昝志芳，土增榮，王淇蓉，段毓，劉建兵，李莉*

1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室，山西太原 030001；2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，山西太原 030001

多 囊 卵 巢 綜 合 征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女常見的內(nèi)分泌及代謝疾病[1‐3]，全球患病率為4%～18%[4‐5]，我國的患病率約為5.6%[6]，占無排卵性不孕癥的75%[7]，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。PCOS臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、無排卵性不孕、肥胖、痤瘡和多毛等[8‐9]。遠(yuǎn)期并發(fā)癥有代謝性疾病、子宮內(nèi)膜癌、糖尿病、高血壓及不良的妊娠結(jié)局等[9‐10]，嚴(yán)重危害女性的生活質(zhì)量和生育能力，是生殖領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)之一[11]。目前普遍認(rèn)為，PCOS的發(fā)生與遺傳、環(huán)境、生活習(xí)慣及心理健康等密切相關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制及影響因素至今尚未完全闡明、診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一[12]，因此，進(jìn)一步探討PCOS的易感基因及多態(tài)性對于更好地了解該疾病具有重要意義。PCOS的臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體紊亂的激素水平密切相關(guān)[13]，肥胖也會增加特定妊娠和分娩并發(fā)癥的風(fēng)險[14]。越來越多的證據(jù)表明，PCOS是一種多基因復(fù)雜病[15‐16]，而卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)基因異常在PCOS 發(fā)病中扮演了重要角色。FSHR基因的rs2268361和rs2349415是與PCOS具有顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)[17]，目前國內(nèi)外已針對FSHR基因SNP位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了廣泛研究，但結(jié)論存在一些矛盾[18]，主要體現(xiàn)在FSHR基因多態(tài)性與PCOS是否具有相關(guān)性及其機(jī)制方面。本研究通過分析PCOS 患者與健康對照者的外周血及卵泡液、檢測體重指數(shù)(body mass index，BMI)及血清性激素指標(biāo)，探究FSHR基因rs2268361 和rs2349415 位點(diǎn)的多態(tài)性分布，以及該基因不同基因型個體卵巢顆粒細(xì)胞中FSHRmRNA 的表達(dá)水平及其與PCOS 發(fā)病的關(guān)系，以期為PCOS 的早期診斷及治療提供相關(guān)分子標(biāo)志。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究為病例對照研究。選擇2021年3—8月在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科診治的213 例PCOS 患者作為PCOS 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)PCOS 診斷符合2003 年《鹿特丹共識》[19]；(2)年齡20～40 歲女性；(3)非妊娠育齡期；(4)近3 個月內(nèi)未服用過影響激素變化的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)[20]：(1)其他原因?qū)е碌母咝奂に乇憩F(xiàn)或月經(jīng)異常；(2)臨床確診為高泌乳素血癥、甲狀腺功能障礙、糖尿病等疾??；(3)嚴(yán)重臟器功能不全、惡性腫瘤等疾病；(4)伴有子宮疾病、反復(fù)流產(chǎn)、染色體異常等。同期納入同一醫(yī)院中身體健康、由于輸卵管因素或男方因素來院檢查的207名健康非PCOS女性作為對照組。采用隨機(jī)號碼表法(即利用隨機(jī)號碼表抽取樣本的方法)從上述PCOS 組與對照組中隨機(jī)收集實(shí)施體外受精‐胚胎移植者的卵泡液各32例(選擇取卵日穿刺的第1個直徑≥16 mm 的卵泡，盡量減少卵泡液中混入血液，拾卵后收集廢棄的卵泡液)，比較兩組FSHRmRNA相對表達(dá)量。本研究已獲山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批(批準(zhǔn)號：2021GLL87)，所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 指標(biāo)檢測與外周血DNA提取 測量所有受試者的身高、體重，計(jì)算BMI。所有受試者于月經(jīng)周期第2～5 天(月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)者在B 超檢查無優(yōu)勢卵泡時)，清晨空腹靜息10 min后采集外周靜脈血。非抗凝管采血5 ml，EDTA 抗凝管采血2 ml。非抗凝血于30 min 內(nèi)4000 r/min 離心10 min，取上清液，采用免疫化學(xué)發(fā)光全自動生化分析儀及配套試劑盒(日本東曹株式會社)檢測血清性激素六項(xiàng)[卵泡刺激素(follicle stimulating hormone， FSH)、 黃 體 生 成 素(luteinizing hormone，LH)、雌 二 醇(estradiol，E2)、睪酮(testosterone，T)、孕酮(progesterone，P)、泌乳素(prolactin，PRL)]的水平。抗凝血采集后放置于4 ℃冰箱保存，并在3 d內(nèi)采用全血DNA提取試劑盒(美國OMEGA 公司)抽提全血DNA，利用微量核酸測定儀測定樣本濃度與純度，選擇吸光度值A(chǔ)260/A280比 值 為1.8～2.1，A260/A230＞1.5 的DNA 樣 本，置 于-20 ℃低溫冰箱備用。

