劉 菲, 范孝俊, 王 瑩, 李迎澳, 張曉林, 嚴(yán)小軍, 廖 智

(浙江海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,海洋生物資源與分子工程實(shí)驗(yàn)室, 浙江 舟山 316022)

隨著人類生產(chǎn)活動(dòng)中化石燃料消耗的急劇增加,越來(lái)越多的二氧化碳排放導(dǎo)致了海洋酸化(ocean acidification)現(xiàn)象的產(chǎn)生。海洋酸化導(dǎo)致了海水中碳酸根離子濃度下降,氫質(zhì)子濃度上升,同時(shí)也導(dǎo)致海水中碳酸鈣分子飽和度下降,因此,海洋酸化對(duì)以碳酸鈣為其鈣化組織的海洋礦化生物產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。目前已知海洋酸化對(duì)珊瑚、藤壺、貝類以及部分藻類等海洋生物的生物礦化過(guò)程產(chǎn)生抑制作用,也由此對(duì)上述海洋生物的繁殖、發(fā)育、以及生長(zhǎng)過(guò)程造成影響,最終導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)問(wèn)題[1]。貝類因其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而成為目前海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要物種,因此,海洋酸化對(duì)貝類及其養(yǎng)殖業(yè)的影響日益受到重視,海洋酸化對(duì)貝類的影響相關(guān)研究也已較為深入。已有的研究表明,海洋酸化對(duì)貝類貝殼的形成、發(fā)育以及力學(xué)性能具有不利影響[2],特別是對(duì)貝類幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中,貝殼形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)產(chǎn)生抑制而造成貝類幼蟲(chóng)發(fā)育遲緩甚至大規(guī)模死亡的現(xiàn)象[3]。進(jìn)一步的研究表明,海洋酸化通常會(huì)導(dǎo)致貝類貝殼形成相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化。例如,酸化會(huì)導(dǎo)致太平洋牡蠣(Crassostreagigas)貝殼基質(zhì)蛋白質(zhì)(shell matrix proteins,SMPs)的表達(dá)出現(xiàn)異常,并導(dǎo)致貝殼發(fā)育的延遲[4];酸化也會(huì)導(dǎo)致馬氏珠母貝(Pinctadafucata)鈣結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)異常,并導(dǎo)致貝殼鈣化速率下降[5];此外,酸化還會(huì)導(dǎo)致藍(lán)貽貝(Mytilusedulis)外套膜中幾丁質(zhì)酶以及鈣結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)量下降[6]?？梢?jiàn),海洋酸化對(duì)貝類生物礦化的影響的可能機(jī)制在于酸化對(duì)貝殼形成過(guò)程中的相關(guān)調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生干擾,從而抑制了貝殼的形成與發(fā)育。此外,海洋酸化還會(huì)導(dǎo)致貝類出現(xiàn)新陳代謝異常,例如能量代謝抑制,細(xì)胞膜極化的影響等,從而間接對(duì)貝殼形成過(guò)程中的能量消耗產(chǎn)生了影響[7-9]。

值得關(guān)注的是,貽貝屬貝類在前期研究中表現(xiàn)出對(duì)海洋酸化的耐受性。例如,Thomsen等人很早即觀察到貽貝Mytilus edulis在食物供應(yīng)充分的情況下,可以有效對(duì)抗海洋酸化的影響,并在部分高二氧化碳濃度的海域發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)物種[10];此后,Fitzer等人發(fā)現(xiàn)貽貝屬在酸化條件下,仍能維持其貝殼的生物礦化過(guò)程,盡管付出了貝殼形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的代價(jià)[1];Matoo等人的研究進(jìn)一步表明,貽貝通過(guò)調(diào)節(jié)其能量供應(yīng)及代謝過(guò)程來(lái)對(duì)抗海洋酸化對(duì)其不利影響,從而表現(xiàn)出對(duì)海洋酸化的耐受性[11]。此外,貽貝屬在酸化條件下,能通過(guò)增強(qiáng)代謝過(guò)程中內(nèi)源性碳酸根離子的吸收,從而維持其貝殼中方解石型和文石型碳酸鈣晶體的形成[12]。由此可見(jiàn),貽貝屬在海洋酸化大背景下,可能有其特殊的分子機(jī)制來(lái)維持其貝殼的生物礦化過(guò)程以適應(yīng)環(huán)境pH的下降。

