靳 帥，余一凡，宋佳華，李 濤，王 毅

（1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腎移植科，海南 ?？?70100；2.南華大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，湖南 衡陽421001）

目前臨床治療終末期腎病的最佳策略之一是進行腎移植手術，相對于長期透析治療，腎移植手術可以顯著提升患者的生活品質。盡管目前的手術技術和免疫抑制療法取得了進步，短時間內發(fā)生急性排斥反應的比例減少，但長期存活率仍然較低，即使經過了10 年的移植手術，也只有約50%死亡供體的捐獻器官和70%活體供體的捐獻器官的功能保持相對穩(wěn)定狀態(tài)［1］。因此，長期移植物存活依然面臨著重大挑戰(zhàn)。

慢性腎移植排斥反應（CKTR）的特征是腎移植功能進行性下降，在移植后一年開始顯現，通常伴有高血壓和蛋白尿［2］。CKTR 通常發(fā)生在免疫抑制不足或藥物不依從的患者中［3］。這是一個復雜的免疫過程，涉及細胞免疫反應和體液免疫反應，導致腎同種異體移植內的纖維化和血管病變，并且通常對當前的免疫抑制方案無效。慢性排斥反應帶來了巨大的臨床和社會經濟負擔，不僅影響移植受者，還影響全球醫(yī)療保健系統(tǒng)。目前慢性排斥反應的確切機制仍不完全清楚，阻礙了靶向治療和診斷生物標志物的開發(fā)。

近年來，生物信息學已成為破譯復雜生物過程和識別與疾病相關的分子特征的有力工具。生物信息學方法能夠整合多組學數據，例如基因表達譜、蛋白質-蛋白質相互作用和免疫細胞浸潤，從而可以全面分析慢性排斥反應所涉及的復雜相互作用和調控網絡［4］。通過將計算分析與實驗驗證相結合，生物信息學可以幫助發(fā)現有助于慢性排斥反應發(fā)展和進展的關鍵遺傳分子決定因素以及有助于識別與慢性排斥反應相關的特征基因和信號通路。慢性排斥反應相關的特征基因的研究可以為導致移植物功能障礙和最終移植物丟失的潛在免疫過程和分子途徑提供重要的見解。通過識別在慢性排斥反應期間失調的特定基因或基因網絡，研究人員可以更深入地了解所涉及的免疫機制，并可能確定治療或干預的新靶點。

本文旨在通過生物信息學分析探討腎移植后慢性排斥反應相關的特征基因。通過采用尖端的計算方法尋求識別在慢性排斥反應中失調的關鍵基因網絡、信號通路和免疫相關過程。通過整合不同的數據集，包括基因表達譜、免疫學標志物和免疫細胞浸潤分析，發(fā)現潛在的生物標志物和治療靶點，以提高腎移植的長期移植物存活率。這項研究的結果有可能增強對慢性排斥反應發(fā)病機制的理解，指導個性化的免疫抑制策略，并促進新型治療干預措施的開發(fā)。最終，這項研究可能有助于改善腎移植患者的預后和長期移植物存活率。

1 資料與方法

1.1 數據采集

在該研究中，從GEO 數據庫下載原始基因表達數據。選用腎移植術后大于1 年的患者（出現腎功能下降者分為排斥組，腎功能穩(wěn)定者作為對照組），經 過 篩 選，最 終 采 用4 個 數 據 集：GSE7392［5］、GSE181757［6］、GSE222889 以 及GSE21374（見 表1）。GSE7392、GSE181757、GSE222889 作為 訓練組的研究數據集，GSE21374［7］是一個具有臨床數據的數據集，用于進一步驗證所篩選出的基因的表達是否對移植物存活具有影響。

表1 來自GEO 數據庫的4 個腎移植后慢性排斥反應相關數據集的信息Tab 1 Information on four datasets related to chronic rejection after kidney transplantation from the GEO database

