馮亞嬋, 張皓杰, 杜 朝, 郭學(xué)玲, 王英澤

(河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院細(xì)胞工程研究室, 石家莊 050018)

乳腺癌(breast cancer,BRCA)替代肺癌成為全球第一大癌,是嚴(yán)重影響我國女性生命健康的重大疾病之一。并且,隨著晚育、生育減少以及紊亂生活作息的日益增多,全世界各地女性乳腺癌發(fā)病率迅速增長[1]。研究發(fā)現(xiàn),約33%的乳腺癌患者在診斷時(shí)已進(jìn)展為晚期轉(zhuǎn)移性疾病,并且大約80%的患者死于乳腺癌轉(zhuǎn)移[2]。因此,亟待新的治療手段阻止乳腺癌的進(jìn)一步轉(zhuǎn)移惡化。但是,癌癥轉(zhuǎn)移涉及到新生血管生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控等,其病理生理過程相當(dāng)復(fù)雜[3-5]。目前,臨床上對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療主要依靠化療,但單獨(dú)化療的高毒性顯著降低患者的生存質(zhì)量。因此仍迫切需要探尋安全有效的藥物用于乳腺癌患者臨床治療。近年來,中醫(yī)藥在腫瘤治療中的應(yīng)用日益突出。并且,越來越多的中藥有效成分再利用成為抗癌藥物發(fā)現(xiàn)并開發(fā)的替代方法,大大縮短了藥物開發(fā)時(shí)間,增加了轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的治療機(jī)會(huì)。

青蒿素(artemisinin,ART)是從天然植物黃花蒿中提取出的內(nèi)含過氧化橋基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯成熟藥物[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),ART能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)DNA損傷反應(yīng)、阻斷腫瘤進(jìn)展關(guān)鍵信號(hào)通路(例如Wnt/β-catenin),使其在腫瘤治療領(lǐng)域備受關(guān)注[7-9]。Mohd Farhan[10]等人研究發(fā)現(xiàn),ART以濃度依賴性方式顯著降低了葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,且進(jìn)一步研究表明,ART的抗癌作用可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR途徑介導(dǎo)的。Deeptashree Nandi[11]等人研究顯示,ART通過破壞其靶標(biāo)的啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄作用來顯著下調(diào)FoxM1的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制許多致癌驅(qū)動(dòng)因素的作用。此外,青蒿素對(duì)前列腺癌的治療作用也有相關(guān)研究[12]。然而,針對(duì)ART對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用效果及作用機(jī)制報(bào)道較少。本研究通過檢測(cè)ART對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等的影響,明確了ART對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抑制遷移和誘導(dǎo)凋亡的作用,初步揭示了其作用機(jī)制可能涉及對(duì)TIGIT/CD155信號(hào)軸的調(diào)控,為深入研究ART的抗腫瘤作用提供一定的數(shù)據(jù)支撐和理論支持。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

青蒿素、0.1%結(jié)晶紫染色液、細(xì)胞固定液、細(xì)胞周期試劑盒、高效RIPA組織細(xì)胞裂解液、脫脂奶粉(索萊寶科技有限公司,北京);Biozellen植物源基質(zhì)膠(比麗(Biozellen)生物有限公司,美國);線粒體膜電位試劑盒(雷根生物有限公司,北京);ROS試劑盒、蛋白酶抑制劑、蛋白質(zhì)上樣緩沖液(5×)(碧云天生物技術(shù)公司,上海);MTS試劑盒(Promega生物科技有限公司,北京);細(xì)胞凋亡試劑盒(YESEN生物科技有限公司,上海);DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液(Gibco公司,美國);PCR引物(Invitrogen科技公司,美國);SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒(賽維爾生物科技有限公司,武漢)。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)與二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific,美國);流式細(xì)胞分選儀(Becton Dickinson and Company,美國);倒置熒光顯微鏡(Nikon,日本);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI,美國);電泳儀(北京六一儀器廠,北京)。

1.3 細(xì)胞株及溶液

4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞株購自豐暉生物科技有限公司(長沙);HC11小鼠胸腺上皮細(xì)胞株購自賽維爾生物科技有限公司細(xì)胞庫(武漢)。