生物礦化是貝類通過(guò)貝殼基質(zhì)蛋白質(zhì)(shell matrix protein, SMP)調(diào)控碳酸根離子和鈣離子形成碳酸鈣晶體,并進(jìn)一步形成貝殼的過(guò)程。在這一過(guò)程中,碳酸根離子的來(lái)源可分為外源性和內(nèi)源性兩種;其中,外源性碳酸根離子主要來(lái)自于海水中的無(wú)機(jī)碳,而內(nèi)源性碳酸根離子主要來(lái)自于貝類代謝過(guò)程中所產(chǎn)生。Lu等人發(fā)現(xiàn),海洋酸化會(huì)導(dǎo)致貽貝貝殼中外源性無(wú)機(jī)碳含量的下降[13]。而Zhao等人的研究表明,海洋酸化條件下,貝類會(huì)通過(guò)增強(qiáng)其內(nèi)源性碳酸根離子參與貝殼形成的過(guò)程[14]。由此可見(jiàn),對(duì)貝類而言,內(nèi)源性碳酸根離子對(duì)其貝殼形成具有重要作用,也因此可能成為其對(duì)抗海洋酸化對(duì)貝殼形成的不利影響的主要機(jī)制。貝類可通過(guò)多種代謝機(jī)制產(chǎn)生內(nèi)源性碳酸根,例如呼吸作用[15]以及尿素降解[16]等。但目前對(duì)于貝類依賴何種途徑產(chǎn)生的內(nèi)源性碳酸根離子參與貝殼的生物礦化尚無(wú)明確結(jié)論。值得關(guān)注的是,前期研究已發(fā)現(xiàn),尿素在脲酶降解下所產(chǎn)生的碳酸根離子在部分微生物中參與了生物礦化過(guò)程[17, 18];此外,厚殼貽貝中也已發(fā)現(xiàn)酸化會(huì)導(dǎo)致其脲酶表達(dá)量上調(diào)[19],且穩(wěn)定同位素分析表明,尿素可參與其貝殼碳酸鈣的形成[20]。為此,我們推測(cè),尿素及其降解產(chǎn)物可能在貽貝對(duì)海洋酸化的耐受過(guò)程中具有重要作用。為進(jìn)一步研究尿素對(duì)貽貝在海洋酸化條件下的分子響應(yīng)過(guò)程的影響,采用轉(zhuǎn)錄物組學(xué)技術(shù),對(duì)厚殼貽貝外套膜在正常海水以及酸化海水條件下開(kāi)展高通量測(cè)序,以探討貽貝在海洋酸化過(guò)程中,尿素的添加所造成的生理響應(yīng)以及貽貝應(yīng)對(duì)海洋酸化的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝的采集與處理

將采集自浙江舟山嵊泗海域的成年厚殼貽貝(長(zhǎng)度70 ～ 80 mm),以潔凈天然海水(pH 8.1,鹽度25 ‰)在22 ℃恒溫水族箱中暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)后的貽貝隨機(jī)分為3組,每組18只貽貝個(gè)體。第1組養(yǎng)殖于天然海水(pH 8.1),命名為CN(complete-shell in normal seawater )組,第2組養(yǎng)殖于酸化海水(pH 7.4),命名為CA(complete-shell in acidified seawater)組,第3組經(jīng)后閉殼肌注射尿素(1 mg/mL,注射體積20 μL)后養(yǎng)殖于酸化海水(pH 7.4),命名為CAU (complete-shell in acidified seawater with urea injection)組。第1組和第2組貽貝在后閉殼肌注射20 μL無(wú)菌海水為對(duì)照。上述3組貽貝注射后養(yǎng)殖時(shí)間均為48 h。酸化海水pH值采用海水酸化儀(Starfish SF0S02, 中國(guó)青島)自帶的pH計(jì)進(jìn)行測(cè)量,并利用偶聯(lián)的CO2泵通過(guò)控制CO2氣體流量進(jìn)行pH值調(diào)節(jié);所有貽貝在飼養(yǎng)期間均以螺旋藻粉進(jìn)行定時(shí)投喂。

1.2 RNA提取與測(cè)序

取上述3組貽貝,分別收集其外套膜組織。經(jīng)液氮研磨后采用Trizol法提取總RNA;采用分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)對(duì)所提RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè),并以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性,Agilent 2100測(cè)定總RNA的RIN值。采用帶有Oligo(dT)的磁珠從總RNA中分離富集出mRNA;再對(duì)所富集的mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷,獲得片段化的mRNA(長(zhǎng)度約300 nt);對(duì)片段化的mRNA采用六堿基隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得雙鏈cDNA后,對(duì)其進(jìn)行末端補(bǔ)平并添加接頭堿基;之后對(duì)所得雙鏈cDNA進(jìn)行富集和定量處理,進(jìn)行cBot橋式PCR擴(kuò)增,生成clusters后利用Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)(上海美吉公司)對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

采用軟件SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle (https://github.com/najoshi/sickle)對(duì)Illumina測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪,去除接頭和低質(zhì)量的閱讀子(reads);采用RSeQC (版本v2.3.6)進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控分析。參照文獻(xiàn)方法[21],將測(cè)序數(shù)據(jù)與厚殼貽貝參考基因組(數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào):PRINA578350)進(jìn)行比對(duì);參照文獻(xiàn)方法[22],進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物組序列組裝。組裝后的轉(zhuǎn)錄本序列經(jīng)BLASTX比對(duì),分別注釋于非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Non-Redundant protein databank, NR)、基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology,GO)、京都基因百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)、蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(Cluster of Orthologous Group,COG)、SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(PFAM),以HMMER為默認(rèn)參數(shù),E值小于1.0e～5作為閾值。

利用Bowtie 程序[23]將高質(zhì)量干凈閱讀子(clean reads)映射到組裝的轉(zhuǎn)錄本。為鑒定不同樣本組間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs) ,根據(jù)每百萬(wàn)讀數(shù)(Transcripts Per Million,TPM)法計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量水平。使用 RSEM軟件 (http://deweylab.biostat.wisc.edu/RSEM/)來(lái)量化基因豐度[24]。DEGs采用軟件DESeq2[25]進(jìn)行篩選,篩選條件為∣ log2FC ∣ >1且q值≤0.05。此外,分別采用軟件Goatools (https://github.com/tanghaibao/Goatools)和 KOBAS (http://KOBAS.cbi.pku.edu.cn/home.do)[26]進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和 KEGG 功能富集分析。同時(shí),對(duì)組間DEGs開(kāi)展基因集富集(gene set enrichment analysis,GSEA)分析,以便盡量準(zhǔn)確地反映基因集在不同組間的功能注釋差異。

