張雄?賀慧華?高緒照

【摘要】膽管癌是肝臟第二大常見的惡性腫瘤，早期癥狀不典型、惡性程度高、病死率高是其特點(diǎn)，目前全球范圍內(nèi)膽管癌的總體發(fā)病率逐年遞增，且多數(shù)膽管癌患者的預(yù)后較差，迫切需要有效的診斷、治療策略來改變這一現(xiàn)狀。腫瘤建模是癌癥研究的一大熱點(diǎn)，建立膽管癌實驗?zāi)Ｐ陀兄谏钊肓私?、研究膽管癌的發(fā)生、發(fā)展、藥物治療效應(yīng)等，對膽管癌的早期診斷及治療具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】膽管癌；體外模型；3D打??；體內(nèi)模型；CRISPR/Cas9；基因工程

Progress in experimental models of cholangiocarcinoma Zhang Xiong△， He Huihua， Gao Xuzhao.△Jishou University， Jishou 416000， China

Corresponding author， Gao Xuzhao， E-mail： zjjgxzh@126.com

【Abstract】Cholangiocarcinoma is the second most common malignant tumor of the liver， which is characterized by atypical early symptoms， high malignancy and high mortality. Currently， the overall incidence of cholangiocarcinoma has been increased year by year worldwide and a majority of cholangiocarcinoma patients obtain poor prognosis. Effective diagnosis and treatment strategies are urgently required to change this situation. The establishment of disease models is a hot topic in cancer research. The establishment of experimental models of cholangiocarcinoma contributes to in-depth understanding and study of the incidence， development and drug therapeutic effect of cholangiocarcinoma， which is of significance for early diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma.

【Key words】Cholangiocarcinoma； In vitro model； 3D printing； In vivo model； CRISPR/Cas9； Genetic engineering

生物建模作為一種研究復(fù)雜生物系統(tǒng)的實驗方法，在揭示癌癥分子機(jī)制和開發(fā)治療上發(fā)揮了巨大作用，但目前良好的模型設(shè)計及其實驗應(yīng)用方面仍存在部分不足，在本綜述中，我們將探討建模的基本理論，常用實驗?zāi)Ｐ?，并探討膽管癌基因組學(xué)和建模的進(jìn)展。

一、膽管癌體外模型

常見的膽管癌體外模型包括細(xì)胞系模型、球狀體模型、類器官模型、3D生物打印模型等。體外模型一直是膽管癌研究的重要工具，因其具有實驗可重復(fù)性高、維護(hù)成本較低、可進(jìn)行高通量藥物篩選、長期擴(kuò)增穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)而備受學(xué)者的青睞，但它們也有一些局限性，如模型與體內(nèi)腫瘤微環(huán)境及其他細(xì)胞、生物介質(zhì)信號的脫離，模型建立初期成本較高且成功率低等缺點(diǎn)。只有熟知各體外模型優(yōu)缺點(diǎn)并結(jié)合自身實驗的特點(diǎn)，揚(yáng)長避短，才能充分發(fā)揮模型的優(yōu)勢。

1.膽管癌細(xì)胞系模型

細(xì)胞系是基礎(chǔ)研究中最常用，且特征明確、遺傳學(xué)穩(wěn)定的二維模型，成本較低、易于培養(yǎng)、可進(jìn)行基因改造、可重復(fù)性高且實驗結(jié)果獲取較快均是其顯著優(yōu)點(diǎn)，但由于細(xì)胞系的二維分布以及易脫離腫瘤周圍環(huán)境，導(dǎo)致其無法真實還原原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性。Xue等［1］使用了QBC939和HuCC-T1 2種人膽管癌細(xì)胞，證實了Tweety家族成員3基因在2種膽管癌細(xì)胞中表達(dá)的上調(diào)不僅促進(jìn)了膽管癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲性，還可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)膽管癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。細(xì)胞系模型推動了學(xué)者們在細(xì)胞分子水平上對膽管癌的發(fā)生、發(fā)展等內(nèi)在機(jī)制方面的深入研究與理解。