ART溶液:準(zhǔn)確稱取28.2 mg ART,加二甲基亞砜(DMSO)溶解,混勻,備用。后續(xù)用基本培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1及小鼠胸腺上皮細(xì)胞HC11。各實(shí)驗(yàn)均采用狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。

1.5 MTS法測(cè)定細(xì)胞活力

分別取4T1及HC11細(xì)胞接種至96孔板中,每孔5×104個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入100 μL不同濃度(0(對(duì)照組)、10、100、200、400、500、600和800 μmol/L)的ART,每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,另設(shè)空白培養(yǎng)基組;藥物作用24、48、72 h時(shí),每孔加入10 μL MTS溶液,繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h使用酶標(biāo)儀在498 nm波長下測(cè)定每孔的光密度(A),計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力。相對(duì)細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A498=空白培養(yǎng)基組A498)/(對(duì)照組A498=空白培養(yǎng)基組A498)×100%。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)

1.6.1 劃痕實(shí)驗(yàn)[13]將4T1細(xì)胞接種于12孔板中,細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,500 μL/孔,培養(yǎng)至80%～90%融合;使用200 μL無菌移液管尖端在孔的中間劃出“傷口”,再用PBS沖洗除去細(xì)胞碎片;以濃度為0(對(duì)照組)、100和200 μmol/L的ART溶液處理,每組2個(gè)重復(fù)孔;ART處理后0、12、24、48 h,使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。使用Image J軟件測(cè)量傷口面積。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6.2 基質(zhì)凝膠包被的跨孔侵襲實(shí)驗(yàn)[14]按照Biozellen細(xì)胞培養(yǎng)基基質(zhì)膠說明書稀釋A膠及C膠,并置于Transwell小室上層,在4 ℃冰箱孵育2～3 h;利用1640培養(yǎng)基將4T1細(xì)胞制成8×106個(gè)/mL懸液,各Transwell小室上層加入0.8 mL細(xì)胞懸液,小室下層分別加入濃度為0(對(duì)照組)、100和200 μmol/L的ART溶液,每組2個(gè)重復(fù)孔,并設(shè)立陰性對(duì)照組;培養(yǎng)48 h,借助棉簽輕輕移除位于基質(zhì)凝膠涂層或未涂層腔室上表面的細(xì)胞,存在于膜下表面的侵襲性遷移細(xì)胞用預(yù)冷固定液固定,用結(jié)晶紫染色,使用倒置顯微鏡觀察,選用10個(gè)以上不同視野計(jì)數(shù),若視野中細(xì)胞數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞用Image J軟件細(xì)胞計(jì)數(shù)[15]。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 將4T1細(xì)胞以每孔1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,每孔1 mL,培養(yǎng)24 h;再以濃度為0(對(duì)照組)、100和200 μmol/L的ART處理,每組2個(gè)重復(fù)孔;處理48 h,用PBS清洗細(xì)胞3次,以4%的預(yù)冷固定液固定細(xì)胞后用結(jié)晶紫染色,使用倒置顯微鏡觀察,選取10個(gè)以上不同視野計(jì)數(shù),若視野中細(xì)胞數(shù)超過50個(gè)細(xì)胞用Image J軟件細(xì)胞計(jì)數(shù)[15]。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7 4T1細(xì)胞凋亡能力檢測(cè)

