楊雪偉 袁賢達(dá) 田 越 孫琳琳 蔡 捷 孟 坤△ 邢國剛△

（1 北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)健委神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191；2 北京盛諾基醫(yī)藥科技股份有限公司，北京 102206；3 北京大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100034）

骨癌痛(bone cancer pain, BCP)是一種嚴(yán)重的慢性疼痛，通常由原發(fā)性骨癌或骨轉(zhuǎn)移所引起[1]。當(dāng)原發(fā)腫瘤發(fā)展到中晚期時(shí)，癌細(xì)胞侵襲骨組織并破壞骨結(jié)構(gòu)，會引發(fā)劇烈的骨癌痛[2]。許多腫瘤晚期會出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，特別是乳腺癌和前列腺癌[3]，骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的骨骼弱化，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的骨癌痛[4]。約80%的癌癥病人在疾病晚期會經(jīng)歷癌痛[5]，骨癌痛是晚期癌癥病人最常見的慢性疼痛類型之一[6]，嚴(yán)重影響病人的日常功能和生活質(zhì)量[7]。正確的癌痛治療可以顯著提高病人對治療的耐受性，改善生活質(zhì)量[8]。目前研究表明，骨癌痛的機(jī)制包括傷害性和神經(jīng)性成分，涉及外周、中樞和神經(jīng)膠質(zhì)調(diào)節(jié)以及破骨細(xì)胞的過度活化[9]。然而，癌痛的機(jī)制和疼痛信息的處理仍然不完全清楚，因此這是一個(gè)尚未滿足的醫(yī)療需求[10]。此外，超過一半的轉(zhuǎn)移性癌痛病人報(bào)告目前可用的藥物治療不足以充分緩解疼痛[11]。另外，骨癌痛通常使用阿片類藥物治療，雖然在急性疼痛的緩解上有效，但長期使用卻伴隨著一系列的不良反應(yīng)，如便秘、呼吸抑制、耐受性和成癮[12]。因此，開發(fā)新的治療藥物，既可以治療癌癥又可以控制癌痛，具有巨大的社會意義，是當(dāng)前亟待解決的重大問題。

淫羊藿素(icaritin, ICT)是一種異戊烯基黃酮類化合物，是中藥小檗科植物淫羊藿的主要活性單體成分，具有多種藥理和生物學(xué)活性[13]。近年來，淫羊藿素因其抗腫瘤作用而備受關(guān)注，包括抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌、腎癌、肺癌、卵巢癌和骨肉瘤等[14,15]。其具體作用機(jī)制包括激活TRAIL 或Fas-caspase-3/8凋亡途徑進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]，以及抑制晚期肝癌細(xì)胞中的IL-6/JAK/STAT3 通路，增強(qiáng)效應(yīng)T 細(xì)胞功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。最近，淫羊藿素已被中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于晚期肝癌的治療[18]。此外，研究表明淫羊藿素可以通過多種途徑和靶點(diǎn)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，干擾免疫細(xì)胞功能，發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[19]。淫羊藿素還具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用、骨保護(hù)作用和抗炎作用[20]。然而，關(guān)于淫羊藿素是否對骨癌痛具有鎮(zhèn)痛作用尚未見報(bào)道。本研究旨在通過構(gòu)建BCP 小鼠模型，探究淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，以及淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。通過測定BCP小鼠的機(jī)械痛閾、冷痛潛伏期以及自發(fā)痛閾，明確淫羊藿素以及淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，為淫羊藿素用于臨床治療癌痛的應(yīng)用提供重要指導(dǎo)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)使用8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠。實(shí)驗(yàn)動物由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供（動物許可證號：SYXK（京）2021-0064）。在SPF 條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境保持在25 ℃室溫，50%～60%的濕度，12 小時(shí)的光照/黑暗循環(huán)下，讓小鼠自由進(jìn)食和飲水。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照國際疼痛學(xué)會的指導(dǎo)方針進(jìn)行[21]，并經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)（動物倫理審批號：BCJB0019）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，盡量減少動物的不適和使用量。

2.主要試劑與儀器

淫羊藿素（由北京珅諾基醫(yī)藥科技股份有限公司提供）、嗎啡、胎牛血清、抗生素混合液、DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、超凈臺、恒溫細(xì)胞孵育箱、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、vonFrey 機(jī)械測痛儀、冷痛測痛儀、自發(fā)痛測痛儀。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞懸液制備

小鼠路易斯肺癌 (lewis lung carcinoma, LLC) 細(xì)胞系由國家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫北京協(xié)和細(xì)胞資源中心提供。本實(shí)驗(yàn)首先從液氮中取出LLC 細(xì)胞，在37℃水浴鍋中快速融化后，在37℃，5% CO2，含有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)成熟的LLC 細(xì)胞用PBS 洗滌3 次后，用0.25%胰蛋白酶消化3 min，隨后使用含有胎牛血清的DMEM 終止消化，并使用1000 轉(zhuǎn)離心3 分鐘后用PBS 重懸。將重懸的細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，并制備成濃度為4×106個(gè)/ml 的LLC 細(xì)胞懸液。