1.4 轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)的熒光定量PCR驗(yàn)證

對(duì)上述3組樣本的轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序數(shù)據(jù)中兩組間比較獲得的DEGs進(jìn)行隨機(jī)選擇,共選擇10條開(kāi)展熒光定量PCR(quantitative-real-time-PCR,qRT-PCR)驗(yàn)證,以判斷在轉(zhuǎn)錄物組分析中的DEGs的可信度。根據(jù)所選DEGs的序列設(shè)計(jì)特異性引物(Table1),利用上述轉(zhuǎn)錄物組分析所用的原始厚殼貽貝外套膜組織的轉(zhuǎn)錄物組樣本為模板,采用SYBR Green 熒光定量 PCR 試劑盒(Takara)和ABI 7500熒光定量PCR 系統(tǒng)(ABI 7500 Real Time PCR System,Applied Biosystems)。qPCR實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置為95℃ 15 s,60℃ 30 s,循環(huán)40次。在 PCR 循環(huán)結(jié)束時(shí),進(jìn)行熔解曲線分析以確定擴(kuò)增反應(yīng)的特異性,并以18S-RNA 作為內(nèi)參?；虮磉_(dá)量用2-ΔΔct方法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 貽貝外套膜組織的顯微觀察

取上述3組貽貝的外套膜組織,經(jīng)4%多聚甲醛固定,再經(jīng)石蠟包埋,使用切片機(jī)(HistoCore BIOCUT, Leica)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm;切片使用乙醇進(jìn)行梯度脫水和復(fù)水操作;采用Hematoxylin and eosin (H&E)染色技術(shù)對(duì)切片進(jìn)行染色;染色后的切片使用光學(xué)顯微鏡(ECLIPSE E100, NIKON, Japan)進(jìn)行觀察,重點(diǎn)觀察外套膜外褶皺部位的表皮細(xì)胞層。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分析數(shù)據(jù)以平均值±方差 (mean ±SD)記錄,采用3次平行試驗(yàn)。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA);采用最小顯著差數(shù)法(Least Significant Difference,LSD)進(jìn)行相關(guān)顯著性檢測(cè);以P<0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

Table 1 Primers used for qRT-PCR to verify the differentially expressed transcripts from transcriptomic data

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝外套膜轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序質(zhì)量較高

針對(duì)3組厚殼貽貝外套膜共9個(gè)平行樣本構(gòu)建了9個(gè)cDNA測(cè)序文庫(kù)。經(jīng)Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)測(cè)序,總計(jì)獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)62.82 Gb,平均每個(gè)樣本6.98 Gb;經(jīng)去除低質(zhì)量序列和接頭序列,各文庫(kù)測(cè)序所得干凈閱讀子(clean reads)總計(jì)407227922條,錯(cuò)誤率低于0.03%,Q30值均大于91.5%,Q20值均大于96.9%(Table 2)。以上數(shù)據(jù)表明,測(cè)序質(zhì)量符合后續(xù)分析要求。

進(jìn)一步將測(cè)序所得干凈閱讀子定位到厚殼貽貝基因組,9個(gè)樣本的總比對(duì)率為21.32% ～ 63.21%,唯一比對(duì)率為29.72% ～ 60.08%。在此基礎(chǔ)上對(duì)閱讀子進(jìn)行組裝,以厚殼貽貝基因組為參考基因組,經(jīng)Trinity軟件組裝,共產(chǎn)生86 924個(gè)轉(zhuǎn)錄本,歸屬于44 898條單一基因(unigene)。所有組裝好的轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度分布正如Fig.1A所示,其中,長(zhǎng)度大于1 800 bp的轉(zhuǎn)錄本所占比例最大,表明組裝質(zhì)量較高。對(duì)上述86 924條轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋分析,注釋數(shù)據(jù)庫(kù)分別為GO、KEGG、COG、NR、SWISS-PROT和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù),以E值小于1×10-5為閾值,共有71 437條 (占比82.18%)轉(zhuǎn)錄本獲得注釋 (Fig.1B)。

Fig.1 The length distribution and the annotation statistics of assembled transcripts from the mantle transcriptome of M. coruscus (A) The length distribution of assembled transcripts. (B) Annotation statistics of the assembled mantle transcriptomic data

2.2 不同組間厚殼貽貝外套膜轉(zhuǎn)錄物組具有明顯差異

通過(guò)RESM軟件對(duì)各轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)量分析,采用TPM法計(jì)算所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量,所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量分布見(jiàn)Fig.2A。在此基礎(chǔ)上根據(jù)各組樣本的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量差異,采用PCA作圖方式對(duì)3組樣本進(jìn)行相關(guān)性分析,PCA相關(guān)性二維圖見(jiàn)Fig.2B。由圖可見(jiàn),3組樣本在圖中具有明顯分離,表明不同處理?xiàng)l件導(dǎo)致各組樣本的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量發(fā)生了明顯差異。

Fig.2 Expression distribution of transcriptome and PCA diagram from 9 mantle samples of M. coruscus (A) Expression distribution of the mantle transcriptome from nine mantle samples; (B) PCA diagramof the mantle transcriptome from nine mantle samples.CN represents the mussels with complete shells and raised in normal sea-water(pH8.1); CA represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater (pH7.4)after urea injection

Table 2 Summery of the raw RNA sequencing data from 9 mantle samples of 3 mussel groups