1.2.2 DNA擴(kuò)增與基因分型 利用Primer 5.0軟件和NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行FSHR基因SNP 位點(diǎn)rs2268361 和rs2349415 的引物設(shè)計(jì)。引物序列：rs2268361，上游5'‐TGGCTTTGATGCTGTGAGAC‐3'，下游5'‐CAACA‐TCCACCAATGAAAGATC‐3'；rs2349415，上游5'‐AA‐ACTTTATTCATAAAAACAGGTG‐3'，下游5'‐ATCTA‐GGACAGTGTCACTGAACTAC‐3'。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA：10 μl 的PCR 反應(yīng)體系中2×TaqMaster Mix 5 μl，模 板DNA 1 μl，上下 游 引物(10 μmol/L)各0.1 μl，高低溫內(nèi)標(biāo)MIX 0.2 μl，LC Green 0.8 μl，去離子水2.8 μl補(bǔ)充至10 μl；熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 7 s，循環(huán)35 次；72 ℃ 7 min，95 ℃ 30 s，25 ℃ 2 min，94 ℃30 s，24 ℃ 4 min。使用高分辨熔解曲線分析(HRM)系統(tǒng)(美國Idaho Technology 公司)進(jìn)行基因分型，所有結(jié)果均經(jīng)雙人核對并對有疑問的樣本進(jìn)行測序驗(yàn)證。為保證準(zhǔn)確的基因分型結(jié)果，每個SNP 位點(diǎn)的基因型隨機(jī)選擇3 個樣本，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序由北京華大基因科技有限公司完成。

1.2.3 外周血總RNA提取與實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT‐PCR) Trizol 法提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性及是否存在污染，利用微量核酸測定儀測定樣本濃度和純度，選擇吸光度值A(chǔ)260/A280比值在1.8～2.1，A260/A230＞1.5 的RNA 樣本，置于-80 ℃低溫冰箱保存，檢測合格的樣本采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa 公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。FSHR基因引物序列：上游5'‐GTGCATTCAATGGAACCCAAC‐TAGA‐3'， 下 游5'‐TCCGTGGAAAACATCATTAGGC‐3'。用SYBR Green? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行qRT‐PCR 反應(yīng)，每個樣本設(shè)置3 個復(fù)孔。采用實(shí)時定量PCR 儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)檢測FSHRmRNA的表達(dá)水平。用內(nèi)參β-actin、目的基因FSHR基因相對拷貝數(shù)，計(jì)算2-ΔΔCt，比較PCOS組與對照組FSHR基因mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 卵巢顆粒細(xì)胞總RNA 提取與qRT‐PCR 收集受試者取卵日穿刺的第1個直徑≥16 mm的卵泡(盡量減少血液混入)，并將卵泡液混勻后置于15 ml 離心管中，1500 r/min離心10 min，將紅細(xì)胞層上方的白色絮狀物吸出，置于1.5 ml EP 管中，添加紅細(xì)胞裂解液500 μl，充分震蕩，冰上靜置5 min。加1 ml PBS重懸沉淀，1500 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2～3次至沉淀為白色。使用Trizol法提取卵泡液中顆粒細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT‐PCR 反應(yīng)，并計(jì)算FSHR基因mRNA相對表達(dá)量。

1.3 指標(biāo)分析 比較兩組間各臨床指標(biāo)的差異，并分析各指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系；比較兩組FSHR基因rs2268361和rs2349415位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布；在探究單一變量與PCOS 發(fā)病的關(guān)系時，因無法消除其余指標(biāo)對PCOS 發(fā)病的影響，本研究以年齡、BMI、E2、P、PRL、LH、FSH、LH/FSH為自變量，以是否發(fā)生PCOS 為因變量，構(gòu)建多因素logistic回歸方程分析性激素、BMI、SNPs與PCOS發(fā)生的相關(guān)性；采用qRT‐PCR 檢測PCOS 組與對照組外周血和部分受試者卵泡液中卵巢顆粒細(xì)胞中FSHRmRNA 水平，探究rs2349415 位點(diǎn)不同基因型是否影響FSHRmRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 和R 語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素logistic回歸分析PCOS發(fā)生易感的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床指標(biāo)間的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，LH 與LH/FSH 呈明顯正相關(guān)(r=0.88，P＜0.05)，F(xiàn)SH 與LH/FSH 呈弱負(fù)相關(guān)(r=-0.30，P＜0.05)；其他指標(biāo)之間兩兩相關(guān)系數(shù)均較低(中位數(shù)0.06)，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各指標(biāo)間相互獨(dú)立(圖1)。