1.2 差異基因篩選

從GEO 數 據 庫 下 載GSE7392、GSE181757、GSE222889 移植后慢性排斥反應相關芯片，利用“Limma”R 軟件包篩選表達數據中排斥組和穩(wěn)定組之間的差異表達基因（DEGs）?！癓imma”是一個R軟件包，用于分析基因表達微陣列數據，使用線性模型設計的實驗和評估差異表達。以P＜0.05，log-FC（差異倍數 foldchange）的絕對值大于1 為篩選條件，分別獲得上調、下調基因。分別將三個數據集的上調、下調差異基因進行交集，結果用韋恩圖進行可視化展示，合適的DEGs 用于下一次分析，將篩選的DEGs 通過火山圖可視化。

1.3 功能富集分析

為了研究數據集中排斥組和穩(wěn)定組之間DEGs的顯著富集功能，并且為了更好地理解DEGs 中涉及的重要途徑，基因本體系統(tǒng)提供關于基因和基因產物功能結構化的、可計算的信息［8］。京都基因（GO）和基因組百科全書（KEGG）是一個廣泛使用的數據庫，用于基因功能的系統(tǒng)研究?；赗 軟件包clusterProfiler 進行功能富集分析，并通過Sangerbox 平臺可視化富集分析的結果，使用聚類圖表示。

1.4 加權基因共表達網絡分析與模塊基因選擇

采用系統(tǒng)生物學策略WGCNA 來探索基因之間的相關性，加權基因共表達網絡分析可用來研究生物芯片樣本中的相關關系，以及在不同的生物學環(huán)境中，找到合適的生物標記或治療目標［9］。將數據集GSE181757 中排斥組的免疫浸潤結果作為性狀進行WGCNA 分析。WGCNA 中使用的主要過程是樣本聚類以去除離群樣本、共表達網絡構建和相關模塊的識別。特征基因網絡最終被可視化。WGCNA 分析用于鑒定排斥組中免疫細胞的重要模塊。通過在線韋恩圖（Venn）進行相關基因和DEGs 的交叉得到的共同基因（CGs）以作下一步分析。

1.5 蛋白質互作網絡分析

使用上述方法篩選得到的CGs 將被導入Gene minia 數據庫，以構建蛋白質互作網絡圖并進行可視化展示。利用String 數據庫，可以通過設置最小互作評分大于0.7 的篩選條件，使用cytoscape3.10.0 進行可視化展示。同時，還可以計算節(jié)點的個數（node）以及連通度（degree）。利用cytoHubba 插件的MCC 算法，選擇聯通度最高的前4 個基因作為樞紐（Hub）基因。

1.6 Hub基因的表達、診斷效能和風險評估的驗證

從 GEO 數據庫下載 GSE21374 數據集用于驗證 Hub 基因表達。該數據集包含76 個出現排斥反應樣本和206 個腎移植后穩(wěn)定患者樣本，見表1。以P＜0.05，logFC（差異倍數 foldchange）的絕對值大于1 為篩選條件分別獲得上調和下調基因，最后再采用SPSS 26.0 制作Hub 基因的ROC 曲線來驗證該基因的診斷效能。用R 語言中的“survival”包進行比例風險假設檢驗，并進行擬合風險回歸，結果用“survminer”包以及“ggplot2”包進行可視化。

2 結果

2.1 移植后慢性排斥反應中DEGs 的鑒定

從GEO 數據庫中篩選出3 個合格的數據集（GSE7392、GSE181757、GSE222889）進行分析，將每個數據集中腎移植后大于1 年并出現腎功能下降的患者分為排斥組，腎功能穩(wěn)定的患者分為穩(wěn)定組，表1 列出了所選數據集的詳細信息。將每個數據集上調、下調的基因呈現在火山圖中（圖1A～C），為了獲取最有價值的DEGs，將三個數據集中的差異基因用韋恩圖可視化，共獲得了60 個DEGs（圖1D）。