2.球狀體模型

球狀體模型是細(xì)胞系培養(yǎng)中自發(fā)建立的三維細(xì)胞系聚集體。眾所周知，多數(shù)癌癥源于具有類似干細(xì)胞自我更新和多向分化能力的癌細(xì)胞，而這類細(xì)胞常被稱為癌癥干細(xì)胞（CSC），也被認(rèn)為是化學(xué)治療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素，對癌癥耐藥研究具有重要意義［2］。球狀體模型是一種常用的CSC富集方法，Correnti等［3］研究了人絲氨酸蛋白酶抑制劑B3基因在膽管癌干細(xì)胞球狀體模型中的表達(dá)情況，并將其認(rèn)定為預(yù)后不良患者的標(biāo)志物。此模型同樣表現(xiàn)出類似細(xì)胞系模型的脫離腫瘤微環(huán)境的局限性。

3.類器官模型

類器官模型是由多能干細(xì)胞增殖、分化形成的具有一定自組織能力的三維細(xì)胞復(fù)合體。腫瘤類器官模型具有原發(fā)腫瘤特有的多種細(xì)胞類型和相似的組織學(xué)和基因?qū)W特性，能在體外培養(yǎng)體系中穩(wěn)定擴(kuò)增，可較好地再現(xiàn)原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性［4］。有研究者評估了患者來源的腫瘤類器官（PDO）在預(yù)測臨床患者對于抗癌藥物反應(yīng)的潛力，結(jié)果顯示靈敏度達(dá)100%，特異度為93%，陽性和陰性預(yù)測值分別為88%和100%［5-6］。另外，膽管癌PDO和免疫細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，可用于預(yù)測對患者有效的免疫檢查點(diǎn)抑制劑［6］?；诖?，患者來源的腫瘤類器官模型可能是臨床前期及體外預(yù)測患者對抗癌藥物敏感性的理想模型，但目前存在成本較高、手工操作繁瑣、無法進(jìn)行微環(huán)境調(diào)控等局限性。

4. 3D生物打印模型

3D打印技術(shù)以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，結(jié)合可粘合材料，通過打印設(shè)備逐層、立體構(gòu)造物體。與細(xì)胞相關(guān)的打印技術(shù)稱為3D生物打印，通過使用生物材料、細(xì)胞和（或）細(xì)胞因子等作為生物印刷墨水來構(gòu)建人體組織或器官［7］。依據(jù)不同成型原理和打印材料，可分為基于噴墨的生物打印、基于擠壓的生物打印、光輔助生物打印、光固化生物打印四大類?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中暫時只見擠壓式模型被應(yīng)用于膽管癌模型的報道，故只對其進(jìn)行討論。

基于擠壓的生物打印是目前使用最廣的生物打印方法，它通過擠壓生物墨水使其從噴嘴中連續(xù)擠出纖化細(xì)絲沉積物來打印，其優(yōu)點(diǎn)是具有較廣的生物印刷墨水相容性，但其產(chǎn)生的機(jī)械壓力和剪切力也會使細(xì)胞活性降低或死亡［8］。Mao等［9］使用擠壓打印建立了患者來源的膽管癌3D打印模型，并與初代細(xì)胞系進(jìn)行了同步培養(yǎng)和對比評估，結(jié)果顯示3D打印模型的干性特征、纖維化程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力等惡性指標(biāo)均較細(xì)胞系模型顯著增強(qiáng)，且在隨后的抗癌藥物測試中表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性。3D生物打印模型在腫瘤進(jìn)展、腫瘤微環(huán)境、藥物篩選評估中顯示出廣闊的前景，通過此項技術(shù)可以在體外重現(xiàn)原生的組織和血管結(jié)構(gòu)，不僅可用于腫瘤建模研究，還可構(gòu)建類器官模型及仿生組織［10-13］。

