賈 瓊, 金聰俐, 胡世雄, 秦蓉芬, 趙立峰, 范瑞文*

(1)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 山西, 晉中 030801;2)天津市北辰區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心, 天津 300400)

絲裂原活化蛋白激酶15 (mitogen-activated protein kinase 15,MAPK15),又稱(chēng)ERK7或ERK8,最早由Abe等人于1999年在大鼠中發(fā)現(xiàn)[1],是MAPK家族非典型的新成員。MAPK15參加多種細(xì)胞活動(dòng),例如促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和凋亡[2];刺激自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、纖毛發(fā)生和蛋白質(zhì)分泌;維持基因的穩(wěn)定性等[2]。目前,尚不清楚MAPK15屬于原癌基因還是腫瘤抑制基因。在胃癌中,MAPK15的過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)延長(zhǎng)c-Jun的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)胃黏膜的惡性轉(zhuǎn)化[3];在骨肉瘤中,MAPK15被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,并通過(guò)c-Jun/MMP通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。MAPK15過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)自噬途徑促進(jìn)男性生殖細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,能夠防止DNA損傷和腫瘤抑制因子腫瘤蛋白P53(tumor protein p53,TP53)的激活[5]。由于MAPK15在不同腫瘤中的過(guò)表達(dá)和擴(kuò)增,MAPK15值得作為藥物靶點(diǎn)進(jìn)行探索。

納米抗體,也被稱(chēng)為重鏈抗體可變區(qū)(variable domain of heavy-chain of heavy-chain antibody, VHH)或單域抗體,是一種獨(dú)特的和功能性重鏈抗體[6]。與常規(guī)抗體不同,納米抗體是僅由重鏈可變區(qū)組成的獨(dú)特抗體片段。納米抗體的分子量?jī)H有15 kD,是常規(guī)抗體的1/10,抗原結(jié)合力與常規(guī)抗體相似,但溶解度更高,穩(wěn)定性好,在識(shí)別和結(jié)合方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7]。近年來(lái),納米抗體逐步被認(rèn)為是常規(guī)單克隆抗體的替代品,結(jié)合CAT-T療法也給免疫腫瘤治療帶來(lái)了飛躍性的改變,在腫瘤治療領(lǐng)域方面具有巨大的潛能。因此,納米抗體在生物研究、醫(yī)學(xué)診斷、免疫治療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

黑色素瘤是死亡率較高的皮膚癌類(lèi)型,起源于黑色素細(xì)胞的惡化[8]。黑色素細(xì)胞起源于神經(jīng)外胚層,但是能廣泛遷移至全身。由于黑色素細(xì)胞分布廣泛,人和哺乳動(dòng)物全身各個(gè)器官組織均有可能發(fā)生黑色素瘤。因此,抗黑色素瘤藥物的開(kāi)發(fā)迫在眉睫。本研究選擇MAPK15為藥物靶點(diǎn),篩選特異性的MAPK15納米抗體,并探究該納米抗體在B16-F10黑色素瘤細(xì)胞中的作用,以期為后續(xù)黑色素瘤的治療及藥物開(kāi)發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

B16-F10黑色素瘤細(xì)胞納米抗體文庫(kù)、大腸桿菌TG1、KM13噬菌體、pColdⅠ載體、B16-F10細(xì)胞均由本室保存,MAPK15多肽(義翹神州)、質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(康為世紀(jì)),SDS-PAGE凝膠試劑盒(索萊寶)、蛋白質(zhì)標(biāo)記物(marker)(賽默飛)、鼠抗HIS-HRP單克隆抗體(三鷹)、熒光定量PCR試劑盒(諾唯贊)、CCK8試劑盒(翊圣生物)、HPR-抗M13噬菌體抗體(義翹神州)、酶標(biāo)板(NEST)、TMB單組份顯色液、ELISA終止液(索萊寶)、鎳柱(Cytiva)。