進(jìn)一步采用DESeq2軟件和BH(Benjamini-Hochberg)多重檢驗(yàn)校準(zhǔn)法,對(duì)3組貽貝外套膜的轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較,篩選出差異倍數(shù)大于2,且P<0.05的DEGs總計(jì)15 180條。其中,CAU 對(duì)比CN組共檢測(cè)到DEGs 2 692條,包括上調(diào)基因1 062條和下調(diào)基因1 630條;CA對(duì)比CN組檢測(cè)到DEGs 5 278條,包括上調(diào)基因2 321條和下調(diào)基因2 957條;CAU對(duì)比CA組檢測(cè)到DEGs2 691條,含上調(diào)基因1 373條以及下調(diào)基因1 318條。上述組間DEGs的火山圖見(jiàn)Fig.3。

Fig.3 Volcanomaps of differential expressed transcripts from three pairwise-comparisons of the mantle samples CN represents the mussels with complete shells and raised in normal seawater(pH8.1); CA represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater (pH7.4)after urea injection

2.3 不同組間的差異基因涉及多種生物學(xué)功能

對(duì)上述組間比較所得DEGs進(jìn)行功能注釋與富集分析。對(duì)DEGs的GO功能注釋結(jié)果表明,多數(shù)差異基因主要集中在細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、膜部分(membrane part)和結(jié)合(binding)條目(Fig.4A);對(duì)差異基因的KEGG注釋結(jié)果表明,多數(shù)差異基因主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、癌總覽(cancer: overview)、病毒感染(infectious disease: viral)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)、轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(transport and catabolism)等功能(Fig.4B)。

Fig.4 Functional annotation of differential expressed transcripts from three mantle groups of M. coruscus (A) GO functional annotation results; (B) KEGG functional annotation results

在差異基因功能注釋結(jié)果基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用軟件Goatools通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行功能富集分析。以校正后P值小于 0.05作為顯著富集依據(jù),共篩選出具有顯著GO功能富集的差異基因6 816條。其中,CA對(duì)比CN組(CAvs. CN)的差異基因有6 546條富集到GO功能112個(gè)條目,其中富集數(shù)量最多的20個(gè)GO條目列于Table 3;CAU對(duì)比CN組(CAUvs. CN)有84條差異基因富集于17個(gè)GO功能條目,CAU 對(duì)比CA組(CAUvs. CA)有186條差異基因富集于11個(gè)GO功能條目(Table 3)。

根據(jù)組間差異基因的GSEA分析結(jié)果,篩選P小于0.05且NES(normalized enrichment score)絕對(duì)值大于1的富集結(jié)果。依據(jù)NES絕對(duì)值對(duì)富集結(jié)果由高到低進(jìn)行排序,富集程度最高的10個(gè)基因集列于Table 4。由表可見(jiàn),CA組相比對(duì)照組(CN組),其差異基因集主要富集于tRNA相關(guān)代謝功能以及纖毛相關(guān)功能;而CAU組相比對(duì)照組(CN組),其差異基因集主要富集于氨基酸相關(guān),以及自噬相關(guān)條目;此外,CAU組相比CA組,其差異基因集主要富集于核酸代謝,細(xì)胞分泌和物質(zhì)運(yùn)輸,rRNA相關(guān),以及ncRNA相關(guān)功能條目。從NES得分顯示,CAU組對(duì)比CA組,其富集的基因集均為正值,表明尿素的添加對(duì)于貽貝外套在酸化條件下的核酸代謝,細(xì)胞分泌和物質(zhì)運(yùn)輸,rRNA相關(guān),以及ncRNA相關(guān)功能的通路出現(xiàn)上調(diào)或激活現(xiàn)象。

進(jìn)一步對(duì)3組樣本的差異基因進(jìn)行KEGG功能富集分析,以P<0.05為篩選依據(jù),結(jié)果表明,CAvs. CN組的差異基因有1 036條差異基因顯著富集于29條KEGG通路,其中富集數(shù)量最多的3個(gè)通路為神經(jīng)退行性疾病通路(pathways of neurodegeneration),肌萎縮側(cè)索硬化通路(amyotrophic lateral sclerosis),以及細(xì)胞凋亡(apoptosis)通路;CAUvs. CN組有229條差異基因顯著富集于9條KEGG通路,其中富集程度最高的3個(gè)通路為肌萎縮側(cè)索硬化通路(amyotrophic lateral sclerosis),蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理通路(protein processing in endoplasmic reticulum),以及鉑類藥物耐藥性通路(platinum drug resistance);CAUvs. CA組有788條差異基因顯著富集于52條KEGG通路,富集程度最高的3個(gè)通路為細(xì)胞凋亡(apoptosis),癌癥通路(pathways in cancer),以及沙門(mén)氏菌感染通路(salmonella infection)。上述差異基因顯著富集的KEGG通路氣泡圖見(jiàn)Fig.5。此外,發(fā)現(xiàn)共有19條KEGG通路被CAvs. CN組和CAUvs. CA組兩個(gè)組間差異基因所共同富集;主要涉及疾病、免疫以及細(xì)胞功能相關(guān)的KEGG通路(Table 5)。通過(guò)分析每條共同富集通路的上調(diào)差異基因和下調(diào)差異基因的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)CAvs. CN組的19條KEGG通路中,多數(shù)上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)基因數(shù)量,表明上述通路在酸化條件下被激活;而在CAUvs. CA組中,富集于上述通路的上調(diào)差異基因數(shù)量則小于下調(diào)基因數(shù)量(Table 5),表明尿素添加對(duì)上述通路呈抑制效果。

