謝秀芳，李文燕（通信作者）

福建省龍巖市第一醫(yī)院 （福建龍巖 364000）

石蠟包埋是現(xiàn)階段制作病理切片的重要方法。該方法通過將標(biāo)本置于融化石蠟中冷卻固化，從而達(dá)到支撐組織和維持標(biāo)本形態(tài)穩(wěn)定的效果，包埋質(zhì)量可直接影響后續(xù)切片、染色和診斷結(jié)果[1]。近年來，惡性腫瘤發(fā)病率快速增長，臨床對(duì)病理診斷的要求逐漸提升，且小標(biāo)本活檢情況增多，對(duì)石蠟切片質(zhì)量的要求明顯提升，因此病理科需要不斷改進(jìn)石蠟包埋等病理操作流程[2]。既往研究表明，石蠟包埋過程中模具溫度、冷卻方式和注蠟方式等技術(shù)細(xì)節(jié)均為影響包埋質(zhì)量的重要因素[3-5]。此外，不同包埋機(jī)對(duì)石蠟包埋操作流程和細(xì)節(jié)也可能存在不同要求。本研究探討賽默飛HistoStar 包埋機(jī)不同模具溫度、冷卻方式、注蠟方式對(duì)病理標(biāo)本包埋質(zhì)量的影響，為進(jìn)一步提升組織切片質(zhì)量和病理診斷準(zhǔn)確率提供參考信息，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 設(shè)備和材料

徠卡生物系統(tǒng)（里士滿）有限公司生產(chǎn)的賽默飛HistoStar 組織包埋機(jī)、Pathcenitre 脫水機(jī)、Finessemit 切片機(jī)及蘇木精-伊紅染色液，廣東金泉醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的脫水盒、載玻片，西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)的脫水劑。

1.2 方法

選取2022 年1—12 月我院病理科的500 份組織標(biāo)本，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1、2、3、4 組，每組100 份。

對(duì)照組采用常規(guī)模具溫度、冷卻方式和注蠟方式進(jìn)行石蠟包埋：采用常溫模具，首次注蠟注滿模具，將標(biāo)本置于模具底部正中央，待模具側(cè)壁石蠟逐漸凝固時(shí)覆蓋包埋盒，二次注蠟至液面與包埋盒上緣平齊，轉(zhuǎn)移至冷臺(tái)，充分冷卻后切片并染色。

實(shí)驗(yàn)1 組將模具加熱至70 ℃并置于包埋機(jī)蠟嘴下方熱臺(tái)上；實(shí)驗(yàn)2 組采用冷卻臺(tái)加水冷卻（在冷卻臺(tái)上添加少量水）；實(shí)驗(yàn)3 組首次注蠟至模具容量的2/3，二次注蠟前將模具和包埋盒傾斜25°，并注蠟至液面沒過包埋盒下緣；實(shí)驗(yàn)4 組采用70 ℃模具，首次注蠟至模具容量的2/3，將標(biāo)本置于模具底部正中央處，待模具側(cè)壁石蠟逐漸凝固時(shí)覆蓋包埋盒，將模具和包埋盒傾斜25°后二次注蠟至液面沒過包埋盒下緣，然后轉(zhuǎn)移至冷卻臺(tái)加水冷卻，充分冷卻后切片染色。實(shí)驗(yàn)1、2、3 組其他操作同對(duì)照組。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較各組包埋質(zhì)量：標(biāo)本居中、組織模塊與包埋模具平行且無裂隙、包埋面準(zhǔn)確且高度一致、蠟塊無氣泡或污染情況、多條組織排列整齊且方向保持一致為包埋合格。（2）比較各組包埋時(shí)間。（3）比較各組切片評(píng)分：由2 名具有5 年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法評(píng)分，結(jié)果取2 名醫(yī)師評(píng)分的均值；評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《免疫組織化學(xué)病理診斷》[6]，內(nèi)容包括組織結(jié)構(gòu)完整性（切片完整、無折疊、無皺褶、無刀痕）、細(xì)胞顯示效果（細(xì)胞透明度、核質(zhì)對(duì)比度）及網(wǎng)狀纖維顯示效果（背景清潔度、纖維完整度、網(wǎng)狀/膠原纖維對(duì)比度）3 大項(xiàng)9 小項(xiàng)，每個(gè)小項(xiàng)總分均為10 分，大項(xiàng)評(píng)分為大項(xiàng)內(nèi)各小項(xiàng)平均評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組包埋質(zhì)量、包埋時(shí)間比較

各實(shí)驗(yàn)組包埋合格率均高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)4 組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)1 組包埋時(shí)間長于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)2、3、4 組包埋時(shí)間均短于對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)2、4 組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 各組蠟塊包埋質(zhì)量、包埋時(shí)間比較