1.2 MAPK15-VHH的篩選和鑒定

用20 μg/mL的MAPK15多肽包被免疫管,4 ℃過(guò)夜后用MPBS (PBS+2.5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h。將過(guò)夜復(fù)蘇的B16-F10黑色素瘤細(xì)胞納米抗體文庫(kù)用PEG-NaCl沉淀噬菌體,將噬菌體用MPBS孵育1 h。將封閉的噬菌體加入至封閉的免疫管,37 ℃孵育2 h,再用PBST洗管10次,此后再用PBS洗管10次。使用2 mL 100 mmol/L三乙醇胺溶液洗脫噬菌體,再加入2 mL Tris-HCl(1 mol/L, pH=7.4)中和。將洗脫的噬菌體轉(zhuǎn)移至16 mLA400=0.4 TG1菌液,37 ℃水浴30 min。噬菌體侵染TG1菌液后離心,用2YT培養(yǎng)基重懸菌體并涂布于2YTAG固體培養(yǎng)板,30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日將固體板上的菌落收集并加入15%甘油,命名為一級(jí)文庫(kù)菌,-80 ℃保存。經(jīng)過(guò)4輪篩選,從四級(jí)文庫(kù)菌培養(yǎng)板上挑取192個(gè)單克隆,將其轉(zhuǎn)到2塊96深孔板,30 ℃振蕩培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到2塊新96深孔板中,37 ℃振蕩培養(yǎng),剩余的菌液加入15%甘油保菌。轉(zhuǎn)接96深孔板加入KM13輔助噬菌體,過(guò)夜培養(yǎng)使噬菌體釋放至上清,將噬菌體與封閉液共同孵育1 h,在MAPK15多肽包被的酶標(biāo)板中加入封閉液處理過(guò)的噬菌體上清,使其進(jìn)行特異性結(jié)合,再孵育偶聯(lián)HRP的抗M13噬菌體抗體作為二抗進(jìn)行親和鑒定篩選。對(duì)ELISA結(jié)果進(jìn)行分析,以P/N≥3的克隆為陽(yáng)性,選擇陽(yáng)性反應(yīng)較強(qiáng)的菌株進(jìn)行測(cè)序,獲得序列,并將該納米抗體命名為MAPK15-VHH。

1.3 MAPK15-VHH的制備及鑒定

根據(jù)測(cè)序獲得的VHH序列設(shè)計(jì)克隆引物VHH-F、VHH-R(Table 1)進(jìn)行擴(kuò)增,以BamH Ⅰ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)插入pCold Ⅰ(含His標(biāo)簽)原核表達(dá)載體,構(gòu)建MAPK15-VHH重組質(zhì)粒并測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)菌株,并優(yōu)化IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度及轉(zhuǎn)速等條件。按照優(yōu)化的條件大量表達(dá)MAPK15-VHH,通過(guò)AKTA pure系統(tǒng)進(jìn)行純化并對(duì)純化后的MAPK15-VHH進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.4 MAPK15-VHH與MAPK15多肽親和力檢測(cè)

用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)MAPK15-VHH與MAPK15多肽的親和力。用MAPK15多肽以2 μg/mL濃度,100 μL/孔,4 ℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板。次日棄掉板內(nèi)液體,加3%BSA封閉液于37 ℃封閉1 h。將MAPK15多肽進(jìn)行一系列梯度稀釋(1.5-1～1.5-18),初始濃度為40 nmol/L。將50 μL 各梯度稀釋液與50 μL MAPK15-VHH(0.01 mg/mL)混合,37 ℃孵育30 min,作為ELISA檢測(cè)中的一抗。待酶標(biāo)板封閉結(jié)束,棄去板內(nèi)液體,將提前處理好的一抗加入酶標(biāo)板中,37 ℃孵育1 h。一抗孵育結(jié)束,棄去板內(nèi)液體,用PBST(PBS+0.05% Tween 20)洗板10次,加入稀釋后的鼠抗HIS-HRP單克隆抗體(1∶15 000)于37 ℃孵育1 h。孵育結(jié)束,PBST洗板10次后用TMB顯色15 min,用ELISA終止液終止顯色,最后用多功能酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光值。

Table 1 Primer Sequence

1.5 MAPK15-VHH檢測(cè)腦組織中絲裂原活化蛋白激酶15的表達(dá)

分別以正常小鼠腦組織蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)檢測(cè),以及正常小鼠腦組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析,以純化得到的MAPK15-VHH蛋白作為一抗,以鼠抗HIS-HRP作為二抗,從而檢測(cè)其中MAPK15在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量及定位情況。

