黃叢改，劉 清，鄭樹濤，劉 濤，譚依依，彭天元，陳 嬌，盧曉梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011)

食管癌是全球發(fā)病率排位第8 和死亡率排位第6的惡性腫瘤，其中我國(guó)的發(fā)病率和死亡率最高[1]。在我國(guó)，食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占總食管癌病例的90%以上。盡管ESCC多模式治療取得了重大進(jìn)展，但晚期ESCC患者的5年生存率仍低于20%[2]。目前，食管癌的治療仍與腫瘤分期、分型及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。CXC 受體2(CXC receptor 2，CXCR2)編碼基因位于染色體2q33-q36，屬于7 次跨膜的G 蛋白(G protein-coupled receptors，GPCR)偶聯(lián)受體家族。CXCR2 在腫瘤微環(huán)境中的作用越來越得到重視，研究發(fā)現(xiàn)CXCR2參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療過程[4]。目前，CXCR2 拮抗劑SCH527123 在食管癌治療方面的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ESCC 組織及癌旁正常食管組織中CXCR2 的表達(dá)水平，分析CXCR2 表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系，并檢測(cè)CXCR2 拮抗劑SCH527123 對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為探索CXCR2 作為ESCC 的分子預(yù)測(cè)和靶向治療分子標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本與細(xì)胞系

選取經(jīng)組織病理學(xué)確診手術(shù)切除的ESCC 組織74例作為研究組，患者術(shù)前均未行放療或化療；選取配對(duì)距離ESCC組織邊緣5 cm以上的正常食管組織74例作為對(duì)照組。ESCC 患者中男性66 例，女性8 例；年齡43～90歲，中位年齡63歲；腫瘤部位上、中、下段分別為2、23 和49 例；腫瘤大體分型縮窄型3 例、蕈傘型7 例、髓質(zhì)型13 例、潰瘍型51 例；腫瘤直徑≤5 cm 者68 例，＞5 cm 者6 例；病理分級(jí)高分化者25 例、中-低分化者49 例；浸潤(rùn)深度達(dá)黏膜下層者8 例、肌層15 例、外膜51 例；發(fā)生脈管瘤栓者24 例；神經(jīng)侵犯者12例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者51例。

本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY2022274)，患者或其家屬知情同意。人食管癌細(xì)胞系KYSE30 購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，且經(jīng)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)測(cè)序，證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)一抗CXCR2 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D 公司，將一抗CXCR2(MAB331-100)按1∶100 標(biāo)準(zhǔn)化稀釋。通用二抗試劑及DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。PRMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，CXCR2 拮抗劑SCH527123購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ApexBio公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CXCR2 在食管癌組織中的表達(dá)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用EnVision 法檢測(cè)74 例ESCC 及相應(yīng)癌旁正常食管組織中CXCR2 的表達(dá)。用檸檬酸緩沖液(pH=6.0)高壓修復(fù)抗原。使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，預(yù)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行免疫組織化學(xué)綜合評(píng)分，結(jié)果由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家完成獨(dú)立評(píng)價(jià)。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分為：無著色計(jì)0分，黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分為：腫瘤細(xì)胞無陽(yáng)性顯色為0 分，陽(yáng)性顯色≤10%為1 分，陽(yáng)性顯色＞10%～50%為2 分，陽(yáng)性顯色＞50%～80%為3 分，陽(yáng)性顯色＞80%為4 分。將細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分相乘，總分＜4分判讀為CXCR2低表達(dá)，反之為高表達(dá)。

1.3.2 CCK-8 法及平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞的增殖本實(shí)驗(yàn)分為兩組，常規(guī)PRMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞為對(duì)照組，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了CXCR2 拮抗劑SCH527123(10 mmol/mL)的食管癌細(xì)胞為觀察組。將食管癌細(xì)胞KYSE30 每孔1 500 個(gè)細(xì)胞(100 μL)接種于96孔板中，培養(yǎng)于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，其中，觀察組添加含有10 mmol/mL 的CXCR2 拮抗劑0.2 μL(根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果濃度)，分別于SCH527123作用細(xì)胞24、48、72、96 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔新加入90 μL PRMI-1640 培養(yǎng)基+10 μL CCK-8 溶液，避光、混勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中靜置2 h 后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