2.2 各組組織結(jié)構(gòu)完整性比較

各實(shí)驗(yàn)組切片完整、無折疊、無皺褶和無刀痕評(píng)分均高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)4 組切片完整、無折疊和無皺褶評(píng)分高于其他實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)3 組和實(shí)驗(yàn)4 組無刀痕評(píng)分高于實(shí)驗(yàn)1 組和實(shí)驗(yàn)2 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 各組組織結(jié)構(gòu)完整性比較（分，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1 組比較，bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)2 組比較，cP<0.05；與實(shí)驗(yàn)3 組比較，dP<0.05

組別 份數(shù) 切片完整 無折疊 無皺褶 無刀痕實(shí)驗(yàn)1 組 100 9.51±0.18a 9.40±0.13a 9.57±0.14a 9.04±0.16a實(shí)驗(yàn)2 組 100 9.47±0.14a 9.38±0.15a 9.61±0.12a 9.05±0.14a實(shí)驗(yàn)3 組 100 9.48±0.16a 9.42±0.18a 9.58±0.15a 9.26±0.12abc實(shí)驗(yàn)4 組 100 9.72±0.09abcd 9.68±0.07abcd 9.74±0.10abcd 9.27±0.15abc對(duì)照組 100 9.24±0.25 9.05±0.16 9.42±0.18 9.02±0.13 F 11.320 245.259 65.875 79.646 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.3 各組細(xì)胞顯示效果比較

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞透明度和核質(zhì)對(duì)比度評(píng)分均高于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)4 組高于其他實(shí)驗(yàn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 各組細(xì)胞顯示效果比較（分，±s）

表3 各組細(xì)胞顯示效果比較（分，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1 組比較，bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)2 組比較，cP<0.05；與實(shí)驗(yàn)3 組比較，dP<0.05

組別 份數(shù) 細(xì)胞透明度 核質(zhì)對(duì)比度實(shí)驗(yàn)1 組 100 9.38±0.12a 9.47±0.16a實(shí)驗(yàn)2 組 100 9.42±0.15a 9.45±0.18a實(shí)驗(yàn)3 組 100 9.41±0.14a 9.48±0.13a實(shí)驗(yàn)4 組 100 9.53±0.10abcd 9.60±0.07abcd對(duì)照組 100 9.17±0.18 9.32±0.19 F 87.310 42.839 P<0.001 <0.001

2.4 各組網(wǎng)狀纖維顯示效果比較

各組背景清潔度、網(wǎng)狀/膠原纖維對(duì)比度評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各實(shí)驗(yàn)組纖維完整度評(píng)分均高于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)4 組高于其他實(shí)驗(yàn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

表4 各組網(wǎng)狀纖維顯示效果比較（分，±s）

表4 各組網(wǎng)狀纖維顯示效果比較（分，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1 組比較，bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)2 組比較，cP<0.05；與實(shí)驗(yàn)3 組比較，dP<0.05

組別 例數(shù) 背景清潔度 纖維完整度 網(wǎng)狀/ 膠原纖維對(duì)比度實(shí)驗(yàn)1 組100 9.45±0.13 9.38±0.16a 9.27±0.18實(shí)驗(yàn)2 組100 9.46±0.17 9.35±0.19a 9.30±0.15實(shí)驗(yàn)3 組100 9.43±0.16 9.37±0.14a 9.28±0.17實(shí)驗(yàn)4 組100 9.47±0.15 9.46±0.12abcd 9.31±0.14對(duì)照組 100 9.46±0.17 9.25±0.18 9.30±0.15 F 0.936 22.131 1.072 P 0.442 <0.001 0.370

3 討論

自19 世紀(jì)德國病理學(xué)家Rudolf Virchow 開創(chuàng)細(xì)胞病理時(shí)代以來，組織切片在疾病診斷中的作用日益重要，切片質(zhì)量成為影響診斷準(zhǔn)確性的重要因素[7]。病理切片制作包括取材、脫水及石蠟包埋等多個(gè)環(huán)節(jié)，且每個(gè)環(huán)節(jié)均可能影響切片質(zhì)量。雖然目前已形成較為規(guī)范和完善的切片操作流程，但仍有較多細(xì)節(jié)因儀器設(shè)備、組織類型及技術(shù)人員操作習(xí)慣等因素不同而存在較大差異，還需根據(jù)臨床需求不斷改進(jìn)和完善。其中石蠟包埋是后續(xù)切片、染色和診斷的基礎(chǔ)，因此提升包埋質(zhì)量具有重要意義。包埋的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括選擇適宜模具溫度、冷卻方式和注蠟方式等。

