張 淼，高興紅，胡 源

（1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430071；2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 5630062；3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院神經(jīng)心理科，湖北 武漢 430071）

慢性腦低灌注是阿爾茨海默?。╝lzheimer’s disease，AD）和血管性認(rèn)知障礙共同的病理生理基礎(chǔ)［1］。一項(xiàng)對(duì)1 171 名不同階段AD 患者的腦成像、血液、腦脊液等標(biāo)志物隨訪研究發(fā)現(xiàn)，腦低灌注在AD 中發(fā)生早于其關(guān)鍵病理標(biāo)志物-淀粉樣蛋白的沉積，且腦血流量的下降與疾病的進(jìn)展相關(guān)［2］。另一方面，頸動(dòng)脈粥樣硬化所致血管狹窄可能通過慢性腦低灌注引起血管性認(rèn)知障礙［3］。在頸動(dòng)脈狹窄患者中，通過手術(shù)進(jìn)行血管再通，恢復(fù)腦血流量可延緩血管性認(rèn)知功能損害的進(jìn)程［4］。本課題組及其他研究組發(fā)現(xiàn)，慢性腦低灌注能夠誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活［5，6］。但目前慢性腦低灌注中神經(jīng)炎癥的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，對(duì)此進(jìn)行動(dòng)物及細(xì)胞研究有助于相關(guān)癡呆類疾病的防治。

厚樸是一種傳統(tǒng)中藥，取自木蘭科植物的樹葉?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》描述厚樸：味苦，溫。主治中風(fēng)、傷寒、頭痛、寒熱、驚悸、氣血痹。多年來被中醫(yī)用于治療腦梗死及偏頭痛等病癥。和厚樸酚（Honokiol，HNK）是厚樸的主要活性成分之一，為一種小分子苯丙酸類脂溶性化合物，容易透過血腦屏障，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤的作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，HNK 可以激活內(nèi)源性的壓力感應(yīng)和抗氧化酶SIRT3，改善與手術(shù)有關(guān)的認(rèn)知和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷［8］。前期研究發(fā)現(xiàn)，HNK 能夠改善慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知損害和神經(jīng)損傷［9］，在本實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步構(gòu)建離體慢性缺氧模型，觀察HNK 對(duì)于慢性缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥通路和極化的影響，為癡呆防治提供新的藥物選擇和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HNK（MCE，HY-N0003）、氯化鈷（CoCl2，國藥集團(tuán)，10007216）、3-TYP（MCE， HY-108331）、小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系BV2 購于普諾賽生命科技有限公司（Procell Life Science&Technology Co.，Ltd.），酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）根 據(jù) 試 劑 盒 購 買 自Elabscience，Trizol 試劑 （Invitrogen， CA， US No.15596026），逆轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（Vazyme Biotech Co，Nanjing，China No.Q311-02）。去 乙 酰 化 酶3（SIRT3）、NLRP3、Caspase1 和Tubulin 一抗、相應(yīng)二抗均購買自Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、處理和觀察

BV2 完全培養(yǎng)基的組成：DMEM 高糖+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)；在缺氧條件和濃度篩選實(shí)驗(yàn)中，氯化鈷以不 同 濃 度（0 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）加入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)缺氧，和厚樸 酚 分 別 以 不 同 濃 度（3 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）加入培養(yǎng)基中。此后BV2 細(xì)胞分為4 組：正常組、氯化鈷組（模型組，氯化鈷濃度100 μmol/L）、慢性缺氧+HNK（濃度為10 μmol/L）、慢性缺氧+HNK+3-TYP 組（參考既往文獻(xiàn)［10］，濃度為5 μmol/L）。其中HNK 與3-TYP 均與氯化鈷同時(shí)加入，處理48 h。

1.3 ELISA 檢測炎癥因子水平

將各個(gè)試劑提前20 min 拿出復(fù)溫，將標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋后，與稀釋好的樣本依次加入預(yù)先包被抗體的酶標(biāo)條中，孵育1.5 h，隨后加入生物素化抗體孵育1 h，每孔洗滌3 遍后加入生物素化工作液37 ℃孵育30 h，依次洗滌5 遍后加入TMB 孵育10 min，加入終止液后立即于37 ℃預(yù)熱好的酶標(biāo)儀下以450 nm 波長檢測吸光度（OD 值）。

