2 結(jié)果

2.1 黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果

由見(jiàn)表1可知，10種清熱解毒的中藥水提取對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)有不同程度的抑制效果，培養(yǎng)48 h時(shí)，黃連、金銀花、蒲公英、紫花地丁、白頭翁5種藥物水提物對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)的抑制率在15.3%～16.9%；隨著黃曲霉菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，10種清熱解毒的中藥水提取對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制效果也有所增加，到培養(yǎng)96 h時(shí)，黃連、金銀花、蒲公英、板藍(lán)根、紫花地丁、白頭翁6種藥物對(duì)黃曲霉菌的抑制率在達(dá)到21.4%～22.5%，其他藥物對(duì)黃曲霉菌的抑制率在11.4%～15.8%。

表1 10種清熱解毒中藥水提物對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果

2.2 黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果

由見(jiàn)表2可知，10種清熱解毒的中藥水提物對(duì)黃曲霉菌菌孢子生長(zhǎng)有不同程度的抑制效果，培養(yǎng)48 h時(shí)，黃連、金銀花、大青葉、蒲公英、板藍(lán)根、射干、白頭翁7種藥物水提物對(duì)黃曲霉菌孢子的抑制率在19.2%～21.1%；培養(yǎng)18 h時(shí)，黃曲霉菌孢子抑制效果有所增加；培養(yǎng)96 h時(shí)，10種清熱解毒的中藥水提取對(duì)黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率達(dá)到了最高，其中，黃連、金銀花、大青葉、蒲公英、板藍(lán)根、射干、白頭翁7種藥物水提物對(duì)黃曲霉菌孢子的抑制率在53.1%～75.8%；其他藥物水提物對(duì)黃曲霉菌孢子的抑制率在22.5%～39.3%。

表2 10種清熱解毒中藥水提物對(duì)黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果

2.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測(cè)定結(jié)果

10種清熱解毒的中藥水提取物對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量有不同程度的抑制效果，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，10種清熱解毒的中藥水提取物對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量的抑制率也在增長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h時(shí)，10種清熱解毒的中藥水提取物對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量的抑制率最高，其中，黃連、金銀花、板藍(lán)根、射干、白頭翁5種藥物水提物對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率較高，為73.3%～89.6%，其他中藥水提物對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率為42.6%～50.2%(表3)。

表3 10種清熱解毒中藥水提物對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量的抑制率測(cè)定結(jié)果

3 討論

黃曲霉菌素主要的靶器官是肝臟，當(dāng)動(dòng)物和人采食了被黃曲霉菌污染的飼料和食品后，黃曲霉菌素蓄積在動(dòng)物和人的肝臟中，導(dǎo)致肝解毒功能下降，產(chǎn)生的毒素在血液中迅速繁殖，隨著血液循環(huán)造成全身的中毒狀態(tài)[3-6]。黃曲霉菌素不僅會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)性能和生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重死亡，還可以導(dǎo)致人嚴(yán)重中毒，甚至致癌變[8-9]。因此，有效控制黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒量，才能減少食品和飼料的黃曲霉毒素污染。相關(guān)研究表明了乳酸菌等益生菌制劑或者植物提取物對(duì)黃曲霉菌落生長(zhǎng)、黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)及產(chǎn)毒量等方面均有一定的抑制效果[10-11]。中草藥具有清熱解毒、清除內(nèi)毒素、使用安全、低殘留、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[12]。但是，國(guó)內(nèi)外關(guān)于中藥抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)特性研究沒(méi)有報(bào)道，因此，本試驗(yàn)選用了10種清熱解毒中藥水提物對(duì)黃曲霉菌落生長(zhǎng)抑制率、黃曲霉孢子生長(zhǎng)抑制率和黃曲霉產(chǎn)毒量等研究。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)96 h時(shí)，黃連、金銀花、蒲公英等6種藥物水提物對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率為21.4%～22.5%；黃連、金銀花、大青葉等7種藥物水提物對(duì)黃曲霉菌孢子的抑制率在53.1%～75.8%；黃連、金銀花、板藍(lán)根等5種藥物水提物對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率在73.3%～89.6%，從而證實(shí)了清熱解毒類中藥對(duì)黃曲霉菌落生長(zhǎng)、黃曲霉孢子生長(zhǎng)、黃曲霉菌產(chǎn)毒量具有較高抑制作用。本研究結(jié)果高于姚婉等[10]報(bào)道的乳酸菌對(duì)黃曲霉菌落生長(zhǎng)和黃曲霉孢子生長(zhǎng)抑制率?？赡苡捎邳S連、金銀花、板藍(lán)根等清熱解毒類的中藥可以抑制黃曲霉菌代謝和細(xì)胞壁的合成，從而能抑制黃曲霉菌落及孢子的生長(zhǎng)。當(dāng)黃曲霉菌菌落及孢子生長(zhǎng)受到抑制時(shí)，黃曲霉菌的產(chǎn)毒量也會(huì)受到抑制。清熱解毒類中藥對(duì)黃曲霉毒素菌作用機(jī)理復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研發(fā)去除食品和飼料中黃曲霉菌復(fù)方中藥制劑及應(yīng)用提供了依據(jù)。