二、膽管癌體內(nèi)模型

膽管癌體內(nèi)模型常使用實驗鼠建立，常用模型包括腫瘤移植模型、基于化學(xué)致癌物的誘發(fā)模型、基因工程小鼠模型（GEMM）等。理想的膽管癌體內(nèi)模型應(yīng)具有腫瘤微環(huán)境及免疫力才能較好地還原人類腫瘤病理學(xué)特征和分子生物學(xué)改變。然而，現(xiàn)有動物模型存在不同的局限性，沒有完美的模型可以滿足膽管癌研究的所有需求，因此為不同實驗?zāi)康倪x擇合適的模型是關(guān)鍵，需考慮到腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)、宿主免疫活性、腫瘤微環(huán)境、基因改變等多個因素，權(quán)衡利弊。

1.腫瘤移植模型

腫瘤移植模型是腫瘤體內(nèi)研究常用的模型，一般使用不同品類及遺傳背景的實驗鼠建模，其使用便捷、可重復(fù)性好、成本適中、腫瘤形成時間短，常用于評估體內(nèi)抗腫瘤藥物的療效及耐受性。由于膽管在肝臟內(nèi)的存在環(huán)境獨(dú)特，因此原位移植模型比異位移植更適合模擬人類膽管癌的發(fā)展及演變，但原位移植常需超聲、微型CT、MRI等方法評估腫瘤大小及轉(zhuǎn)移情況。

異種移植模型常通過皮下注射將腫瘤細(xì)胞、組織移植于免疫缺陷小鼠或裸鼠中建立，建模成功后可較簡便地觀測到腫瘤體積、生長情況及完成腫瘤標(biāo)本切取。在長期、連續(xù)的傳代培養(yǎng)中，由于特異性突變、亞克隆、選擇壓力以及缺乏腫瘤微環(huán)境等緣由，通常會使異種移植模型逐漸喪失腫瘤異質(zhì)性［10］。針對上述缺點(diǎn)，有研究者使用PDO異種移植模型證實了即使在體內(nèi)或體外經(jīng)過長期擴(kuò)增培養(yǎng)，PDO異種移植模型也可保留與初代膽管癌細(xì)胞相同的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)譜［11］。由于異種移植模型只能用于免疫缺陷宿主，不適合進(jìn)行腫瘤免疫學(xué)研究，且腫瘤移植物與宿主不同物種之間微環(huán)境的不匹配可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，因此異種移植模型的應(yīng)用受到了限制。

同種移植模型使用同源實驗鼠建立，可在一定程度上避免宿主的免疫缺陷導(dǎo)致的實驗誤差。Aoki等［12］使用同基因型小鼠膽管癌細(xì)胞原位植入于同源小鼠的肝臟中，證實了阻斷胎盤生長因子基因可通過減少磷酸激酶B（AKT）的活化和膽管癌細(xì)胞的增殖及侵襲來抑制原位腫瘤的生長，為膽管癌治療提供了靶向方案。

2.基于化學(xué)致癌物的誘發(fā)模型

經(jīng)口服、注射等途徑進(jìn)入實驗鼠體內(nèi)的化學(xué)致癌物通過破壞細(xì)胞DNA完整性、破壞細(xì)胞膜、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等產(chǎn)生基因毒性效應(yīng)，從而誘發(fā)小鼠肝臟慢性炎癥，引起膽管的纖維化，使其進(jìn)一步進(jìn)展為膽管癌［13-14］。常用的化學(xué)致癌物有：二乙基亞硝胺（DEN）、二甲基亞硝胺（DMN）、呋喃、硫代乙酰胺或四氯化碳（CCl4）等［15］。雖然基于化學(xué)致癌物的誘發(fā)模型給藥簡便，具有良好的可重復(fù)性，但是除了誘導(dǎo)產(chǎn)生膽管癌之外，還有可能會誘發(fā)肝癌或其他全身性腫瘤，影響實驗結(jié)果，因此學(xué)者們常將該模型與膽汁淤積、吸蟲感染等模型聯(lián)用來提高膽管癌建模成功率［16］。