1.4 RT-PCR

吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清后，DPBS 洗滌細(xì)胞3 遍，隨后加入Trizol。加入氯仿12 000 r 15 min 4 ℃離心后小心吸取中間水相層，加入等體積異丙醇混勻后靜置10 min。 預(yù)先以DEPC 水配置75%乙醇，在12 000 r 10 min 4 ℃條件下離心后棄去上清后加入75%乙醇，再次7 500 r 15 min 4 ℃離心。棄去上清并小心吸去殘留乙醇，加入適量DEPC 水后55 ℃10 min 促溶解，Nanodrop 測定濃度。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 2 min 去除基因組DNA， 50 ℃ 15 min ，85 ℃ 5 s，4 ℃維持后完成逆轉(zhuǎn)錄。SYBR Green 熒光染料試劑盒構(gòu)建qPCR 體系，設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔。qPCR 條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s，循環(huán)反應(yīng) 95 ℃ 5 s -60 ℃（根據(jù)不同引物的 Tm 值進(jìn)行調(diào)整） 30 s，循環(huán)反應(yīng) 40次，溶解曲線 95 ℃ 30 s -60 ℃ 60 s -95 ℃ 15 s。引物序列見表1。

表1 各指標(biāo)PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequences for each indicator

1.5 Western blot 檢測

各組細(xì)胞離心后加入RIPA 裂解液，充分裂解后檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后混勻，金屬浴煮沸變性后上樣。根據(jù)蛋白濃度于SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行上樣，每孔20 μg 蛋白，設(shè)置電泳條件為75 V，30 min + 120 V，60 min，待溴酚藍(lán)近玻璃底邊時(shí)停止電泳，裁剪合適大小的PVDF 膜，200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜，根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適轉(zhuǎn)膜時(shí)間。轉(zhuǎn)膜后4 ℃冰箱內(nèi)一抗孵育過夜，次日漂洗后加入相應(yīng)HRP 二抗，室溫孵育1 h 后ECL 顯色。

1.6 ROS 測量

試劑盒采購自碧云天公司，將細(xì)胞接種并培養(yǎng)在96 孔板中，各組細(xì)胞用藥干預(yù)結(jié)束后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入適量DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L ，37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3～5 min 搖勻，使試劑與細(xì)胞充分混勻。孵育結(jié)束后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3 次，每次5 min，洗滌結(jié)束后使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm 處檢測熒光強(qiáng)度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Graphprism 9.5 統(tǒng)計(jì)軟件分析，ELISA 及PCR 數(shù)據(jù)將空白組設(shè)置為1，并以此對(duì)各組進(jìn)行歸一化處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示。多重比較采用單因素方差分析系，并采用Bonferroni 法進(jìn)行組間比較，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同氯化鈷慢性處理對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2 的影響

與對(duì)照組相比，50、75、100 μmol/L 濃度氯化鈷處理48 h 后BV2 細(xì)胞活性均無明顯降低，200 μmol/L 氯化鈷處理組細(xì)胞較對(duì)照組活性明顯降低（0 μmol/Lvs.200 μmol/L，t=4.16，P＜0.05），提示過度缺氧引起細(xì)胞死亡，見圖1A。與對(duì)照組相比，50、75、100 μmol/L 氯化鈷處理BV2 后，上清炎癥因子TNFα（t值分別為5.34、7.77、10.67，P＜0.05）及IL-1β（t值分別為5.07、5.48、11.99，P＜0.05）蛋白水平較對(duì)照明顯升高，選取其中炎癥因子水平最高的100 μmol/L 濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，見圖1B、1C。

圖1 慢性缺氧對(duì)BV2 細(xì)胞活性及炎癥因子的影響Fig 1 Effect of chronic hypoxia on BV2 cell activity and inflammatory factors

2.2 HNK 對(duì)慢性缺氧BV2 細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

使用ELISA 法檢測不同濃度HNK 對(duì)100 μmol/L 氯化鈷處理BV2 細(xì)胞培養(yǎng)液上清炎癥因子水平的影響。發(fā)現(xiàn)5 μmol/L 和10 μmol/L 濃度HNK 可顯著抑制氯化鈷誘導(dǎo)的BV2 炎癥因子TNFα（CoCl2vs.CoCl2+5 μmol/L HNK，t=7.76，CoCl2vs.CoCl2+10 μmol/L HNK，t=9.36，P＜0.05）與IL-1β（CoCl2vs.CoCl2+5 μmol/L HNK，t=4.72，CoCl2vs.CoCl2+10 μmol/L HNK，t=5.93，P＜0.05）釋放，見圖2，選取10 μmol/L 濃度HNK 作為后續(xù)處理的藥物濃度。

圖2 不同濃度和厚樸酚對(duì)慢性缺氧BV2 細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Fig 2 Effect of different concentrations and magnolol on the secretion of inflammatory factors in chronic hypoxic BV2 cells