1.7.1 細(xì)胞ROS檢測(cè) 將4T1細(xì)胞接種于24孔板中,細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,500 μL/孔,培養(yǎng)24 h;以濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400和800 μmol/L的ART處理,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔;處理24 h,消化收集細(xì)胞并用稀釋好的ECFH-DA熒光探針溶液重懸,37 ℃孵育20～30 min,用培養(yǎng)基清洗2～3次并用PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞活性氧的數(shù)量可以用平均熒光值表示,細(xì)胞熒光信號(hào)也通過熒光顯微鏡進(jìn)行測(cè)量和記錄。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7.2 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)[16]將4T1細(xì)胞接種于24孔板中,細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,500 μL/孔,培養(yǎng)24 h;以濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400和800 μmol/L的ART處理,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔;處理24 h,將消化清洗后的細(xì)胞與JC-1工作液在37 ℃下孵育20 min,再用PBS洗滌2～3次;使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用Flow Jo軟件進(jìn)行線粒體膜電位的分析,線粒體膜電位(Δψm)用JC-1紅色/綠色熒光強(qiáng)度比值來表示,細(xì)胞的2種熒光信號(hào)也能通過熒光顯微鏡進(jìn)行測(cè)量和記錄。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 利用DNA含量檢測(cè)方法確定細(xì)胞周期的變化,將4T1細(xì)胞接種于12孔板中,細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ mL,500 μL/孔,培養(yǎng)細(xì)胞24 h,以濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400和800 μmol/L的ART處理,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔;處理24 h,消化收集細(xì)胞并用PBS清洗2～3次,再用70%的預(yù)冷乙醇重懸;收集好的細(xì)胞并置于4 ℃下過夜處理;再用PBS清洗1次,加入RNase A重懸,37 ℃水浴30 min;最后加入PI染液4 ℃避光孵育30 min;使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),用Flow Jo軟件進(jìn)行線粒體膜電位的分析,細(xì)胞周期阻滯情況以熒光值的差異進(jìn)行表示。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將4T1細(xì)胞接種于24孔板中,細(xì)胞密度同ROS檢測(cè),培養(yǎng)24 h,以濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400和800 μmol/L的ART處理;處理細(xì)胞24 h,消化收集細(xì)胞,PBS清洗2～3次并加入1×結(jié)合緩沖液(binding buffer)、PI和Annexi V-FITC避光孵育10～15 min;加入1×結(jié)合緩沖液(binding buffer)混勻,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),以Flow Jo軟件分析細(xì)胞凋亡情況,細(xì)胞的2種熒光信號(hào)也通過熒光顯微鏡進(jìn)行測(cè)量和記錄。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.8 4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡機(jī)制初步探索

1.8.1 生物信息分析基因表達(dá)及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 從TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org/)中驗(yàn)證TIGIT基因在不同腫瘤組織及正常組織中的表達(dá)情況及相關(guān)數(shù)據(jù),并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行預(yù)后分析[17-19]。另外,將TIGIT基因?qū)?yīng)蛋白質(zhì)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/),限定物種為“Mus musculus”,并以置信度≥0.4,隱藏離散的點(diǎn),得到潛在作用靶點(diǎn)與相互作用關(guān)系。

1.8.2 qPCR檢測(cè)基因表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,2 mL/孔,培養(yǎng)24 h;以濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400和800 μmol/L的ART處理;處理細(xì)胞24 h,使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA成分;逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量基因檢測(cè);qPCR反應(yīng)條件如下:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組均為3個(gè)樣本重復(fù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用GAPDH作為內(nèi)參基因。

Table 1 Primer sequences

1.8.3 Western印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)水平 樣品制備:將細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,2 mL/孔,培養(yǎng)24 h;以濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400和800 μmol/L的ART處理;處理細(xì)胞24 h,使用細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解液(RIPA:蛋白酶抑制劑=100∶1)裂解細(xì)胞;取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

SDS-PAGE電泳:在蛋白質(zhì)中加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液,95 ℃煮沸5 min制備樣品。再使用12%的分離膠與5%的濃縮膠,電泳條件為160 V,1 h用于分離樣品蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)膜與封閉:使用甲醇激活PVDF膜,PVDF膜和SDS-PAGE膠按順序放好,將轉(zhuǎn)膜電泳槽置于冰水浴中300 mA,50 min電泳,將上一步凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。再使用脫脂牛奶室溫水平搖床封閉1 h?？贵w孵育:加入一抗(抗體濃度:1∶1 000),4 ℃孵育過夜。二抗(抗體濃度:1∶5 000)室溫孵育1 h。成像:使用ECL檢測(cè)試劑盒顯色,采用電泳凝膠成像分體系統(tǒng)成像。