正常情況下包埋模具置于熱臺(tái)時(shí)，僅有底部可以受熱，石蠟注入后為融化狀態(tài)，而其他部位由于溫度降低可在短時(shí)間內(nèi)凝固，難以將組織標(biāo)本沉降至包埋盒底部并按壓平整，導(dǎo)致石蠟包埋合格率低。同時(shí)制作切片時(shí)常因組織不在同一切面導(dǎo)致結(jié)構(gòu)完整性喪失，細(xì)胞和網(wǎng)狀纖維顯示效果也明顯降低[7]。本研究中，實(shí)驗(yàn)1 組將包埋模具加熱至約70 ℃，與石蠟熔點(diǎn)（56～62 ℃）相近，因此可有效延緩石蠟?zāi)趟俣?，為將組織標(biāo)本按照正確位置方向置入包埋盒底部提供充足時(shí)間。實(shí)驗(yàn)1 組包埋合格率達(dá)97.00%，同時(shí)切片組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞顯示效果及網(wǎng)狀纖維完整度評(píng)分高于對(duì)照組，表明將包埋模具加熱至70 ℃是提升包埋質(zhì)量的有效方法，與羅添友等[8]研究結(jié)果相似。但由于石蠟冷卻和凝固速度減慢，導(dǎo)致完成包埋時(shí)間較對(duì)照組延長，工作效率降低，因此還需對(duì)冷卻方式進(jìn)行改進(jìn)。

石蠟包埋完成組織定位后需要置于冷臺(tái)進(jìn)行冷卻，但常規(guī)冷卻方式僅有模具底部可以受冷，導(dǎo)致石蠟?zāi)趟俣容^慢，不僅使工作效率降低，組織樣本在石蠟?zāi)踢^程中還容易出現(xiàn)易位。在冷卻臺(tái)上添加少量水，可有效增加包埋模具受熱面積，使石蠟在較短時(shí)間內(nèi)成為半凝固狀態(tài)，不僅有利于提升包埋合格率和速度，減少周圍殘蠟，對(duì)防止包埋模具底部樣本組織移位也具有積極作用，從而可提升切片組織結(jié)構(gòu)完整性及染色效果。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)2 組包埋合格率為98.00%，包埋時(shí)間僅（194.36±12.54）s，較其他各組明顯降低，表明在冷卻臺(tái)上添加少量水可能是提升石蠟包埋質(zhì)量和速度的有效方法，但實(shí)驗(yàn)2 組和對(duì)照組的包埋合格率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因樣本容量不足所致，因此該結(jié)果還有待后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)2 組切片組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞顯示效果及網(wǎng)狀纖維完整度評(píng)分均較對(duì)照組升高，可見在冷卻臺(tái)上添水冷卻是提升石蠟包埋質(zhì)量的有效方法。

注蠟量和注蠟方式也可影響包埋質(zhì)量。既往研究認(rèn)為，一次注蠟時(shí)若注滿包埋模具，組織樣本放入后可導(dǎo)致多余石蠟外涌并在蠟塊周圍形成殘蠟，且二次注蠟過程中若方向與包埋模具垂直，則可能因沖擊力較大產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致包埋質(zhì)量和切片質(zhì)量較差[9]。為有效避免上述問題，實(shí)驗(yàn)3 組首次注蠟至模具容量的2/3，以減少石蠟涌出和二次注蠟沖擊力，同時(shí)又將二次注蠟量減少至僅沒過石蠟包埋盒下緣，從而進(jìn)一步減少石蠟溢出風(fēng)險(xiǎn)。此外，實(shí)驗(yàn)3 組在二次注蠟前將模具和包埋盒傾斜25°以減少石蠟沖擊造成的包埋面下氣泡形成。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)3 組包埋合格率為96.00%，切片組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞顯示效果及網(wǎng)狀纖維完整度評(píng)分均較對(duì)照組升高，表明優(yōu)化注蠟量和注蠟方式對(duì)提升包埋質(zhì)量和切片質(zhì)量具有積極作用。

由于模具溫度、冷卻方式和注蠟方式均為石蠟包埋質(zhì)量的重要影響因素，本研究實(shí)驗(yàn)4 組對(duì)各環(huán)節(jié)同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示包埋合格率達(dá)100.00%，較實(shí)驗(yàn)1、2、3 組均進(jìn)一步提升，而包埋時(shí)間僅稍長于實(shí)驗(yàn)2 組，較對(duì)照組明顯縮短，可見該方案可有效保證包埋效率，與張睿等[10]研究結(jié)果相似。此外，本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)4 組組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞顯示效果及網(wǎng)狀纖維完整度評(píng)分均高于其他各組，表明切片質(zhì)量獲得有效提升。

綜上所述，模具溫度、冷卻方式和注蠟方式均可影響病理標(biāo)本包埋質(zhì)量，對(duì)以上因素進(jìn)行優(yōu)化可提升包埋質(zhì)量和切片評(píng)分。本研究主要局限性為未對(duì)組織樣本類型、數(shù)量和大小進(jìn)行區(qū)分和討論，且不同樣本石蠟包埋操作細(xì)節(jié)差異較大，不同組織樣本對(duì)模具溫度、冷卻方式和注蠟方式的要求可能不同，后續(xù)將沿此方向開展深入研究，以不斷完善各類型組織石蠟包埋操作規(guī)范。