3.膽汁淤積模型

膽汁淤積模型，例如左膽管結(jié)扎（LMBDL）模型，通過產(chǎn)生慢性膽汁淤積來促使膽管癌病變的發(fā)生，目前已知原發(fā)性硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和膽道閉鎖均為膽管癌癌前病變的高危因素，且均與膽汁淤積癥相關(guān)。Yang等［17］使用化學(xué)藥物L(fēng)MBDL和DEN聯(lián)合建模，結(jié)果顯示可使50%的小鼠模型在第28周時形成膽管癌，而單獨(dú)接受LMBDL或DEN的動物膽管癌發(fā)生率為0%。膽汁淤積模型需行膽管結(jié)扎手術(shù)，對操作者的技能要求相對較高，且實驗鼠易受麻醉和手術(shù)風(fēng)險因素的影響導(dǎo)致實驗失敗。

4.吸蟲感染模型

肝吸蟲感染模型是通過肝吸蟲感染誘導(dǎo)膽管產(chǎn)生慢性炎癥以及膽管上皮的損傷和對肝吸蟲抗原的免疫病理反應(yīng)促使膽管癌的發(fā)生。Thamavit等［18］使用了肝吸蟲感染和DMN的組合建模，給實驗鼠喂食并感染肝吸蟲后再服用DMN，能使100%的實驗鼠發(fā)生膽管癌，該聯(lián)合模型建模成功率較高，能進(jìn)一步節(jié)省實驗成本。需注意的是，由于小鼠的個體差異，在經(jīng)受感染后，感染模型的潛伏期各不相同，會導(dǎo)致實驗可控性欠佳。

5. GEMM

GEMM是癌癥研究的重要工具，通過基因編輯、轉(zhuǎn)基因或基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等技術(shù)使常見的致癌相關(guān)基因發(fā)生缺失（敲除）、過表達(dá)或突變等改變誘導(dǎo)實驗鼠產(chǎn)生腫瘤，常用于在特定基因水平上分析致癌基因、腫瘤抑制基因，以及復(fù)雜的生物信號途徑在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和治療轉(zhuǎn)歸等階段中的作用機(jī)制，是可有效地識別預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，并可用于臨床前評估靶向藥物的治療反應(yīng)［19］。由于腫瘤是在擁有完全免疫力的GEMM中自發(fā)發(fā)生的，能較好地模擬還原人類膽管癌的形成過程，但GEMM造價較高，且常無法還原膽管癌相關(guān)的慢性肝損傷、炎癥特征環(huán)境。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的保護(hù)自身基因完整性的防御性機(jī)制，主要由RNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶和單鏈引導(dǎo)RNA （sgRNA） 組成，sgRNA按堿基互補(bǔ)配對原則引導(dǎo)Cas9與目標(biāo)DNA靶點(diǎn)結(jié)合，由Cas9蛋白切割、斷裂雙鏈DNA，在隨后的DNA修復(fù)過程中，在存有修復(fù)模板或非同源末端連接的情況下進(jìn)行基因重組修復(fù)［20］。Gao等［21］使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)建立了異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變的膽管癌細(xì)胞系模型，并證實了IDH1突變誘導(dǎo)的R-2-羥基戊二酸（R-2HG）基因可以通過調(diào)節(jié)FTO/m6A-methylated ERα/miR16-5p/YAP1信號通路來抑制膽管癌生長。CRISPR/Cas9已成為目前基因組工程中重要的基因編輯工具之一，具有快速、高效、操作簡便、成本相對較低、精準(zhǔn)的基因編輯與調(diào)控能力等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被成功應(yīng)用于生物基因修飾與人類疾病的治療，對膽管癌診治有廣泛的應(yīng)用前景，根據(jù)目的基因是否需要激活條件可分為條件激活型轉(zhuǎn)基因模型和非條件型基因轉(zhuǎn)導(dǎo)模型。