1.8.4 流式檢測(cè)基因表達(dá) 將細(xì)胞接種于24孔板中,細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,500 μL/孔,培養(yǎng)24 h;以濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400和800 μmol/L的ART處理;另外單獨(dú)接種相同密度的HC11細(xì)胞于24孔板中,不進(jìn)行藥物處理作為細(xì)胞陰性對(duì)照;處理及培養(yǎng)24 h,胰酶消化收集細(xì)胞;使用PBS清洗細(xì)胞2～3次,冰上避光孵育TIGIT-PE抗體30 min;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4T1及HC11細(xì)胞表面TIGIT變化。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組均為3個(gè)樣本重復(fù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Image J軟件及Flow Jo軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均一式三份。數(shù)據(jù)大多表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD。使用單向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素能夠抑制4T1乳腺癌細(xì)胞增殖

為了考察ART能否抑制4T1乳腺癌細(xì)胞增殖,本文使用不同濃度的ART處理細(xì)胞,然后以MTS方法檢測(cè)了4T1乳腺癌細(xì)胞的活力,結(jié)果見Fig.1A。就不同濃度的ART處理效果而言,無論處理時(shí)長是24 h、48 h還是72 h,低濃度(0～200 μmol/L)ART對(duì)于細(xì)胞活力無明顯抑制作用;中、高濃度(400～800 μmol/L)ART顯著或極顯著抑制細(xì)胞增殖,細(xì)胞活力都低至70%以下,而且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性,結(jié)果確切表明ART可以抑制4T1細(xì)胞增殖。從不同處理時(shí)長的效果表明,低濃度ART處理48 h時(shí),細(xì)胞活力略小于處理72 h,后者又略小于處理24 h,表明48 h以內(nèi)這種輕微的抑制作用有時(shí)長依賴性,48 h之后,與ART抑制作用相比,細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)占主導(dǎo)地位。與此不同,中、高濃度ART處理表現(xiàn)出明顯的時(shí)長依賴性。

Fig.1 Detecting the inhibitory effect of ART on cell viability (A,B) Mouse 4T1 breast cancer cell and mouse HC11 mammary epithelial cells (5×104 cells/well) were plated into 96 wells and the cells were exposed for increasing concentration of ART for 24, 48, 72 hours, respectively. Cell proliferation was measured by the MTS assay. *P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. The P-values were calculated using an unpaired two-tailed Students’ t-test

作為對(duì)照的HC11細(xì)胞對(duì)ART處理表現(xiàn)出了不同于4T1細(xì)胞的活力變化模式,結(jié)果見Fig.1B。低濃度ART顯著促進(jìn)HC11細(xì)胞增殖。中濃度(400～600 μmol/L)ART呈現(xiàn)輕微抑制效果,但細(xì)胞活力維持在80%以上,而且隨著處理時(shí)間延長,這種效果有所增強(qiáng)。高濃度(800 μmol/L)ART表現(xiàn)出抑制作用,但只有長時(shí)間處理(48 h和72 h)細(xì)胞活力才顯著降低,且降幅遠(yuǎn)低于經(jīng)相同條件處理的4T1細(xì)胞。

綜上所述,ART可以抑制4T1細(xì)胞增殖,而且,這種抑制作用在本文所選中的高濃度呈現(xiàn)出濃度依賴性和處理時(shí)長依賴性。特別是這種處理作用表現(xiàn)出細(xì)胞類型的特異性,對(duì)HC11細(xì)胞幾乎未見抑制作用,即使高濃度長時(shí)間處理可以抑制,也遠(yuǎn)低于同樣條件對(duì)4T1細(xì)胞的抑制幅度,結(jié)果提示,ART具備惡型特異殺傷能力及細(xì)胞安全性。

2.2 青蒿素可以抑制乳腺癌4T1細(xì)胞遷移

在明確了ART能夠抑制4T1細(xì)胞增殖之后,本文進(jìn)一步檢測(cè)了它是否能夠抑制4T1細(xì)胞遷移。首先,通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)考察不同濃度ART對(duì)4T1細(xì)胞遷移能力的影響,結(jié)果見Fig.2。與對(duì)照組相比,ART處理均減少4T1細(xì)胞的遷移面積,說明ART能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。并且表明ART處理時(shí)長相同時(shí),200 μmol/L濃度下的遷移面積總是小于100 μmol/L濃度下的遷移面積,說明這種抑制作用存在濃度依賴性。另一方面,ART處理濃度一致時(shí)抑制細(xì)胞遷移效果都隨著處理時(shí)間延長而增大,說明這種抑制作用同樣存在時(shí)長依賴性。