1.6 MAPK15-VHH對(duì)B16-F10細(xì)胞增殖影響

將B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,過(guò)表達(dá)MAPK15 12 h,將細(xì)胞消化離心并重新接種于96孔板內(nèi)2 000個(gè)/孔,待細(xì)胞貼壁后向細(xì)胞內(nèi)分別添加不同濃度(0、20、40、60、80、100 μg/mL)的MAPK15-VHH,每孔添加CCK8 10 μL,從而確定MAPK15-VHH最佳作用濃度。

在過(guò)表達(dá)MAPK15的細(xì)胞中添加80 μg/mL MAPK15-VHH,作用24 h后收集細(xì)胞分別提取RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。以RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR),(引物見(jiàn)Table 1)檢測(cè)CREB、ERK、MEK1、MNK1的表達(dá)量。同時(shí)通過(guò)Western 印跡檢測(cè)以上基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量,以確定MAPK15-VHH對(duì)B16-F10細(xì)胞增殖的影響。

1.7 MAPK15-VHH對(duì)B16-F10細(xì)胞自噬的影響

利用提取的RNA和蛋白質(zhì)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western 印跡檢測(cè)自噬相關(guān)基因PI3K、AKT、mTOR和LC3B的表達(dá)情況(引物見(jiàn)Table 1),以確定MAPK15-VHH對(duì)B16-F10細(xì)胞自噬的影響。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)中涉及Western印跡結(jié)果用Image Lab 6.0軟件進(jìn)行灰度值分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行多組間兩兩比較,采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,其中雙側(cè)P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*P<0.05表明差異顯著,**P<0.01和***P<0.001代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 MAPK15-VHH的篩選和鑒定

以MAPK15多肽對(duì)B16-F10黑色素瘤細(xì)胞納米抗體文庫(kù)進(jìn)行4輪篩選,第4輪篩選結(jié)束隨即挑選192個(gè)單克隆進(jìn)行ELISA鑒定,鑒定結(jié)果表明,MAPK15納米抗體篩選以A450>2.2為陽(yáng)性克隆,共有75個(gè)克隆(Fig.1A)。

Fig.1 Screening, preparation, and identification of MAPK15-VHH (A) The affinity of the phage supernatant to MAPK15 polypeptide was determined by ELISA, and A450>2.2 was identified as a positive clone. (B) The BLAST result of the sequence of MAPK15-VHH recombinant plasmids and the reference to verify the accuracy of MAPK15-VHH. (C) Optimization conditions of MAPK15-VHH induced expression: the IPTG concentrations of 1 nmol/L, 0.8 nmol/L, 0.6 nmol/L, 0.4 nmol/L, 0.2 nmol/L, 0.1 nmol/L, 0 nmol/L respectively; Temperature of 15, 20, 28, and 37℃ respectively; speed of 200, 150, 100, and 50 r/min respectively; (D) The identification of MAPK15-VHH by SDS-PAGE with the band size of 15 kD

2.2 MAPK15-VHH的制備及鑒定

將陽(yáng)性反應(yīng)較強(qiáng)的克隆菌復(fù)蘇,將菌液送上海生工測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建MAPK15-VHH重組質(zhì)粒并測(cè)序,測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確(Fig.1B)。將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌,進(jìn)行優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,結(jié)果顯示,添加0.6 nmol/L IPTG,在15 ℃ 經(jīng)100 r/min 過(guò)夜誘導(dǎo)MAPK15-VHH表達(dá)量最高(Fig.1C)。通過(guò)Ni-NTA進(jìn)行親和層析,將純化好的MAPK15-VHH進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,其電泳條帶大小約15 kD(Fig.1D),與納米抗體預(yù)期相符合。

2.3 MAPK15-VHH對(duì)絲裂原活化蛋白激酶15多肽親和力檢測(cè)

通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)MAPK15-VHH與MAPK15多肽的親和力,制作A450值分別與MAPK15-VHH濃度和log[MAPK15-VHH濃度]的擬合曲線,結(jié)果顯示,擬合曲線內(nèi)基本每個(gè)點(diǎn)均在曲線上或者兩側(cè),曲線的R2=0.9976,說(shuō)明該曲線擬合良好。該曲線表明,制備的MAPK15-VHH抗體親和力KD=0.9829 (Fig.2A, B) 。