5.1條件激活型轉(zhuǎn)基因小鼠模型

條件激活型轉(zhuǎn)基因模型常借助Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，并聯(lián)合實驗鼠雜交來建立啟動子激活下的Cre重組酶特定基因改造小鼠［22］。Zhao等［23］借助Cre-LoxP系統(tǒng)及小鼠雜交，建立了白蛋白啟動子激活的攜有Cre重組酶的SMAD4及PTEN共敲除實驗鼠，證實抑癌基因CULLIN 3缺失后可間接誘導(dǎo)雙調(diào)蛋白Areg分泌，從而促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生以形成腫瘤微環(huán)境，這就是肝臟特異性SMAD4基因和PTEN基因缺失模型。Ikenoue等［24］使用白蛋白啟動子激活的特異性KRAS基因和PTEN基因敲除的實驗鼠建立肝臟特異性KRAS基因激活和PTEN基因缺失模型，該模型腫瘤進(jìn)展較快且只誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管癌發(fā)生，中位生存期僅為46 d，均有肝大、血性腹水以及黃疸和體質(zhì)量減輕等癥狀，在實驗中也可觀察到MAPK和PI3K-mTOR信號通路的激活，是研究肝內(nèi)膽管癌發(fā)生機(jī)制的有效模型。多數(shù)膽管癌條件激活型轉(zhuǎn)基因模型無法模擬慢性肝損傷、炎癥及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等腫瘤環(huán)境，可能適用于非晚期膽管癌的研究。

5.2非條件基因轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠模型

非條件基因轉(zhuǎn)導(dǎo)模型的建立常通過在小鼠肝臟、膽管局部注射轉(zhuǎn)座子和（或）特異性啟動子介導(dǎo)的相關(guān)癌基因來建立。轉(zhuǎn)座子可以攜帶外源基因片段在動物體內(nèi)進(jìn)行高效轉(zhuǎn)位，是基因工程動物建模領(lǐng)域的重要工具，其中較常用的是睡美人轉(zhuǎn)座子。Hu等［25］通過水流動力學(xué)尾靜脈注射睡美人轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染AKT和NICD致癌基因至實驗小鼠，成功建立了Akt-NICD基因模型，并證實了抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（TEAD）或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)締合域蛋白可終止Akt-NICD軸驅(qū)動的由肝細(xì)胞向肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，為膽管癌提供了新的靶向治療思路。與蛋白激酶B（AKT）相似，Yes相關(guān)蛋白（YAP）是一種與癌癥發(fā)展有關(guān)的轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白［26］。將攜有AKT/YAP基因質(zhì)粒的睡美人轉(zhuǎn)座子混合物直接注射于小鼠膽管中可建立AKT/YAP基因模型。通過此模型，Zhang等［27］證實了YAP通過轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域（TEAD）依賴性轉(zhuǎn)錄激活并與β-Catenin通路相互作用誘導(dǎo)膽管癌的發(fā)生，而敲除Catenin Beta1基因后可顯著抑制其發(fā)生過程及膽管癌細(xì)胞的生長，該研究的發(fā)現(xiàn)對制定膽管癌治療策略具有重要意義。

三、總結(jié)與展望

膽管癌是一類預(yù)后較差的疾病，且目前致病機(jī)制尚未完全明確，癌癥實驗?zāi)Ｐ驮诎┌Y的發(fā)病機(jī)制研究、疾病進(jìn)展及治療評估中舉足輕重。本文介紹了不同類型的膽管癌模型和相關(guān)建模技術(shù)，以及部分模型的特點(diǎn)及不足，單個膽管癌模型存在一定的局限性，多種模型系統(tǒng)的組合聯(lián)用也將成為癌癥模型發(fā)展中取長補(bǔ)短的必由之路。這些模型可基于患者或動物樣本來源的基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)等進(jìn)行深入研究并解析膽管癌的致病機(jī)制、分子基礎(chǔ)、腫瘤轉(zhuǎn)移、與宿主的相互作用、腫瘤微環(huán)境的作用以及膽管癌的內(nèi)在異質(zhì)性，可為預(yù)測新的治療靶點(diǎn)、癌癥標(biāo)志物以及促進(jìn)藥物研發(fā)提供極大的幫助，對提高膽管癌早期防治水平意義重大。

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（收稿日期：2023-02-25）

（本文編輯：洪悅民）