2.3 HNK 抑制慢性缺氧條件下BV2 細(xì)胞M1 極化，該作用被3-TYP 逆轉(zhuǎn)

與對(duì)照組相比，慢性缺氧組BV2 細(xì)胞M1 極化標(biāo) 志 物CD86，iNOS的mRNA 水 平 和CD16/32 比值 明 顯 增 加（Controlvs.CoCl2，t值 分 別 為8.36、10.64、7.54，P＜0.05），M2 標(biāo) 志 物Arg-1和CD206的mRNA 水平下調(diào)（Controlvs.CoCl2，t值分別為6.16、5.22，P＜0.05），提示慢性缺氧成功誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1 極化。與氯化鈷組相比，慢性缺氧+HNK 組CD86，iNOS的mRNA 水 平 和CD16/32比值下調(diào)（CoCl2vs.CoCl2+HNK，t值分別為5.81、7.79、5.79，P＜0.05），而Arg-1和CD206的mRNA水平升高（t值分 別為4.59、7.15，P＜0.05），見圖3A，提示HNK 可抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1 極化，使之向M2 極化轉(zhuǎn)變；加入SIRT3 抑制劑3-TYP 后，HNK 對(duì)慢性缺氧BV2 細(xì)胞CD86、iNOS的mRNA 水平和CD16/32 比值下調(diào)（CoCl2+HNKvs.CoCl2+HNK+3-TYP，t值 分 別 為5.63、5.68、5.08，P＜0.05）、對(duì)Arg-1和CD206基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)作用（t值分別為4.58、7.59，P＜0.05），以及對(duì)炎癥因 子TNFα 和IL-1β 的 釋 放 抑 制 作 用（t值 分 別 為6.12、6.15，P＜0.05）均被逆轉(zhuǎn)，提示HNK 調(diào)節(jié)缺氧BV2 細(xì)胞極化作用為SIRT3 依賴性見圖3A、3B。

圖3 和厚樸酚對(duì)慢性缺氧BV2 細(xì)胞炎癥因子分泌及極化標(biāo)志物的作用被3-TYP 逆轉(zhuǎn)Fig 3 The effect of magnolol on the secretion of inflammatory factors and polarization markers in chronic hypoxic BV2 cells reversed by 3-TYPE

2.4 HNK 抑制慢性缺氧BV2 細(xì)胞誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞極化，該作用被3-TYP 逆轉(zhuǎn)

對(duì)照組BV2 細(xì)胞形態(tài)正常，呈類圓形；氯化鈷組BV2 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)梭形；與氯化鈷組相比，慢性缺氧+HNK 組細(xì)胞形態(tài)趨于正常，加入3-TYP 后HNK 對(duì)慢性缺氧BV2 細(xì)胞極化形態(tài)的抑制作用減弱，細(xì)胞再次出現(xiàn)梭形形態(tài)，見圖4A。SIRT3 為線粒體去乙酰化酶，具有抗氧自由基（ROS）形成作用，而后者與小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎性通路密切相關(guān)。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行SIRT3、ROS 和炎癥通路分子檢測，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，氯化鈷組SIRT3 蛋 白 表 達(dá) 顯 著 下 調(diào)（Controlvs.CoCl2，t=5.13，P＜0.05），而ROS 水 平、NLRP3 和Caspase1蛋 白 表 達(dá) 顯 著 升 高（Controlvs.CoCl2，t分 別 為4.63、6.40、9.13，P＜0.05）。與氯化鈷組相比，慢性缺氧+HNK 組細(xì)胞SIRT3 蛋白表達(dá)上調(diào)（CoCl2vs.CoCl2+HNK，t=5.06，P＜0.05），ROS 水 平、NLRP3 和Caspase1 蛋白表達(dá)顯著下降（t值分別為4.78、5.57、6.60，P＜0.05）。SIRT3 抑 制 劑3-TYP能逆轉(zhuǎn)HNK 對(duì)慢性缺氧BV2 細(xì)胞SIRT3 蛋白的上調(diào)（CoCl2+HNKvs.CoCl2+HNK+3-TYP，t=6.13，P＜0.05），以及對(duì)ROS 水平、NLRP3 和Caspase1 蛋白的下調(diào)作用（t值分別為5.00、5.25、5.78，P＜0.05），見圖4B，4C。

圖4 3-TYP 可逆轉(zhuǎn)和厚樸酚抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性極化作用Fig 4 Inhibition of magnolol reversed by 3-TYPE on chronic hypoxia induced astrocyte toxicity polarization effect