Fig.2 Measurement of the affinity of MAPK15-VHH to MAPK15 peptides (A) Fitting curve of A450 and MAPK15-VHH concentrations. (B) Fitting curve of A450 and log [MAPK15 VHH concentration]

2.4 MAPK15-VHH檢測(cè)腦組織中絲裂原活化蛋白激酶15的表達(dá)

通過(guò)MAPK15-VHH對(duì)正常小鼠腦組織中MAPK15的檢測(cè),其結(jié)果正如Fig.3所示,Western印跡檢測(cè)在60 kD附近有明顯且單一的條帶(Fig.3A);在免疫組織化學(xué)檢測(cè)可以觀察到,腦組織切片可以觀察到細(xì)胞質(zhì)中有強(qiáng)烈陽(yáng)性反應(yīng)(Fig.3B),說(shuō)明MAPK15-VHH與組織中的MAPK15有較好的親和性。

Fig.3 The detection of MAPK15 expression by MAPK15-VHH in brain tissues (A) MAPK15-VHH was used as the primary antibody in Western blotting to detect the protein level of MAPK15 in brain tissues of three wild-type mice. (B) MAPK15-VHH was used as the primary antibody in immunohistochemistry to detect the distribution of MAPK15 in brain tissues of three wild-type mice. PBS was used as the primary antibody in the NC group. The images were observed under 200× microscope

2.5 MAPK15-VHH抑制B16-F10細(xì)胞的增殖

在過(guò)表達(dá)MAPK15的B16-F10細(xì)胞中添加不同濃度的MAPK15-VHH,通過(guò)CCK8檢測(cè),結(jié)果表明,添加濃度為80 μg/mL 和100 μg/mL MAPK15-VHH對(duì)B16-F10細(xì)胞增殖抑制效果最明顯,但將80 μg/mL 與100 μg/mL MAPK15-VHH的作用效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果沒(méi)有顯著性差異,因此將80 μg/mL MAPK15-VHH視為最佳添加濃度(Fig.4A)。

Fig.4 MAPK15-VHH inhibited the proliferation of B16-F10 cells (A) Add 0, 20, 40, 60, 80, and 100 μg/mL MAPK15-VHH in the medium of B16-F10 cells overexpressing MAPK15, and cell proliferation was detected through CCK8 to determine the optimal concentration of MAPK15-VHH. (B) The mRNA expression of CREB, ERK, MEK1, and MNK1 proliferation-related genes in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC groups by qPCR. (C-D) Protein levels of CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, MEK1, p-MEK1, and MNK1 proliferation-related genes in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC by Western Blotting. In the quantitation, the protein level was analyzed by being normalized to β-actin, and the phosphorylated protein by being normalized to the total protein. MAPK15-OE represented the overexpression of MAPK15 in B16-F10 cells, MAP15-OE+VHH represented the addition of MAPK15-VHH in the medium of B16-F10 cells overexpressing MAPK15, and NC represented the wild-type B16-F10 cells. Data were presented as mean ± SD of the relative fold changes (n=3). *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001

對(duì)未添加、添加MAPK15-VHH和正常B16-F10細(xì)胞中CREB、ERK、MEK1、MNK1等增殖相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,與正常細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)MAPK15后CREB、ERK、MEK1、MNK1表達(dá)量分別增加67%、53%、86%和84%,且差異極顯著(P<0.001)。在過(guò)表達(dá)MAPK15的細(xì)胞中添加MAPK15-VHH,與NC組相比,CREB、ERK、MEK1、MNK1的表達(dá)量分別增加37%、30%、41%和33%,且差異極顯著(P<0.001);與僅過(guò)表達(dá)MAPK15的細(xì)胞相比,CREB、ERK、MEK1、MNK1表達(dá)量分別下降了17%、15%、24%、28%(Fig.4B)。