圖1 差異基因（DGEs）的選擇Fig 1 Selection of differential genes

2.2 GO 分析和 KEGG 通路富集分析

通過“clusterprofiler”R 包進行功能以及通路富集分析，并對其進行了生物學分類。根據P值選前10 個顯著富集的生物過程（biological processes，BP）、分子功能（ molecular function，MF）和細胞組成（ cellular components，CC）以及KEGG 項可視化（圖2），其中GO 分析顯示，DEGs 在生物工程中顯著富集于刺激反應、免疫應答的調節(jié)、防御反應、免疫系統(tǒng)過程的調節(jié)等。DEGs 在細胞組成中顯著富集于主要組織相容性復合體、細胞膜、內質網膜、胞內小泡等。DEGs 在分子功能中顯著富集于肽類抗原的結合、異常糖鏈糖蛋白（TAP 蛋白）結合、信號受體的結合等。KEGG 分析結果顯示，DEGs 顯著富集在抗原處理和呈遞、EB 病毒感染、器官移植物抗宿主、同種異體器官移植排斥反應、自然殺傷細胞介導下的細胞毒性等。

圖2 GO 和KEGG 富集分析Fig 2 GO and KEGG enrichment analysis

2.3 WGCNA 和模塊分析

將GSE 181757 數據集中排斥組數據上傳到網站CIBERSORTx 中，用來分析22 種免疫細胞的浸潤。使用“WGCNA”R 包構建數據集GSE181757排斥組的表達譜加權基因共表達網絡，將數據集GSE181757 中的排斥組免疫浸潤結果作為性狀進行WGCNA 分析，為了構建無標度網絡，將軟閾值設置為B=10，并且log（k）和log（p（k））之間的相關系數大于0.9?？偣勃毩㈣b定了16 個模塊，并且灰色模塊指示不能聚簇成任何模塊的基因。將模塊和排斥組免疫細胞浸潤結果之間的相關性可視化（圖3A、B）?；赑 值的等級看到在棕色模塊中，CD4 記憶激活的T 細胞、抗原受體T 細胞以及巨噬細胞M1 型上調顯著。棕色模塊中共有628 個基因。

圖3 數據集GSE181757 疾病組的WGCNAFig 3 WGCNA of the GSE181757 disease group in the dataset

2.4 Hub 基 因 鑒 定 和PPI 分 析

將棕色模塊中的基因與上述的DEGs 交叉（圖4），得到36 個共同基因（CGs）作為用于下一分析的排斥相關基因，通過STRING 工具將這些基因進行PPI 網絡分析，并導入Cytoscape 軟件，利用 cyto-Hubba 的 MCC 算法，可以獲得分數最高的結果。HLA-A、HLA-B、HLA-F、TYROBP是具有高度集中性的基因，它們在基因網絡中扮演著關鍵的樞紐角色（圖5）。

圖4 WGCNA 棕色模塊與DEGs 交叉韋恩圖Fig 4 Cross Venn diagram of WGCNA brown module and DEGs

圖5 PPI 構建相互作用網絡Fig 5 PPI construction interaction network

通過使用“GeneMania”工具來預測關鍵基因功能和可能的相互作用網絡，構建了 1 個由 24 個基因組成的假定蛋白質-蛋白質相互作用網絡，其中包括Hub 基因HLA-A、HLA-B、HLA-F和TYROBP。PPI 網絡總共包含 690 個鏈接，網絡上的基因本體分析表明，24 個基因功能集中在MHCI 類抗原加工和呈遞、T 細胞介導的免疫調節(jié)、細胞殺傷的調控、抗原的加工、處理、呈遞及免疫反應的調節(jié)，與之前GO 富集和KEGG 富集分析相吻合，表明慢性排斥反應的發(fā)病機制可能在這些途徑中（圖6） 。

圖6 預測Hub 基因的功能相似的基因PPI 網絡Fig 6 Predicting the gene PPI network with similar functions of Hub genes

2.5 慢性排斥反應中Hub 基因的表達及診斷效能的驗證

為了進一步確認篩選出的4 個Hub 基因的準確性，還選擇了GSE21374 微陣列數據集進行了分析驗證。通過繪制火山圖來可視化篩選出的DEGs，發(fā)現這4 個Hub 基因都被歸類為上調基因（圖7）。使用SPSS 26.0 軟件制作ROC 曲線來驗證Hub 基因的診斷能力，根據曲線下面積在0.794～0.819 之間的結果，可以得出結論，這4 個Hub 基因都具有良好的診斷能力（圖8）。