Fig.5 Bubble diagrams of KEGG functional enrichment of differential expressed transcripts from the three pairwise-comparisons of the mantle sample from M. coruscus (A) KEGG functional enrichments of differential expressed transcripts from CA vs. CN comparison; (B) KEGG functional enrichments of differential expressed transcripts from CAU vs. CNcomparison; (C) KEGG functional enrichments of differential expressed transcripts from CAU vs. CAcomparison. CN represents the mussels with complete shells and raised in normal seawater(pH8.1); CA represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater (pH7.4)after urea injection

2.4 酸化及尿素添加影響了外套膜中生物礦化相關(guān)基因的表達(dá)量

貝殼基質(zhì)蛋白質(zhì)(shell matrix proteins, SMPs)是貝類貝殼形成的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。為進(jìn)一步探討尿素添加是否影響到貽貝外套膜中SMPs的表達(dá),依據(jù)此前研究中從厚殼貽貝貝殼中鑒定到的63種SMPs[27]對(duì)從本研究中差異基因進(jìn)行篩選,總計(jì)篩選到9種SMP,共27條轉(zhuǎn)錄本,其在3組厚殼貽貝外套膜中的表達(dá)量(TPM值)列于Table 6。由表可見(jiàn),酸化條件下,Nacrein,Lustrin,Regucalcin,以及Perlwapin的轉(zhuǎn)錄本呈上調(diào)趨勢(shì);而碳酸酐酶、酪氨酸酶以及Perlucin的轉(zhuǎn)錄本呈下調(diào)趨勢(shì);幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)合成酶則表現(xiàn)為不同轉(zhuǎn)錄本具有不同的響應(yīng)特征,其中,幾丁質(zhì)酶7條轉(zhuǎn)錄本中,3條呈下調(diào)趨勢(shì),2條呈上調(diào)趨勢(shì);3條幾丁質(zhì)合成酶轉(zhuǎn)錄本中,2條呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),1條呈上調(diào)趨勢(shì)(Table 6)。尿素添加對(duì)上述SMP在酸化條件下的表達(dá)量產(chǎn)生影響,誘導(dǎo)了Nacrein,Regucalcin,碳酸酐酶,酪氨酸酶,幾丁質(zhì)合成酶以及多數(shù)Perlucin轉(zhuǎn)錄本在酸化條件下的上調(diào)。同時(shí),尿素添加誘導(dǎo)了Lustrin,Perlwapin,以及部分幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)(Table 6)。

2.5 轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)與熒光定量PCR數(shù)據(jù)一致

采用q-PCR技術(shù)對(duì)隨機(jī)選擇的10條轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序所得差異基因(含5個(gè)上調(diào)差異基因和5個(gè)下調(diào)差異基因)進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證,以判斷定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果的可靠性,以表達(dá)量差異倍數(shù)取對(duì)數(shù)作圖,結(jié)果見(jiàn)Fig.6。由圖可見(jiàn),10條轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序所得差異基因與qPCR驗(yàn)證結(jié)果均一致,表明本次研究轉(zhuǎn)錄物組測(cè)序結(jié)果可靠。

Fig.6 qRT-PCR verification of the expression level of 10 randomly selected differential expressed transcriptsfrom Illumina HisSeq Gene expression level was calculated by the TPM value for Illumina HisSeq and by 2-ΔΔct for qRT-PCR data, respectively. The logarithm of the target gene expression relative to that of the control group was plotted as the ordinate. The data were shown as mean ± SD (n=3)

2.6 不同條件下厚殼貽貝外套膜上皮層形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化

貝類外套膜分為中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū),其中邊緣區(qū)被認(rèn)為與貝殼形成有關(guān)[28]。此外,外套膜邊緣區(qū)通常包含3個(gè)褶皺(fold),分別為外褶皺 (outer fold),中間褶皺(middle fold)和內(nèi)褶皺(inner fold)[29]。其中,外褶皺部位被認(rèn)為是與貝殼形成直接相關(guān)的組織[29]。對(duì)3組貽貝外套膜邊緣區(qū)的外褶皺部位進(jìn)行顯微觀察,采用HE染色方式,結(jié)果正如Fig.7所示。由圖可見(jiàn),與對(duì)照組(Fig.7A)相比,酸化處理誘導(dǎo)貽貝外套膜外褶皺上皮細(xì)胞層出現(xiàn)明顯裂隙,藍(lán)色細(xì)胞核區(qū)域出現(xiàn)明顯下陷,且上皮細(xì)胞層表面的纖毛間距出現(xiàn)增大,細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕微破損現(xiàn)象(Fig.7B);而酸化條件下添加尿素后的貽貝外套膜,其外褶皺上皮細(xì)胞層雖也出現(xiàn)裂隙,但細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,纖毛結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯變化;藍(lán)色細(xì)胞核區(qū)也未出現(xiàn)明顯下陷(Fig.7C)。

Fig.7 Hematoxylin and eosinstaining for the outer fold of mantle edge and micro-photos of the epithelial layer (A) the mantle sample from the CN group; (B) the mantle sample from the CA group; (C) the mantle sample from the CAU group. The scale bar is 100 μm; The nucleus was stained in blue and the cytoplasm was stained in pink. Black arrow denotes the epidermal cell layer and red arrow denotes the region of the nucleus

Table 3 GO functional enrichment of differential expressed transcripts from the three pairwise-comparisons of the mantle sample from M. coruscus