Fig.2 Detecting the effect of ART on the migratory capacity of cells (A) ART markedly inhibited migration of 4T1 cell after treatment with different concentrations (100, 200 μmol/L) and different durations (12, 24, 48 hours). Untreated cells were used as control. Scale bar is 500 μm. (B) The wound area of migration 4T1 cell upon treatment and data represented as a bar graph with respect to untreated (control) cells, which also served as our experimental controls. Data represented as mean±standard error of the mean (n=3). *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001. The P-values were calculated using an unpaired two-tailed Students’ t-test

2.3 青蒿素抑制乳腺癌4T1細(xì)胞侵襲及集落形成

為了探討ART對(duì)4T1細(xì)胞侵襲能力的作用,本文采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了ART是否具備抑制4T1細(xì)胞侵襲的能力。結(jié)果正如Fig.3A, B所示,各濃度ART處理均能使附著在Transwell腔室底部的侵襲性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,量化分析顯示,不同濃度ART均顯著抑制了4T1細(xì)胞侵襲,而且這種抑制作用具有濃度依賴性,其中100 μmol/L濃度下細(xì)胞數(shù)量為對(duì)照組的60.85%;而200 μmol/L濃度下的細(xì)胞數(shù)量僅為對(duì)照組的45.30%。

Fig.3 Anti-invasion and anti-clonogenic potency of ART (A,B) Transwell assays to determine the invasiveness of 4T1 cells after exposure to ART (100,200 μmol/L) for 24 hours. Invaded cells were fixed with 4% formaldehyde and stained with crystal violet and imaged using the EVOS?FL Imaging System. Representative bar graphs of the number of invaded cells with each treatment group, where untreated (control) cells served as an experimental control. (C, D) The colony formation assay was used to test the inhibition of ART. Upon treatment with ART (100, 200 μmol/L) for 24 hours. Colonies were fixed with 4% formaldehyde and stained with crystal violet and imaged using the EVOS?FL Imaging System. The number of colonies formed by each treatment group; untreated cells (control) were considered as our experimental controls. Data represented mean ± standard error (n=3).*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001. The P-values were calculated using an unpaired two-tailed Students’ t-test

此外,細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移后增殖的主要標(biāo)志之一,結(jié)果見Fig.3C,D。檢測(cè)結(jié)果顯示,各濃度ART處理均能使4T1細(xì)胞形成的集落明顯減少,極顯著抑制細(xì)胞集落形成。而且這種抑制作用同樣具有濃度依賴性,其中100 μmol/L濃度下細(xì)胞數(shù)量為對(duì)照組的17.10%;而200 μmol/L濃度下的細(xì)胞數(shù)量更是僅為對(duì)照組的1.20%。

2.4 青蒿素促進(jìn)乳腺癌4T1細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生

當(dāng)4T1細(xì)胞受到外界刺激時(shí),線粒體膜電位受到刺激的同時(shí)影響呼吸鏈隨之產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),而ROS水平過量升高會(huì)引發(fā)線粒體自噬。因此,為了探討氧化應(yīng)激是否是導(dǎo)致4T1細(xì)胞早期凋亡的原因之一,本文利用活性氧探針進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見Fig.4。結(jié)果顯示,ART以濃度依賴的方式誘導(dǎo)4T1細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,其中800 μmol/L的ART誘導(dǎo)ROS量為對(duì)照組的176.80%。結(jié)果提示,ART可能通過激發(fā)氧化應(yīng)激促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

Fig.4 ART induces ROS in 4T1 cells (A, B) Intracellular ROS observation of 4T1 cells exposed to ART. ROS is represented by green fluorescence. Scale bar: 100 μm. Data are presented as mean ± SD. *P<0.05; **P < 0.01; significantly different from the control