平板集落形成實(shí)驗(yàn)中，正常培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞為對(duì)照組，培養(yǎng)基中添加了CXCR2拮抗劑SCH527123的食管癌細(xì)胞為觀察組，6孔板中每孔1 000個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔2 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜后，觀察組添加拮抗劑SCH527123 每孔2 μL，放入培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿底部有可見的細(xì)胞集落時(shí)，終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。將6孔板置于白紙上拍照，使用ImageJ軟件對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)及定量分析。

1.3.3 Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell 小室放入24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。上室為無血清培養(yǎng)基200 μL，接種1×105個(gè)KYSE30細(xì)胞；下室為含血清培養(yǎng)液600 μL，添加10 mmol/mL 的SCH527123 0.6 μL。作用36 h后染色、拍照及統(tǒng)計(jì)。同時(shí)設(shè)常規(guī)培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞為對(duì)照組。侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。各組計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示；組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's 精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用ImageJ 軟件、GraphPad Prism 8 軟件對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CXCR2在ESCC組織中的表達(dá)

CXCR2 在研究組ESCC 組織及對(duì)照組癌旁正常食管組織的表達(dá)情況見圖1。CXCR2 棕黃色顆粒主要表達(dá)在細(xì)胞漿，部分在細(xì)胞膜。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組的CXCR2 高表達(dá)細(xì)胞占13.5%(10/74)，而研究組CXCR2 高表達(dá)細(xì)胞占73.0%(54/74)，較對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.298，P=0.000)，見表1。

表1 CXCR2在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)食管鱗癌組織CXCR2的表達(dá)

2.2 CXCR2表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

食管鱗癌組織中CXCR2 的表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大體分型、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、脈管瘤栓及神經(jīng)侵犯均無顯著相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)，但與ESCC的病理分級(jí)(χ2=5.515，P=0.019)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=7.320，P=0.007)間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 食管鱗癌組織中CXCR2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 抑制CXCR2表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響

相較于對(duì)照組，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，添加CXCR2拮抗劑SCH527123后顯著抑制了KYSE30食管癌細(xì)胞的增殖(圖2)。

圖2 CXCR2拮抗劑SCH527123對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 抑制CXCR2 表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與對(duì)照組比較，添加CXCR2 拮抗劑SCH527123后，KYSE30 細(xì)胞遷移數(shù)量較對(duì)照組明顯減少。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，抑制CXCR2的表達(dá)可明顯抑制食管癌細(xì)胞KYSE30 的遷移能力(P＜0.01，圖3)。將Transwell小室上室鋪Matrigel 基質(zhì)膠，進(jìn)一步檢測(cè)了CXCR2 拮抗劑SCH527123對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加了拮抗劑的觀察組食管癌細(xì)胞KYSE30 侵襲能力明顯低于對(duì)照組(P＜0.01，圖4)。

圖3 CXCR2拮抗劑SCH527123對(duì)食管癌細(xì)胞遷移能力的影響

圖4 CXCR2拮抗劑SCH527123對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討 論

CXCR2 是G 蛋白偶聯(lián)受體，能夠促進(jìn)血管生成[5]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可通過自分泌方式分泌趨化因子與CXCR2 結(jié)合，或以旁分泌方式結(jié)合CXCR2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；CXCR2還可激活基質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和免疫逃逸[6]，提示腫瘤細(xì)胞在CXCR2的作用下實(shí)現(xiàn)了自身的增殖和轉(zhuǎn)移。而Wu等[7]研究發(fā)現(xiàn)沉默CXCR2顯著降低了食管癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)，并通過ERK1/2 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來預(yù)防食管癌[7]。