4.建立BCP 小鼠模型

采用Wang 等[22]報(bào)道的方法。首先，使用3 %異氟醚麻醉小鼠，暴露膝關(guān)節(jié)。用微量注射器將10 μl LLC 細(xì)胞懸液（4×106個(gè)/ml）緩慢注入小鼠左側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨髓腔內(nèi)，對照組僅注射等量PBS，注射后停針2 min。任何在腫瘤細(xì)胞接種后14 天表現(xiàn)出運(yùn)動缺陷或缺乏痛覺過敏反應(yīng)的小鼠以及在實(shí)驗(yàn)中死亡的小鼠均被排除在研究之外。

5.實(shí)驗(yàn)分組與流程

（1）將48 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為Na?ve組 (n= 16)、PBS 組 (n= 16)和BCP 組 (n= 16)。每組小鼠在接種LLC 細(xì)胞前（第0 天），以及在接種LLC 細(xì)胞后第3、7、10、14 和21 天，分別測定自發(fā)抬足次數(shù)和抬足保護(hù)時(shí)間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機(jī)械痛閾。

（2）將80 只小鼠制作成BCP 模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為7 組，在BCP 造模后第7 至14 天進(jìn)行淫羊藿素給藥，每日2 次（間隔12 h）共14 次，根據(jù)給藥劑量不同，7 組分別為Vehicle 組 (n= 11)、淫羊藿素 25 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 50 mg/kg組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg 組 (n= 11)、淫羊藿素 200 mg/kg 組 (n= 11)、淫羊藿素 400 mg/kg 組(n= 11)、淫羊藿素 800 mg/kg 組 (n= 12)。每組小鼠在接種LLC 細(xì)胞前（第0 天），在接種LLC 細(xì)胞后第3、7、10、14、15、16、18 和21 天，以及在停藥后（給藥第7 天，即BCP 造模后第14 天）第0 h、3 h、6 h、12 h、24 h 分別測定自發(fā)抬足次數(shù)和抬足保護(hù)時(shí)間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機(jī)械痛閾。

（3）將72 只小鼠制作成BCP 模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為8 組，在BCP 造模后第7 至14 天進(jìn)行淫羊藿素和嗎啡聯(lián)合用藥，每日2 次（間隔12 h）共14 次，根據(jù)給藥劑量不同，8 組分別為Vehicle組 (n= 9)、嗎啡10 mg/kg 組 (n= 9)、嗎啡20 mg/kg組(n= 9)、淫羊藿素 200 mg/kg 組 (n= 9)、淫羊藿素 200 mg/kg +嗎啡1 mg/kg 組(n= 9)、淫羊藿素 200 mg/kg +嗎啡2 mg/kg 組 (n= 9)、淫羊藿素200 mg/kg + 嗎啡4 mg/kg 組 (n= 9)、淫羊藿素200 mg/kg +嗎啡8 mg/kg 組 (n= 9)。每組小鼠在接種LLC 細(xì)胞前（第0 天），以及在接種LLC 細(xì)胞后第3、7、10、14、15、16、18 和21 天，分別測定自發(fā)抬足次數(shù)和抬足保護(hù)時(shí)間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機(jī)械痛閾。

（4）將84 只小鼠制作成BCP 模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為7 組，在BCP 造模后第7 至14 天進(jìn)行淫羊藿素和嗎啡聯(lián)合給藥，每日2 次（間隔12 h）共14 次，根據(jù)給藥劑量不同，7 組分別為Vehicle組(n= 12)、嗎啡10 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡1 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡2 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡4 mg/kg 組 (n= 12)、淫羊藿素 100 mg/kg +嗎啡8 mg/kg 組 (n= 12)。每組小鼠在接種 LLC 細(xì)胞前（第0 天），以及在接種LLC 細(xì)胞后第3、7、10、14、15、16、18 和21 天，分別測定自發(fā)抬足次數(shù)和抬足保護(hù)時(shí)間、冷刺激縮足潛伏期以及vonFrey 機(jī)械痛閾。

6.藥物配置與給藥

淫羊藿素的配置與給藥：分別對每只小鼠稱量體重，并根據(jù)體重計(jì)算每次給藥劑量，稱量相應(yīng)劑量淫羊藿素粉末，加入對應(yīng)體積的玉米油作為溶劑，使用震蕩混勻儀震蕩20 min 后靜置，用玉米油定容至固定體積后再震蕩10 min，隨后按照每次給藥劑量進(jìn)行分裝后放4℃保存。給藥方式為灌胃給藥，對照小鼠灌胃給予對應(yīng)體積的玉米油。