2.5 青蒿素誘導(dǎo)乳腺癌4T1細(xì)胞線粒體膜電位喪失及周期阻滯

線粒體膜電位喪失是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)志性事件之一,通常是細(xì)胞凋亡最早發(fā)生的事情。與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位通常呈超極化狀態(tài),本文利用JC-1染色法檢測(cè)了4T1細(xì)胞膜電位的變化,結(jié)果見Fig.5A。結(jié)果顯示,ART同樣以濃度依賴的方式促進(jìn)4T1乳腺癌細(xì)胞線粒體膜電位的喪失。倒置熒光顯微鏡能直觀看到不同濃度ART處理4T1細(xì)胞紅/綠熒光的比值明顯變化。量化分析同樣顯示,各濃度ART都顯著或極顯著降低了4T1細(xì)胞線粒體膜電位。其中,800 μmol/L的ART促進(jìn)線粒體膜電位喪失率為對(duì)照組的82.10%。

Fig.5 ART promoted the decrease of mitochondrial membrane potential (ΔΨ) and induced cell cycle arrest in the 4T1 cells (A,B) Cells were treated as described in the Materials and methods and then incubated with the membrane potential indicator, JC-1. Intracellular red and green fluorescence of JC-1 were determined by an inverted fluorescent microscope. The intracellular red and green fluorescence of JC-1 was measured using Flow Cytometry. Histogram showing the red/green fluorescence intensity ratio in differently treated cells (n=3). Treatment with ART decreased the mitochondrial membrane potential in 4T1 cell (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). (C) Representative results showed that ART induces cell cycle arrest in 4T1 cells. 4T1 cells were subjected to cell cycle analysis. (D) Quantitative results of the cell cycle phase of results in (C)

細(xì)胞凋亡包括早期凋亡和晚期凋亡,為進(jìn)一步考察ART對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞晚期凋亡的影響效果,利用流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測(cè)4T1細(xì)胞周期分布情況。晚期凋亡細(xì)胞由于總DNA量降低,G0/G1期前細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)DNA低染細(xì)胞群,即SubG1期。PI染色顯示不同濃度ART處理的4T1細(xì)胞相較于對(duì)照組,其SubG1與G0/G1期均受到阻滯,尤其G1期周期阻滯明顯具有濃度依賴趨勢(shì),結(jié)果見Fig.5C,D。檢測(cè)結(jié)果顯示,ART誘導(dǎo)4T1乳腺癌細(xì)胞SubG1期的出現(xiàn),說明4T1細(xì)胞出現(xiàn)晚期凋亡。而G0/G1期阻滯則表示青蒿素通過引起4T1細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。因此,ART處理引起4T1細(xì)胞G0/G1期阻滯及SubG1期的出現(xiàn),二者共同促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

2.6 青蒿素誘導(dǎo)乳腺癌4T1細(xì)胞凋亡

最后利用V-FITC/PI染色法考察ART對(duì)4T1細(xì)胞凋亡作用的影響,結(jié)果見Fig.6。結(jié)果顯示,不同濃度的ART均能顯著誘導(dǎo)4T1細(xì)胞凋亡(Q2+Q3),且呈現(xiàn)劑量依賴模式。其中,400 μmol/L ART的細(xì)胞凋亡率約為31.51%,而800 μmol/L ART的細(xì)胞凋亡率約為39.14%。

Fig.6 AV/PI detected the apoptotic cell percentage of 4T1 cells (A) ART significantly increased the apoptotic cell percentage of 4T1 cells compared with the control group (**P<0.01). The raw percentage of live, (early) apoptotic, (late) apoptotic/dead, and dead cells in each group are displayed. (B) Quantitatively apoptotic populations of 4T1 cells. The p-values were calculated using an unpaired two-tailed Students’ t-test

2.7 青蒿素下調(diào)4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)軸TIGIT-CD155的mRNA表達(dá)水平

T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)免疫檢查點(diǎn)正在成為單獨(dú)抗癌治療或與其他免疫阻斷療法聯(lián)合使用的希望靶標(biāo)[20]。因此,初步確定選擇TIGIT作為ART的作用靶點(diǎn)進(jìn)行探索。利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證TIGIT信號(hào)靶點(diǎn)在乳腺癌腫瘤組織及正常組織中的表達(dá)差異,結(jié)果正如Fig.7A所示,TIGIT在乳腺癌組織中高表達(dá)且與正常組織相比具有極顯著差異。在確定TIGIT信號(hào)靶點(diǎn)之后,本文又利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步查找與TIGIT相關(guān)的主要結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn),分析結(jié)果見Fig.7B,CD155(PVR)與TIGIT的結(jié)合能力最強(qiáng)(綜合得分為0.999),初步認(rèn)為TIGIT/CD155信號(hào)軸為ART的潛在作用軸。