圖1 臨床指標(biāo)間散點(diǎn)圖及其Pearson相關(guān)系數(shù)Fig.1 Scatter diagram of clinical indicators and Pearson correlation coefficient

2.2 兩組臨床指標(biāo)比較 PCOS 組體重、BMI、E2、LH、T 及LH/FSH 均明顯高于對照組(P＜0.05)，而FSH 水平明顯低于對照組(P＜0.001)；兩組年齡、身高、PRL、P 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表1 PCOS組與對照組臨床指標(biāo)比較(x±s)Tab.1 Comparison of clinical indicators between the PCOS and control groups (x±s)

2.3 兩組FSHRSNP 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較 HRM 檢測結(jié)果顯示，對照組FSHR基因rs2268361 和rs2349415 多態(tài)性位點(diǎn)符合Hardy‐Weinburg 平 衡。PCOS 組 與 對 照 組rs2268361 位 點(diǎn) 的CC、CT、TT 3種基因型頻率及C、T等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；兩組rs2349415 位點(diǎn)的CC、CT、TT 基因型頻率(χ2=7.529，P=0.023)及C、T 等位基因頻率(χ2=6.044，P=0.014)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 PCOS組與對照組FSHR基因型和等位基因頻率分布比較[例(%)]Tab.2 Comparison of frequency distribution of FSHR genotypes and alleles between PCOS and control groups [n(%)]

2.4 多因素logistic回歸分析PCOS發(fā)生的相關(guān)因素多因素logistic 回歸分析顯示，高水平的BMI(OR=1.112， 95%CI 1.059～1.167)、 E2(OR=1.009， 95%CI 1.003～1.014)、LH(OR=1.178，95%CI 1.114～1.247)均 為PCOS 發(fā)生的獨(dú)立危險因素，而相對高水平的FSH(OR=0.832，95%CI 0.768～0.901)則可降低PCOS 的發(fā)生風(fēng)險(P＜0.05)；與rs2349415 位點(diǎn)CC 基因型相比，攜帶CT 基因型可增加PCOS 的發(fā)生風(fēng)險(P=0.009)；經(jīng)校正年齡、BMI后，rs2349415位點(diǎn)CT基因型仍為PCOS發(fā)生的獨(dú)立危險因素(OR=1.933，95%CI 1.275～2.932)(圖2)。

圖2 Logistic回歸分析臨床指標(biāo)和SNP位點(diǎn)比值比(OR)的森林圖Fig.2 Logistic regression analysis of odds ratio (OR) of clinical indicators and genotypes of SNP

2.5 兩組rs2349415 位點(diǎn)的多態(tài)性及FSHRmRNA 表達(dá)水平 在外周血中，F(xiàn)SHRmRNA 水平在PCOS 組與對照組間、在rs2349415 位點(diǎn)CC、CT、TT 3 個基因型間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A、B)；在卵巢顆粒細(xì)胞中，PCOS 組FSHRmRNA 水平明顯高于對照組(P=0.004)，rs2349415 位 點(diǎn) 上TT 基 因 型 的FSHRmRNA 表達(dá)水平高于CC 和CT 基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002；P=0.035；圖3C、D)。

圖3 兩組間及rs2349415位點(diǎn)不同基因型個體的外周血及卵巢顆粒細(xì)胞中的FSHR mRNA表達(dá)水平Fig.3 FSHR mRNA expression levels in peripheral blood and ovarian granulosa cells of PCOS and control groups and individuals with different genotypes at rs2349415

3 討 論

調(diào)整生活方式已逐漸被公認(rèn)為是PCOS 的一線治療方法，可緩解患者的代謝功能紊亂并改善生殖障礙[21]。在PCOS 的發(fā)生發(fā)展過程中，肥胖既是臨床特征，又參與PCOS病理機(jī)制形成的各個環(huán)節(jié)[22]。肥胖女性性激素結(jié)合球蛋白水平下降[23]，可使雄激素水平升高，進(jìn)而破壞排卵功能[24]。本研究PCOS組的BMI 明顯高于對照組，進(jìn)一步提示肥胖是導(dǎo)致PCOS易感性增高的原因之一，建議肥胖PCOS患者通過減重來達(dá)到有效的干預(yù)。PCOS組LH、LH/FSH及T水平較對照組明顯升高，而FSH水平明顯下降，與以往的研究結(jié)果基本一致[25]。雄激素為卵泡發(fā)育與成熟所必需的條件，但PCOS 患者異常增高的雄激素水平反而阻礙了優(yōu)勢卵泡的發(fā)育，雄激素過量也可能提示PCOS 的潛在易感性增加[26]。本研究中PCOS患者E2水平明顯升高，除與患者體內(nèi)雌酮(E1)明顯增多，與E2相互轉(zhuǎn)化外，也可能與PCOS 患者基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)量較多、所分泌的雌激素增加有關(guān)。LH和FSH屬于糖蛋白激素，可直接作用于卵巢，提高顆粒細(xì)胞活性進(jìn)而加速卵泡發(fā)育。PCOS患者垂體對促性腺激素釋放激素的敏感性增加，分泌過量的LH，臨床上LH/FSH≥2，可輔助診斷PCOS[27]。本研究各臨床指標(biāo)間相關(guān)性分析顯示，LH與LH/FSH 呈明顯的正相關(guān)，而FSH 與LH/FSH 呈弱負(fù)相關(guān)，提示高LH水平紊亂對于協(xié)助PCOS診斷更具敏感性。