同樣,過(guò)表達(dá)MAPK15時(shí)對(duì)p-CREB、CREB、p-ERK、ERK、p-MEK1、MEK1、MNK1蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常細(xì)胞相比,這些增殖相關(guān)基因的蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量增加幅度均在80%以上,差異極顯著(P<0.001)。在添加MAPK15-VHH后,與正常細(xì)胞相比,p-CREB、CREB、p-ERK、ERK、p-MEK1、MEK1、MNK1這些增殖相關(guān)基因蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量分別增加了78%、92%、47%、66%、76%、93%、61%,差異極顯著(P<0.001);與僅過(guò)表達(dá)MAPK15的細(xì)胞相比,p-CREB的表達(dá)量下降了8%、p-ERK的表達(dá)量下降了22%、p-MEK1的表達(dá)量下降了9%,MNK1的表達(dá)量下降18%,但是CREB、MEK1的表達(dá)量變化僅1%(Fig.4C, D)。

2.6 MAPK15-VHH抑制B16-F10細(xì)胞的自噬

為探究MAPK15-VHH對(duì)B16-F10細(xì)胞自噬的影響,對(duì)未添加、添加MAPK15-VHH和正常B16-F10細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR、LC3B等自噬相關(guān)基因在mRNA水平表達(dá)量檢測(cè),結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)MAPK15時(shí)PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)量顯著降低(P<0.001),分別是正常細(xì)胞的42%、38%、35%,但是LC3B的表達(dá)量顯著升高(P<0.001),是正常細(xì)胞的1.48倍。添加MAPK15-VHH后,PI3K、AKT、mTOR表達(dá)量分別是正常細(xì)胞的60%、53%、58%倍,LC3B的表達(dá)量卻只有1.26倍;與僅過(guò)表達(dá)MAPK15的細(xì)胞相比較,PI3K、AKT、mTOR表達(dá)量分別增加43%,39%,65%,LC3B的表達(dá)量減少了15%(Fig.5A)。

Fig.5 MAPK15-VHH inhibited autophagy in B16-F10 cells (A) The mRNA expression levels of autophagy-related genes (PI3K, AKT, mTOR, and LC3B) in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC by qPCR (normalized to actin). (B-C) Protein levels of PI3K, p-AKT, AKT, mTOR and LC3B in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC groups by Western blotting. In the quantitation analysis, the protein level was analyzed by being normalized to β-actin, and the phosphorylated protein by being normalized to the total protein. MAPK15-OE represented the overexpression of MAPK15 in B16-F10 cells, MAP15-OE+VHH represented the addition of MAPK15-VHH in the medium of B16-F10 cells overexpressing MAPK15, and NC represented the wild-type B16-F10 cells. Data were presented as mean ± SD of the relative fold changes (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

過(guò)表達(dá)MAPK15時(shí)對(duì)PI3K、p-AKT、AKT、mTOR蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),PI3K、p-AKT、AKT、mTOR分別是正常細(xì)胞的43%、28%、83%和60%,差異極顯著(P<0.001),LC3B的表達(dá)量是正常細(xì)胞的1.41倍(P<0.001);添加MAPK15-VHH后,PI3K、p-AKT、AKT、mTOR分別是正常細(xì)胞的55%、60%、93%、92%(P<0.05或P<0.001),而LC3B的表達(dá)量為正常細(xì)胞的1.27倍(P<0.01);與僅過(guò)表達(dá)MAPK15的細(xì)胞相比較,PI3K、p-AKT、AKT、mTOR分別增加了27%、114%、12%、53%,而LC3B的表達(dá)量降低了10%(Fig.5B、5C)。

3 討論

納米抗體來(lái)源于駝科重鏈抗體的可變區(qū),是自然界中已知的最小的功能性抗體片段,其分子量約為15 kD[6]。本研究得到了MAPK15-VHH單克隆,KD值為0.9829,說(shuō)明該抗體具有較高的親和力;本文選擇正常小鼠的腦組織蛋白質(zhì)和石蠟切片,以MAPK15-VHH為抗體,可以有效的檢測(cè)出組織中MAPK15的分布;MAPK15-VHH應(yīng)用于Western 印跡,靈敏度較高,背景干凈,條帶單一。因此,本文篩選獲得的MAPK15納米抗體具有較高的親和性,同時(shí)提示可以作為科研抗體,應(yīng)用于MAPK15的功能研究。