Fig.7 The TIGIT-CD155 signaling axis is aberrantly expressed in tumor cells (A) Expression analysis of TIGIT in tumor and normal tissues by TIMER 2.0 database analysis. (B) The interaction network of TIGIT and other target in Mus musculus constructed using STRING database. (C) RNA analysis was performed for Tigit/CD155 gene expression in 4T1 and HC11 cells. (D) The expression of Tigit/CD155 protein levels is analyzed by Western blot in 4T1 and HC11 cells. (E) Flow cytometry analysis of the expression of Tigit on the surface of 4T1 and HC11 cells. *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001. The p-values were calculated using an unpaired two-tailed Students’ t-test

另外,為進(jìn)一步確定人源數(shù)據(jù)庫是否可以應(yīng)用于鼠源分析,本文對(duì)4T1細(xì)胞及HC11細(xì)胞的TIGIT/CD155信號(hào)軸的基因水平及蛋白質(zhì)水平分別進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果見Fig.7C,D。Tigit及CD155均在乳腺癌細(xì)胞中具有異常高表達(dá)的情況,其中qPCR顯示,4T1細(xì)胞中CD155的表達(dá)率為HC11細(xì)胞的14.24倍,而Tigit表達(dá)率更是高達(dá)80.19倍。此外,利用流式對(duì)Tigit的表達(dá)再一次進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證,結(jié)果見Fig.7E,4T1細(xì)胞的Tigit表達(dá)峰與HC11細(xì)胞的表達(dá)峰相比明顯右移,可見其表達(dá)率顯著高于HC11細(xì)胞。因此數(shù)據(jù)表明,基因水平、蛋白質(zhì)及流式結(jié)果均與生物信息分析數(shù)據(jù)相呼應(yīng),Tigit在腫瘤細(xì)胞異常高表達(dá)。因此,下一步將檢測(cè)ART對(duì)4T1細(xì)胞TIGIT-CD155信號(hào)軸的影響。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)了ART處理對(duì)TIGIT/CD155信號(hào)軸基因表達(dá)的影響,結(jié)果正如Fig.8A,B所示。經(jīng)過不同濃度ART處理后的4T1乳腺癌細(xì)胞Tigit的mRNA水平均極顯著降低,而且降幅呈現(xiàn)濃度依賴性,其中800 μmol/L的ART處理其表達(dá)率僅為9.84%;而CD155的mRNA水平因ART處理下降幅度也呈現(xiàn)濃度依賴性,只是僅在中(400 μmol/L的表達(dá)率為92.28%)、高(800 μmol/L的表達(dá)率為90.02%)濃度處理后,才呈現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)。另外,蛋白質(zhì)水平同樣具有相同的作用效果,結(jié)果見Fig.8C。最后,為再進(jìn)一步確定Tigit的表達(dá)情況,同樣利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見Fig.8D,經(jīng)不同濃度的ART處理后的4T1細(xì)胞Tigit表達(dá)情況受到抑制,其同樣具有濃度依賴的趨勢(shì)。因此,上述結(jié)果提示,ART作用于TIGIT/CD155信號(hào)軸進(jìn)而調(diào)控4T1乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及凋亡,但其中作用效果的特異性仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Fig.8 The effect of ART on the expression of Tigit-CD155, a signaling axis related to metastasis of 4T1 breast cancer cells (A,B) RNA analysis of Tigit and CD155 in 4T1 cells treated with ART (100, 200, 400, 800 μmol/L) for 24 hours. (C) Western blot analysis of Tigit and CD155 in 4T1 cells treated with ART (100, 200, 400, 800 μmol/L) for 24 hours. (D) Flow cytometry analysis of Tigit in 4T1 cells treated with ART (100, 200, 400, 800 μmol/L) for 24 hours. *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001. The p-values were calculated using an unpaired two-tailed Students’ t-test