圖7 數據集GSE21374 差異基因火山圖Fig 7 Dataset GSE21374 differential gene volcano map

圖8 4 個Hub 基因的ROC 曲線Fig 8 ROC curves of four Hub genes

2.6 Hub 基因對移植物存活的影響的驗證。

使用包含臨床數據的數據集GSE21374 進一步驗證特征基因是否對移植物存活有影響。將4 個Hub 基因在GSE21374 微陣列中的表達根據中位數分為高表達組和低表達組，根據結果（圖9），發(fā)現4個Hub 基因的移植物風險評估分析在ROC 曲線中P＜0.001，說明4 個基因都具有診斷意義，且風險比（hazard ratio，HR）值都大于1，說明4 個Hub 基因與慢性排斥反應呈正相關，即隨著時間的進行，表達量越高越容易發(fā)生排斥反應。

圖9 疾病風險預測曲線Fig 9 Disease risk prediction curve

3 討論

慢性排斥反應仍然是腎移植術后導致移植物功能障礙和最終移植器官失效的主要問題，了解慢性排斥反應的潛在機制對于改善患者預后和制定有針對性的治療策略至關重要。在這項研究中，采用生物信息學分析鑒定出四個樞紐基因HLA-A、HLA-B、HLA-F和TYROBP，結果顯著表明腎移植后的慢性排斥反應主要是由抗體介導的免疫排斥反應驅動的。

HLA-A、HLA-B、HLA-F和TYROBP是與人類免疫系統(tǒng)相關的基因。通路分析顯示，它們在免疫反應、抗原呈遞和細胞間信號傳導等過程中發(fā)揮重要作用。鑒定HLA-A、HLA-B作為樞紐基因具有特別重要的意義，因為這些基因編碼參與了抗原呈遞的主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ類分子［10］。MHC-Ⅰ分子廣泛表達于幾乎所有核細胞表面，將不同的肽抗原呈遞到CD8 T 細胞中，以廣泛監(jiān)測許多致病條件，參與免疫系統(tǒng)的抗原呈遞過程［11］。MHC Ⅰ類分子在免疫識別中起關鍵作用并與移植中的排斥過程密切相關［12，13］。在分析中，HLA-A和HLA-B表達的上調表明它們可能參與將供體抗原呈遞給T 細胞并引發(fā)細胞免疫反應。先前的研究表明，供體和受體之間不匹配的HLA 抗原可以引發(fā)免疫反應，導致供體特異性抗體（DSA）的產生［14］。這 些DSA 與 移 植 腎 臟 上 的MHC Ⅰ類 分 子結合，激活補體途徑并導致移植物損傷。因此，HLA-A 和HLA-B 表達的上調強烈支持抗體介導的免疫應答參與慢性排斥反應。

此外，分析還揭示了HLA-F 的上調，HLA-F 是HLA 基因家族中研究較少的成員。HLA-F于1990年由Geragthy 等［15］首次發(fā)現并表征。在近幾年的研究中，發(fā)現HLA-F與妊娠期間的免疫耐受和調節(jié)有關［16-18］。并且，在活化的免疫細胞（如B 細胞，T細胞，NK 細胞）、病毒感染的細胞和胰腺中含胰島素的胰島上檢測到HLA-F 細胞表面的表達［19-21］。雖然HLA-F在慢性排斥反應中的具體作用尚未完全了解，但其上調表明可能參與了調節(jié)免疫反應和促進移植物內的耐受性或炎癥。這需要進一步的研究來闡明HLA-F在抗體介導的慢性排斥反應中的確切作用及其作為治療靶點的潛力。