3 討論

長(zhǎng)江口海域是我國(guó)的厚殼貽貝主產(chǎn)區(qū),受季節(jié)性沖淡水影響,該海域的pH值呈現(xiàn)劇烈的波動(dòng)特征[30],特別是在夏季,甚至?xí)霈F(xiàn)短期7.2～7.6的pH低值[31]。因此,生存于該海域的厚殼貽貝必然具備適應(yīng)短期pH值下降的能力。目前對(duì)于貽貝適應(yīng)海洋酸化的分子機(jī)制尚不清晰。此前的研究已發(fā)現(xiàn),厚殼貽貝組織中含有較高濃度的尿素,且厚殼貽貝組織中具有脲酶[19]。此外,有研究表明,海水酸化會(huì)導(dǎo)致貽貝組織中氨離子(NH4+)濃度的上升[32],且其來(lái)源為NH3的合成速率加快所導(dǎo)致[33, 34]?？紤]到尿素可在脲酶的降解下產(chǎn)生NH3,且NH3在水中可轉(zhuǎn)化為NH4+從而有助于提升局部環(huán)境的pH值。因此,貽貝體內(nèi)所儲(chǔ)存的尿素可能對(duì)貽貝對(duì)抗海洋酸化的不利影響具有重要貢獻(xiàn)。為此,本文分析了貽貝在正常海水,酸化海水,以及添加尿素的情況下,其外套膜組織轉(zhuǎn)錄物組的變化,以期探討尿素在貽貝對(duì)抗海洋酸化過(guò)程中的可能分子機(jī)制。

Table 6 Expression levels of biomineralization related transcripts from the three pairwise-comparisons of the mantle sample

本文首先注意到,PCA分析中,CA組與CN組之間的PC1距離較CAU組與CN組之間要大(Fig.2);相比CAUvs. CN組,CAvs. CN組所產(chǎn)生的差異基因數(shù)量較多(Fig.3),上述結(jié)果表明,酸化對(duì)貽貝外套膜轉(zhuǎn)錄物組的影響較大,且添加尿素有助于減少酸化對(duì)貽貝外套膜轉(zhuǎn)錄物組的影響。對(duì)差異基因的功能富集分析表明,酸化對(duì)貽貝外套膜主要影響到疾病相關(guān)通路以及信號(hào)傳遞相關(guān)通路等(Fig.5)?？紤]到當(dāng)前KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)所收集的通路主要來(lái)自人以及小鼠等模式哺乳動(dòng)物,尚缺乏軟體動(dòng)物專有的KEGG功能數(shù)據(jù)庫(kù),因此,本研究中差異基因所富集的人類疾病相關(guān)代謝功能通路,預(yù)示著貽貝外套膜中可能具有類似的通路,但不一定是跟人類疾病有關(guān),而可能與貽貝免疫過(guò)程或細(xì)胞增殖分化有關(guān)。

另外,CAvs. CN組差異基因所富集的部分KEGG通路與生物礦化存在關(guān)聯(lián),表明酸化可能對(duì)貽貝外套膜的生物礦化功能產(chǎn)生影響。例如,肌萎縮側(cè)索硬化通路在小鼠成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮了重要作用[35],在人體中,該通路與骨組織的形成與健康也存在關(guān)聯(lián)[36];此外,破骨細(xì)胞分化通路(osteoclast differentiation)與人體骨組織形成具有重要關(guān)聯(lián)[37];集管酸分泌(collecting duct acid secretion)通路已被證實(shí)在人體腎結(jié)石的形成中發(fā)揮了重要作用[38]。此外,與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持的相關(guān)KEGG通路,例如,細(xì)胞凋亡(apoptosis),溶酶體(lysosome)以及自噬(autophagy)在CAvs. CN組也被顯著富集。上述KEGG通路與細(xì)胞完整性以及細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的維持有關(guān)。在環(huán)境脅迫條件下,以上通路被激活可用于清除損壞或死亡的細(xì)胞[39]。在GSEA分析中,酸化誘導(dǎo)了差異基因集富集于纖毛相關(guān)功能,且其NES得分為負(fù)值(Table 4),表明酸化對(duì)外套膜的纖毛相關(guān)功能產(chǎn)生了抑制。上述現(xiàn)象表明,酸化可能導(dǎo)致了貽貝外套膜上皮細(xì)胞以及纖毛層出現(xiàn)損傷,因此,誘導(dǎo)了上述通路的激活并以此清除或者修復(fù)損傷的細(xì)胞。值得注意的是,本研究對(duì)貽貝外套膜組織的顯微觀察表明,酸化會(huì)導(dǎo)致貽貝外套膜組織上皮細(xì)胞層出現(xiàn)明顯的細(xì)胞破損以及纖毛間距增大等現(xiàn)象(Fig.7)。上述變化與觀察到的細(xì)胞凋亡,自噬等相關(guān)通路的激活(Fig.5),以及纖毛相關(guān)功能的差異基因富集(Table 4)可能存在關(guān)聯(lián)。同時(shí),CAvs. CN組中,mTOR 信號(hào)通路(mTOR signaling pathway)被顯著富集。mTOR信號(hào)通路被認(rèn)為與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)有關(guān),該通路的激活有助于抑制細(xì)胞自噬[40]。本文推測(cè),酸化導(dǎo)致貽貝外套膜細(xì)胞出現(xiàn)損傷誘導(dǎo)了mTOR 信號(hào)通路的激活,其用于在清除受損細(xì)胞的同時(shí),維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),防止出現(xiàn)自噬或凋亡過(guò)度的現(xiàn)象。