3 討論

乳腺癌作為高異質(zhì)性腫瘤,具有高轉(zhuǎn)移性和低T細(xì)胞免疫浸潤的特點(diǎn)。因此,抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是乳腺癌治療的重要策略[21]。近年來研究發(fā)現(xiàn),ART及其衍生物例如二氫青蒿素、青蒿琥酯等的抗腫瘤作用日益突出[22]。另外,青蒿素還應(yīng)用于肺癌、肝癌和白血病等多種癌癥治療。然而,青蒿素的抗腫瘤作用機(jī)制復(fù)雜,涉及細(xì)胞周期阻滯、增加胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[23,24],尚待深入研究。研究發(fā)現(xiàn),TIGIT作為免疫抑制靶點(diǎn)在免疫細(xì)胞表面異常高表達(dá),且與CD155結(jié)合傳遞抑制腫瘤凋亡、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的負(fù)性調(diào)控作用[25]。Zhang等人研究報(bào)道,T、NK等免疫細(xì)胞表面TIGIT抑制性受體呈高表達(dá)狀態(tài),且TIGIT阻斷可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答,這可以作為現(xiàn)有免疫療法的潛在補(bǔ)充。然而,TIGIT阻斷促進(jìn)腫瘤清除的作用機(jī)制仍未完全闡明,這提示ART能否直接作用于腫瘤細(xì)胞表面的TIGIT進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。因此,靶向阻斷TIGIT與CD155結(jié)合可能實(shí)現(xiàn)調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡的目標(biāo),能為惡性腫瘤的臨床治療提供新手段。

本研究旨在探討ART對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡的調(diào)控作用及分子機(jī)制。本文的研究結(jié)果顯示,中、高濃度的ART對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著和極顯著的抑制作用,而且這種作用呈現(xiàn)出ART濃度和處理時(shí)長依賴性,這與文獻(xiàn)研究的結(jié)果[27]趨勢(shì)一致。本文從能否抑制4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)移的角度考察了ART的抗腫瘤作用,發(fā)現(xiàn)ART可以顯著抑制細(xì)胞遷移、侵襲以及集落形成,細(xì)胞水平上對(duì)這些生物學(xué)效應(yīng)的研究一方面使我們進(jìn)一步確認(rèn),ART作為治療4T1惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在價(jià)值,另一方面也為體內(nèi)成瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持。本研究就細(xì)胞凋亡的指標(biāo)所作檢測(cè)也表明,ART對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用顯著,且同樣具有濃度依賴的特征。本文進(jìn)一步利用生物信息學(xué)篩選出了ART作用靶點(diǎn)TIGIT/CD155軸,qPCR、WB以及流式結(jié)果均提示,ART對(duì)Tigit的表達(dá)水平具有濃度依賴的顯著下調(diào)作用,亦可顯著下調(diào)CD155的mRNA表達(dá)水平。

綜上所述,ART體外調(diào)控4T1乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及凋亡,其作用機(jī)制可能與TIGIT/CD155信號(hào)軸有關(guān)。研究結(jié)果為ART應(yīng)用于乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療策略提供一定的參考,對(duì)開發(fā)新的高效、特異和無毒的抗腫瘤藥物具有借鑒意義。鑒于ART對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移和凋亡能力的影響,后續(xù)還會(huì)對(duì)其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制層面,以及TIGIT/CD155信號(hào)軸展開進(jìn)一步的深入探究,進(jìn)而揭示ART的具體作用機(jī)制,如Fig.9所示。

Fig.9 Potential mechanism of action of ART in suppressing breast cancer TIGIT and CD155 are widely expressed in tumors and closely related to metastasis. Therefore, TIGIT can be used as a potential molecular target or prognostic marker for the treatment of breast cancer. In recent years, the anti-tumor effect of ART has become more prominent, and our study has confirmed that ART can inhibit the invasion and metastasis of 4T1 cells. However, the interaction between artemisinin nanoparticles and immune checkpoint TIGIT is not clear. Therefore, we propose possible antitumor mechanism that ART can block the TIGIT-CD155 signal axis to inhibit breast cancer metastasis