除了HLA基因外，分析還確定TYROBP這一個樞紐基因。TYROBP，也稱為DAP12，TYROBP蛋白通過與免疫細胞表面的配體結合，激活細胞內的酪氨酸激酶并啟動下游信號傳導路徑［22，23］。TYROBP與其配體的結合是免疫細胞的激活和調控的重要機制之一。TYROBP的編碼主要在巨噬細胞、NK 細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞中表達的跨膜信號多肽［24］。TYROBP對于單核吞噬細胞的存活，增 殖 和 功 能 至 關 重 要［25］。TREM1 和TREM2 是TYROBP的受體，炎癥反應可以通過TREM1-TYROBP 信號通路激活［26］。TYROBP也可以在T、B淋巴細胞的小亞群中表達。在人類細胞中，這兩類細胞的檢查位點KARAP 和KIR-S 由CD4+CD28-T 細胞表達，這些細胞在患有慢性炎癥性疾病 的 患 者 中 擴 增［27，28］。TYROBP 編 碼 參 與 免 疫 受體信號轉導途徑的適配器蛋白，包括NK 細胞受體和骨髓細胞受體，這些受體的激活可導致炎癥和免疫介導的損傷［29］。這都說明TYROBP的功能與自然殺傷細胞（NK 細胞）和巨噬細胞等免疫細胞的活化、細胞的凋亡途徑和炎癥反應等過程緊密聯系。在分析中，TYROBP表達的上調表明，先天免疫反應，特別是巨噬細胞、NK 細胞和骨髓細胞，可能在抗體介導的慢性排斥反應中起重要作用。然而，需要進一步的實驗研究來驗證TYROBP在腎移植樣本中的表達模式，并探索其在慢性排斥反應中的功能意義。

腎移植后慢性排斥反應主要是抗體介導的這一結論具有重要的臨床意義。這一發(fā)現強調了監(jiān)測和管理移植受者特意性抗體（DSA）產生的重要性。為預防或減少DSA 發(fā)生提供策略，例如優(yōu)化免疫抑制方案和量身定制HLA 匹配，可能有助于降低慢性排斥反應的風險并提高移植物的長期存活率。此外，可以探索針對抗體介導的免疫應答的治療干預措施，包括抗體耗竭療法或補體抑制劑，作為慢性排斥反應的潛在治療策略。

此外，HLA-A、HLA-B、HLA-F和TYROBP作為樞紐基因的發(fā)現也表明了治療靶向的潛在途徑。調節(jié)這些基因的表達或功能可以幫助調節(jié)免疫反應并降低慢性排斥的風險。例如，靶向HLA分子或與TYROBP 相關的下游信號通路的策略可能提供減少移植物損傷和改善長期結果的新方法。

雖然研究分析為慢性排斥反應的潛在機制提供了有價值的見解，但進一步的實驗驗證對于確認抗體介導的途徑的參與至關重要。對慢性排斥反應患者的腎活檢樣本進行免疫組織化學和流式細胞術分析可以提供移植物內抗體沉積和補體活化的直接證據。此外，全面的免疫學分析，包括DSA的評估以及免疫細胞群和細胞因子譜的分析，可以提供與慢性排斥反應相關免疫反應的更全面的理解。

雖然生物信息學分析強烈支持抗體介導的慢性排斥反應的假設，然而，仍需要進一步研究來驗證和拓展這些發(fā)現，如功能測定和動物模型，可以提供更直接的證據，證明這些樞紐基因的參與以及驅動慢性排斥反應的潛在機制。此外，慢性排斥反應的復雜性表明，其他因素和途徑也可能有助于其發(fā)展。細胞免疫反應、炎癥、內皮功能障礙和其他分子過程可能與抗體介導的途徑相互作用，促進移植物損傷和排斥反應。考慮不同免疫機制之間相互作用的綜合研究對于全面了解慢性排斥反應和制定有效的治療方案至關重要。

總之，生物信息學分析強烈支持這樣的結論，即腎移植后的慢性排斥反應主要由抗體介導的免疫 反 應 介 導。HLA-A、HLA-B、HLA-F和TYROBP的上調提供了對慢性排斥反應的分子過程的見解，并提出了潛在的治療靶點。通過進一步的實驗研究和臨床調查來驗證和擴展這些發(fā)現，最終改善腎移植患者的管理和預后結果。

作者貢獻度說明：

靳帥、余一凡：文章設計、數據分析及手稿撰寫；宋佳華：相關文獻搜集與整理，數據分析；李濤：文章格式檢查；王毅：提供整體思路和修改意見。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。