CAUvs. CN組差異基因主要富集于天冬氨酸代謝,RNA 編輯,細(xì)胞骨架以及大分子復(fù)合物等相關(guān)GO功能條目(Table 3);考慮到厚殼貽貝外套膜尿素循環(huán)過(guò)程中,天冬氨酸與瓜氨酸合成為精氨琥珀酸是其關(guān)鍵代謝反應(yīng)之一[20],因此,尿素的添加可能對(duì)天冬氨酸代謝產(chǎn)生影響。KEGG富集結(jié)果表明,CAUvs. CN組的差異基因主要富集于藥物代謝相關(guān),免疫相關(guān)以及蛋白質(zhì)合成與代謝相關(guān)通路。本文注意到,CAUvs. CN組差異基因所富集的KEGG通路遠(yuǎn)少于CAvs. CN組,且CAvs. CN組差異基因所富集的多數(shù)KEGG通路并未在CAUvs. CN組中得到富集,例如,細(xì)胞凋亡(apoptosis),溶酶體(lysosome),自噬(autophagy),以及與生物礦化具有潛在關(guān)聯(lián)的通路等(Fig.5)。這表明酸化條件下添加尿素有助于減輕貽貝外套膜對(duì)酸化的敏感性,從而導(dǎo)致了差異基因數(shù)量的下降,也導(dǎo)致了所富集的KEGG通路的減少。對(duì)外套膜的顯微觀察中,與CA組相比,CAU組細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍顯完整(Fig.7)。推測(cè)與尿素添加后逆轉(zhuǎn)了酸化對(duì)外套膜細(xì)胞凋亡,自噬,溶酶體以及mTOR信號(hào)通路的抑制作用有關(guān),從而減輕了外套膜組織細(xì)胞在酸化下的脅迫效應(yīng)。

進(jìn)一步對(duì)CAUvs. CA組差異基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)CAUvs.CA組差異基因在GO富集分析中主要富集于氧化還原平衡,固醇代謝,以及離子結(jié)合功能等相關(guān)的GO條目(Table 3)。此前已有研究發(fā)現(xiàn),尿素在體外研究中會(huì)影響細(xì)胞色素C的鐵硫中心簇結(jié)構(gòu)[41],推測(cè)可能因此對(duì)細(xì)胞氧化還原功能產(chǎn)生影響。此外,尿素能抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性,從而抑制了固醇類物質(zhì)的運(yùn)輸[42],表明尿素與固醇代謝存在潛在關(guān)聯(lián)。KEGG富集分析表明,CAUvs. CA組差異基因主要富集于細(xì)胞過(guò)程、免疫、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)通路。在CAvs. CN組中,被激活的細(xì)胞凋亡、自噬、溶酶體以及mTOR信號(hào)通路在CAUvs. CA組中出現(xiàn)明顯抑制現(xiàn)象(Table 5)。部分免疫相關(guān)通路,例如腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway),Toll與Imd信號(hào)通路(Toll and Imd signaling pathway),以及抗原處理及呈遞通路(antigen processing and presentation)也具有類似現(xiàn)象。上述結(jié)果表明,在酸化條件下,尿素的添加抑制了酸化所誘導(dǎo)的KEGG通路的激活,從而減輕了酸化對(duì)外套膜組織的細(xì)胞過(guò)程以及免疫應(yīng)激的脅迫影響。GSEA分析進(jìn)一步證實(shí),尿素添加對(duì)貽貝外套膜部分被酸化激活的功能條目的逆轉(zhuǎn),在CAvs.CN組中多數(shù)富集的功能條目其NES值為負(fù)值,而在CAUvs.CN 組中其NES值均為正值(Table 4),表明尿素的添加有助于激活貽貝外套膜中相關(guān)功能條目,從而在貽貝對(duì)抗酸化的過(guò)程中具有積極意義。