MAPK15是MAP激酶家族中最后1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員[16],在大鼠睪丸、肝、大腦、胰腺、肌肉和人的肺、腎、乳房、大腦、胸腺、心血管等多個(gè)組織中均可以檢測(cè)到MAPK15 mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)[16-18]。近期有研究表明,MAPK15的活性和過(guò)表達(dá)受人類(lèi)致癌基因調(diào)控[3],分別與人結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[19]和人胃癌細(xì)胞的拷貝數(shù)增加有關(guān)[20,21],同時(shí)它也控制幾個(gè)核受體的活性[17,18]。在增殖細(xì)胞中,MAPK15在維持核抗原蛋白(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的穩(wěn)定性過(guò)程中所必需,是維持基因組完整性必需的[22]。此外,MAPK15強(qiáng)烈影響端粒酶活性,使該激酶在避開(kāi)復(fù)制衰老和永生細(xì)胞的機(jī)制中發(fā)揮重要作用[23]。本文在B16-F10細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MAPK15后,上調(diào)ERK、MEK1、MNK1、CREB的表達(dá)量,促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖。隨后在過(guò)表達(dá)MAPK15的黑色素瘤細(xì)胞中添加80 μg/mL MAPK15-VHH,發(fā)現(xiàn)以上細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)量顯著減少,說(shuō)明本文篩選獲得的MAPK15納米抗體可以靶向MAPK15,并達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的效果。

MAPK15也是自噬的有效調(diào)節(jié)因子,在缺乏MAPK15的情況下,基礎(chǔ)自噬和饑餓誘導(dǎo)的自噬都明顯受到影響[24]。MAPK15是血清和氨基酸饑餓誘導(dǎo)的關(guān)鍵激酶。在饑餓誘導(dǎo)條件下,細(xì)胞的自噬反應(yīng)增加并抑制相關(guān)蛋白質(zhì)分泌[25]。近期有文獻(xiàn)報(bào)道,MAPK15介導(dǎo)BCR-ABL誘導(dǎo)的自噬,并調(diào)節(jié)癌基因依賴(lài)的細(xì)胞增殖和腫瘤形成。MAPK15屬于自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的上游調(diào)節(jié)劑,其與LC3B協(xié)同刺激細(xì)胞自噬過(guò)程[21-23]。本文探究了MAPK15納米抗體是否能通過(guò)MAPK15對(duì)B16-F10細(xì)胞的自噬產(chǎn)生影響。在B16-F10細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)MAPK15時(shí)發(fā)現(xiàn),LC3B的表達(dá)量有了顯著的升高,但是在MAPK15-VHH的作用下,LC3B的表達(dá)又顯著降低,這表明MAPK15-VHH能夠抑制自噬囊泡對(duì)LC3B的募集,因而抑制B16-F10細(xì)胞的自噬過(guò)程。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是學(xué)者們認(rèn)可的抑制自噬啟動(dòng)和調(diào)節(jié)的經(jīng)典途徑[26],本文通過(guò)檢測(cè)PI3K、p-AKT、mTOR的表達(dá)量,在初期過(guò)表達(dá)MAPK15后發(fā)現(xiàn),這些基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)量均顯著升高,在添加MAPK15-VHH后又有明顯的降低。然而,PI3K、AKT、mTOR也會(huì)影響細(xì)胞增殖,對(duì)于這部分情況本研究中并未探討,這也是本研究的不足之處。

綜上所述,惡性增殖和失衡的自噬是黑色素瘤的重要特征,MAPK15-VHH能夠作為MAPK15的抑制劑,添加到過(guò)表達(dá)MAPK15的B16-F10細(xì)胞時(shí),顯著地抑制該細(xì)胞的增殖以及自噬。因此,MAPK15-VHH可作為抗黑色素瘤的潛在藥物,為黑色素瘤的治療提供新思路。

本研究成功的篩選得到1株親和力較強(qiáng)的MAPK15納米抗體,可作為Western印跡及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一抗,用于檢測(cè)MAPK15在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)及分布;此外,該MAPK15納米抗體可以作為MAPK15拮抗劑,有效地抑制B16-F10細(xì)胞的增殖和自噬進(jìn)程,為臨床檢測(cè)試劑和治療藥物的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。