本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中CXCR2的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁正常食管組織，表明CXCR2在食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其可能具有癌基因的功能；且CXCR2的高表達(dá)與食管鱗癌分化程度差和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，即食管癌患者腫瘤分化越差、淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)CXCR2表達(dá)越高，預(yù)示食管鱗癌不良預(yù)后。既往研究[8]表明CXCR2 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，是ESCC 切除后的不良預(yù)后因素；CXCR2 表達(dá)陽(yáng)性的食管癌患者5 年生存率和預(yù)期生存時(shí)間顯著低于陰性者[9]；ESCC 組織中CXCR2 呈高水平表達(dá)且與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[10]；術(shù)后出現(xiàn)并發(fā)癥的CXCR2呈陽(yáng)性表達(dá)的食管癌患者預(yù)后較差[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前研究報(bào)道一致。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，表明CXCR2 在食管癌組織中高表達(dá)，CXCR2陽(yáng)性表達(dá)促進(jìn)食管癌的遷移和侵襲，預(yù)后不良。

SCH527123 是一種有效的、變構(gòu)的口服活性CXCR2 拮抗劑[12]。關(guān)于SCH527123 在腫瘤中的作用已有相關(guān)報(bào)道。研究[13]顯示，口服SCH527123 選擇性靶向CXCR2 是抑制黑色素瘤生長(zhǎng)和血管生成的一種有前景的治療方法；SCH527123 還可抑制卵巢腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，下調(diào)STAT3 和AKT 磷酸化以及survivin表達(dá)[14]。CXCR2 拮抗劑SCH527123 通過抑制IL-8/CXCR1/2 信號(hào)通路可降低人胰腺癌細(xì)胞的惡性特征[15]，并能抑制結(jié)直腸癌的增殖以及能增強(qiáng)體內(nèi)外結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑敏感性[16]。

但目前，關(guān)于SCH527123在食管癌中的作用尚未見報(bào)道。于是，本文進(jìn)一步用CXCR2 拮抗劑SCH527123作用于食管癌細(xì)胞KYSE30，觀察CXCR2 的表達(dá)被拮抗后食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為變化。結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，SCH527123 可顯著抑制KYSE30 食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

已知CXCR2 配體有7 個(gè)趨化因子：CXCL1/2/3、CXCL5/6/7/8。有報(bào)道提示CXCLs/CXCR2 軸可能通過維持和促進(jìn)癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的遷移在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，這些CSCs周圍的內(nèi)皮細(xì)胞不僅可以分泌CXCLs，還可上調(diào)CSCs中CXCR2的表達(dá)，從而增強(qiáng)CSCs的遷移和生長(zhǎng)[17]。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，目前關(guān)于CXCLs/CXCR2 在食管癌中的研究報(bào)道不多。Yang等[18]的研究表明直接干擾腫瘤細(xì)胞源性CXCL1 或抑制CXCL1/CXCR2 通路可有效恢復(fù)食管癌患者體內(nèi)放射耐藥異種移植物的放射敏感性，CXCL1 通過CXCR2-STAT3 通路進(jìn)一步激活癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞來驅(qū)動(dòng)食管癌放射耐藥。CXCL8/CXCR2或IL-8/CXCR2表達(dá)升高與ESCC患者的腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后相關(guān)[19-20]。目前，CXCR2 參與食管癌患者預(yù)后的確切機(jī)制尚不完全清楚，需要深入探究，另外用動(dòng)物模型驗(yàn)證CXCR2拮抗劑的作用也將是我們下一步的工作計(jì)劃。

總之，本研究結(jié)果顯示食管鱗癌組織中CXCR2表達(dá)水平上調(diào)，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。CXCR2的拮抗劑SCH527123 可顯著抑制食管癌細(xì)胞KYSE30 的增殖、遷移和侵襲，推測(cè)CXCR2可能為食管鱗癌潛在的預(yù)測(cè)和靶向治療的分子標(biāo)志物。