遺傳因素在PCOS 發(fā)病中的作用越來越受到關(guān)注。最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome‐wide association studies，GWAS)發(fā)現(xiàn)了18種與PCOS明顯相關(guān)的遺傳變異[18]，包括DENND1、INSR、FSHR、LHCGR等基因或附近的變異。FSHR基因位于2p16.3，由10個外顯子和9 個內(nèi)含子組成，是促卵泡激素和性腺發(fā)育功能的受體。一項(xiàng)跨種族的Meta 分析結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR的SNP位點(diǎn)rs2268361 T等位基因和rs2349415 T等位基因增加了PCOS 的發(fā)病風(fēng)險[28]；針對泰國婦女的大多數(shù)研究并未證實(shí)FSHR多態(tài)性增加PCOS的易 感 性[28]；中 國 女 性 的GWAS‐Meta 研 究 發(fā) 現(xiàn)，rs2268361 與中國婦女PCOS 易感性明顯相關(guān)[29]；一項(xiàng)針對中國南方漢族的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢多囊樣變與非多囊樣變組間SNP 位點(diǎn)rs2268361 GG 基因型的等位基因分布存在明顯差異，而在rs2349415位點(diǎn)上則未發(fā)現(xiàn)明顯差異[30]。在本研究人群中，F(xiàn)SHR基因rs2268361 位點(diǎn)的等位基因型分別為CC、CT 和TT，PCOS 組中最小等位基因頻率C 為48.6%，該位點(diǎn)多態(tài)性與PCOS 易感性無明顯相關(guān)，與一項(xiàng)涉及中國和澳大利亞的跨種族Meta分析發(fā)現(xiàn)不一致[28]，提示可能在不同人群、種族、民族和地域間存在一定的遺傳互作；rs2349415 位點(diǎn)的等位基因組成CC、CT和TT 3 種基因型，PCOS 組中最小等位基因頻率T為27.0%，明顯高于對照組的19.8%(P=0.014)，提示在本研究人群中，rs2349415‐T 等位基因增加了PCOS的發(fā)病風(fēng)險。

FSHR主要由卵巢顆粒細(xì)胞分泌，顆粒細(xì)胞在原始卵泡的啟動和生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組外周血中FSHRmRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在卵巢顆粒細(xì)胞中PCOS 組FSHRmRNA 表達(dá)水平明顯高于對照組(P=0.014)。此外，本研究檢測了rs2349415位點(diǎn)不同基因型個體卵巢顆粒細(xì)胞中FSHRmRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TT 基因型個體FSHRmRNA 表達(dá)水平高于CC 和CT基因型，提示不同的基因型可影響FSHR的表達(dá)。FSHR基因的多態(tài)性一方面影響PCOS 的易感性，另一方面也影響了促排卵治療時FSHR 對外源性FSH的敏感性[18]，F(xiàn)SH‐FSHR相互作用可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞分化及卵泡成熟[32‐33]，可能影響PCOS的發(fā)生，因此，在輔助生殖促排卵用藥中，有望依據(jù)患者FSHR基因rs2349415位點(diǎn)不同基因型使用不同劑量的外源性FSH，從而指導(dǎo)臨床用藥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，高水平的BMI、E2、LH 以及rs2349415 T 等位基因是PCOS 發(fā)生的危險因素，不同的基因型可影響卵巢顆粒細(xì)胞FSHRmRNA的表達(dá)，為PCOS 的早期篩查與治療提供了潛在分子標(biāo)志，對闡明PCOS 的發(fā)病機(jī)制，以及早期識別與管理提供理論基礎(chǔ)。本研究仍存在局限性：納入的樣本量偏小，且為單一的醫(yī)療中心。但是本研究為PCOS 的早期篩查提供了一定的科學(xué)依據(jù)，未來應(yīng)聯(lián)合多中心以擴(kuò)大樣本量及地域范圍，以期獲得更全面的研究結(jié)果，對PCOS 患者乃至整個家庭及社會均有重要意義。