3 討論

慢性腦低灌注是AD 和血管性癡呆共同的病理基礎(chǔ)，其可促進(jìn)AD 或血管性癡呆的疾病進(jìn)程，對(duì)其進(jìn)行研究具有重要意義。HNK 是厚樸葉中的單體提取物，之前研究發(fā)現(xiàn)HNK 可改善慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知功能，減輕海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)［9］，本文進(jìn)一步探究HNK 抗炎作用的機(jī)制。

鈷可以造成細(xì)胞輕微缺氧，適合構(gòu)建長時(shí)間處理的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)長時(shí)間（48 h）處理時(shí)，0～100 μmol/L 氯化鈷并未引起小膠質(zhì)細(xì)胞死亡，且劑量依賴性增加其分泌的神經(jīng)炎癥因子；其中100 μmol/L 氯化鈷可體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)為活化的分支狀，且M1 型極化標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄增加。以上特征與其他研究報(bào)道的慢性腦低灌注動(dòng)物模型中小膠質(zhì)細(xì)胞生物行為類似［11］，因此通過氯化鈷慢性處理，可模擬在體慢性缺氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的類巨噬細(xì)胞，具有免疫防御作用。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后具有兩種表型，其中M1 型釋放大量炎癥因子，而且可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，后者釋放的毒性物質(zhì)可直接引起神經(jīng)損傷，進(jìn)而造成腦功能損害。M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞則具有神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)作用［12］。慢性腦低灌注模型小鼠胼胝體存在小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型極化，使用免疫抑制劑芬戈莫德可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化由M1 向M2 型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)白質(zhì)損傷修復(fù)［11］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞特異性的電壓門控氫離子通道，可降低慢性腦缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生，推動(dòng)M1 至M2 的表型轉(zhuǎn)換并改善白質(zhì)損傷［13］。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞M1 型極化在慢性腦低灌注性認(rèn)知損害中具有核心作用，針對(duì)其進(jìn)行干預(yù)是今后的重要研究方向。

SIRT3 是一種主要表達(dá)于線粒體的抗氧化酶，可通過去乙?；饔谜{(diào)控三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈的關(guān)鍵酶，實(shí)現(xiàn)抗氧化應(yīng)激作用［14］。既往研究表明，HNK 可激活SIRT3，增加其表達(dá)，并在包括抑郁、AD、術(shù)后認(rèn)知障礙等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中均具有抑制神經(jīng)炎癥的作用［8，15，16］。研究也發(fā)現(xiàn)，HNK 可抑制慢性腦低灌注大鼠海馬神經(jīng)損傷和認(rèn)知障礙，但具體機(jī)制尚不明確［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，HNK 可上調(diào)慢性缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞SIRT3 蛋白表達(dá)，降低ROS 和M1 標(biāo)志物CD86 和iNOS 的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)上調(diào)Arg-1、CD206 等M2 標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄，而使用SIRT3 抑制劑則以上作用消失。提示在慢性缺氧背景下，HNK 可通過SIRT3 促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型轉(zhuǎn)換。既往研究發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血大鼠海馬SIRT3 活性雖然下降，但總體蛋白表達(dá)無明顯變化［9］，而本研究作為體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞在慢性缺氧時(shí)SIRT3 表達(dá)下調(diào)，提示SIRT3 在慢性缺氧時(shí)表達(dá)調(diào)控可能具有細(xì)胞特異性。

NLRP3 小體為一種多蛋白復(fù)合物，由NLRP3蛋白、銜接蛋白ASC 和caspase1 前體蛋白組成，缺氧可影響小膠質(zhì)細(xì)胞電子傳遞鏈，從而于線粒體中產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)而使NLRP3 蛋白形成寡聚體并激活。激活的NLRP3 與銜接蛋白相互作用，促使caspase 1 前體轉(zhuǎn)化為caspase 1 效應(yīng)蛋白，后者可促進(jìn)多種炎癥因子的釋放，并可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和分泌神經(jīng)毒性成分［17］。本研究發(fā)現(xiàn)HNK 在降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的同時(shí)，可以抑制炎癥小體NLRP3和下游caspase1 效應(yīng)蛋白表達(dá)和M1 極化標(biāo)志物，且該作用為SIRT3 依賴性，提示ROS-NLRP3-caspase 1 通路可能為慢性缺氧條件下小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化的關(guān)鍵通路。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張淼：細(xì)胞培養(yǎng)、Elisa、PCR 實(shí)驗(yàn)與寫稿；高興紅：數(shù)據(jù)分析與寫稿；胡源：Western Blot 實(shí)驗(yàn)，寫稿、審稿與經(jīng)費(fèi)支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。