此外,酸化條件下,外套膜中生物礦化相關(guān)蛋白質(zhì),例如Nacrein,Lustrin,Regucalcin,以及Perlwapin的轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)(Table 6)。其中,Nacrein是一種含有碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域的SMP,在牡蠣中被認(rèn)為與貝殼中方解石型碳酸鈣晶體的形成有關(guān)[43];酸化通常會(huì)抑制Nacrein的表達(dá)并因此導(dǎo)致貝類貝殼的鈣化率下降,例如在牡蠣和珍珠貝的研究中,發(fā)現(xiàn)酸化對(duì)2種貝類的Nacrein的表達(dá)均產(chǎn)生抑制效應(yīng)[44, 45]。但在本研究中,厚殼貽貝外套膜的Nacrein表達(dá)量并未在酸化條件下出現(xiàn)下調(diào),而是表現(xiàn)為上調(diào)。此前的研究也表明,pH值7.4的酸化條件并未影響貽貝貝殼的鈣化率[46],推測(cè)酸化條件下,Nacrein的在貽貝外套膜組織中的上調(diào)有助于減輕酸化對(duì)貝殼鈣化率的影響,也表明貽貝對(duì)酸化具有一定抗性。Lustrin是一種生物礦化相關(guān)的多功能蛋白質(zhì),主要分布于貝殼文石型碳酸鈣晶體片層結(jié)構(gòu)(珍珠質(zhì)層)之間[47];在皺紋盤(pán)鮑中已發(fā)現(xiàn),酸化會(huì)誘導(dǎo)Lustrin基因表達(dá)量的顯著上調(diào)[48]。Regucalcin是一種鈣結(jié)合蛋白質(zhì),對(duì)人骨組織鈣離子調(diào)節(jié)以及骨組織穩(wěn)態(tài)維持具有重要作用[49]。此前在厚殼貽貝貝殼中也鑒定到Regucalcin的存在,表明其參與了貽貝貝殼的生物礦化過(guò)程[27]。Perlwapin是一種生物礦化負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì),在鮑魚(yú)中已被證實(shí)能抑制碳酸鈣晶體的形成[50]。本研究中,尿素的添加對(duì)Nacrein和Regucalcin轉(zhuǎn)錄本的上調(diào),以及對(duì)Lustrin和Perlwapin的下調(diào)表明,尿素可能對(duì)上述SMP在酸化條件下的分子響應(yīng)產(chǎn)生了正面影響,從而維持了其貝殼在酸化條件下的正常生物礦化過(guò)程。進(jìn)一步分析尿素添加對(duì)酶類SMP分子的影響,包括酪氨酸酶,幾丁質(zhì)酶,幾丁質(zhì)合成酶以及碳酸酐酶。其中,酪氨酸酶在貽貝中與貝殼的發(fā)育有關(guān)[51];海洋酸化會(huì)對(duì)牡蠣幼蟲(chóng)貝殼發(fā)育階段的酪氨酸酶產(chǎn)生抑制,并導(dǎo)致牡蠣幼蟲(chóng)體內(nèi)多巴胺含量的上升[52]。幾丁質(zhì)酶與幾丁質(zhì)合成酶參與了貝殼中幾丁質(zhì)層的形成和代謝過(guò)程。此前在厚殼貽貝貝殼中已鑒定到2種酶的存在[27]。此外,在太平洋牡蠣中,已觀察到海洋酸化會(huì)抑制幾丁質(zhì)合成酶的表達(dá),同時(shí)上調(diào)了幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量,表明酸化會(huì)導(dǎo)致貝殼中幾丁質(zhì)層的降解而對(duì)貝殼的正常發(fā)育產(chǎn)生不利影響[53]。碳酸酐酶是海洋礦化生物(例如珊瑚,貝類,螺類等)中與生物礦化過(guò)程具有重要關(guān)聯(lián)的一類蛋白質(zhì),也因此成為檢測(cè)海洋酸化對(duì)礦化生物影響的一類生物標(biāo)記物[54]。此前的研究已表明,海洋酸化對(duì)不同物種的碳酸酐酶具有不同的影響。例如珊瑚和貽貝中,均發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶的活力受酸化影響而出現(xiàn)下調(diào)[55],表明酸化對(duì)碳酸酐酶具有抑制作用;但是在牡蠣中發(fā)現(xiàn),酸化會(huì)誘導(dǎo)其外套膜組織中的碳酸酐酶的基因表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)[56];推測(cè)碳酸酐酶可能因其存在不同的轉(zhuǎn)錄本且具有不同的功能所致。本研究發(fā)現(xiàn),厚殼貽貝外套膜中3條碳酸酐酶的轉(zhuǎn)錄本均表現(xiàn)為酸化條件下的下調(diào),以及添加尿素后的表達(dá)量上調(diào)(Table 6)。表明尿素添加可能對(duì)碳酸酐酶的不同轉(zhuǎn)錄本具有不同影響,后續(xù)值得進(jìn)一步深入研究。

貽貝貝殼中還存在具有免疫功能的SMP。例如,Perlucin是一種含凝集素結(jié)構(gòu)域的SMP,被認(rèn)為與貝殼珍珠質(zhì)層碳酸鈣晶體的形成有關(guān)[57, 58];在牡蠣中發(fā)現(xiàn),封閉Perlucin基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致牡蠣幼蟲(chóng)在酸化條件下出現(xiàn)殼發(fā)育異常[59]。上述結(jié)果表明,Perlucin在貝類酸化條件下生物礦化過(guò)程具有重要作用。本文發(fā)現(xiàn),酸化可誘導(dǎo)貽貝外套膜中多數(shù)perlucin的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào),尿素添加則對(duì)其中部分perlucin的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)影響,這表明尿素的添加對(duì)受酸化抑制的perlucin基因具有恢復(fù)作用。

綜上所述,酸化會(huì)對(duì)貽貝外套膜轉(zhuǎn)錄物組的影響主要涉及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、免疫調(diào)節(jié)和生物礦化等多方面,而尿素的添加會(huì)抑制部分受酸化所激活的代謝通路,包括細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持和免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)通路(Fig.8);同時(shí),尿素添加還誘導(dǎo)了部分收酸化抑制的SMP的表達(dá)量上調(diào)。雖然目前尚不清楚尿素通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)了外套膜中部分SMP基因的上調(diào),但已知尿素經(jīng)脲酶降解產(chǎn)生碳酸根離子和氨離子,氨離子有助于在組織中形成局部的堿性環(huán)境,從而對(duì)抗酸化帶來(lái)的pH值的下降;此外,尿素降解產(chǎn)生的碳酸根離子也對(duì)貽貝貝殼的生物礦化提供了額外的內(nèi)源性碳酸根離子用以形成碳酸鈣。因此,尿素的添加有助于減輕酸化對(duì)外套膜生物礦化相關(guān)功能的不利影響,提升貽貝對(duì)海洋酸化的耐受性。

Fig.8 Schematic view of the effects of acute acidification and urea supplementation on the mussel mantle Ctrl represents control group; CA represents the mussels with complete shell and raised in acidified sea-water(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shell and raised in acidified sea-water (pH7.4)after urea injection