嗎啡配置與給藥：分別對每只小鼠稱量體重，并計(jì)算每次給藥劑量，稱量相應(yīng)劑量嗎啡粉末，加入對應(yīng)體積的PBS 作為溶劑，使用震蕩混勻儀震蕩5 min 后用PBS 定容至固定體積，隨后按照每次給藥劑量進(jìn)行分裝后放4 ℃保存。給藥方式為皮下注射，對照組小鼠皮下注射對應(yīng)體積的PBS。

7.痛行為學(xué)檢測

在安靜環(huán)境下，將小鼠置于底部為玻璃平臺的塑料隔室中，適應(yīng) 30 min 后開始測量。隨后在不給予任何刺激的情況下，記錄10 min 內(nèi)小鼠左足自發(fā)的抬足、舔足、甩足或者跛行的次數(shù)以及持續(xù)時(shí)間作為自發(fā)痛行為的判斷指征。

冷刺激行為學(xué)裝置用于測定冷痛潛伏期。在安靜環(huán)境下，將小鼠置于底部為玻璃平臺的塑料隔室中，適應(yīng) 30 min 后開始測量。將裝有干冰儀器置于玻璃平臺下方，垂直接觸小鼠左后爪下方玻璃。干冰接觸的最長時(shí)間設(shè)置為20 s，以防止不必要的組織損傷。對冷刺激的突然抬足、舔足、甩足被認(rèn)為是陽性反應(yīng)，每只小鼠進(jìn)行3 次測量，每次測量間隔至少10 min，記錄產(chǎn)生陽性反應(yīng)所需的時(shí)間，3次結(jié)果的平均值被記錄為冷痛潛伏期。

vonFrey 機(jī)械測痛儀用于測定機(jī)械痛閾。在安靜環(huán)境下，將小鼠置于底部為鐵絲網(wǎng)格的塑料隔室中，適應(yīng)30 min 后開始測量。vonFrey 纖維絲（0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0 和2.0 g）垂直施壓于小鼠左后爪正中央并保持5 s。對vonFrey 纖維絲刺激的突然縮抬足、舔足、甩足被認(rèn)為是陽性反應(yīng)，每個(gè)克數(shù)的細(xì)絲均測量5 次，每次測量間隔至少10 min，產(chǎn)生3 次陽性反應(yīng)所需的最小克數(shù)被記錄為機(jī)械痛閾。

在給藥期間，痛行為學(xué)檢測統(tǒng)一在當(dāng)天第1 次給藥后3 h 開始。在停藥期間，痛行為學(xué)檢測時(shí)間點(diǎn)與給藥期間保持一致。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，數(shù)據(jù)分析結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)采用雙因素重復(fù)測量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)。P＜ 0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.BCP 小鼠模型的建立及評價(jià)

為了評價(jià)BCP 小鼠模型的建立是否成功，分別在造模后第0、3、7、10、14、21 天進(jìn)行疼痛行為學(xué)測定。行為學(xué)結(jié)果顯示，與Na?ve 組及PBS 組相比，BCP 組小鼠在LLC 細(xì)胞接種后7～14 天，小鼠左側(cè)（荷瘤側(cè)）后爪對機(jī)械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)（見圖1A）以及對冷痛刺激的縮足潛伏期 (paw withdrawal latency,PWL)（見圖1B）均降低；而同側(cè)后爪的自發(fā)縮足次數(shù)和抬足保護(hù)時(shí)間增加（見圖1C, 1D），提示小鼠左側(cè)后爪出現(xiàn)了明顯的痛覺過敏，并且在行為學(xué)檢測至造模后第21 天，小鼠痛覺過敏仍持續(xù)存在。這些結(jié)果表明BCP 小鼠模型建立成功。

圖1 BCP 小鼠模型的建立及評價(jià)Fig.1 Establishment and assessment of a BCP mouse model

2.淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及EC50 測定

為了探究淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，給予不同劑量的淫羊藿素，檢測其對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并繪制時(shí)間-劑量效應(yīng)曲線。結(jié)果顯示，與Vehicle 組相比，從給藥后第3 天開始（即BCP造模后第10 天），給予淫羊藿素劑量在50 mg/kg以上的BCP 模型組小鼠，其左側(cè)（荷瘤側(cè)）后爪對MWT 以及對冷痛刺激的PWL 均明顯增加（見圖2A, 2B）。與Vehicle 組相比，從給藥后第7 天開始（即BCP 造模后第14 天），給予淫羊藿素劑量在50 mg/kg 以上的BCP 模型組小鼠，其同側(cè)后爪的自發(fā)抬足次數(shù)以及抬足保護(hù)時(shí)間均明顯減少（見圖2C, 2D）。這些結(jié)果表明，淫羊藿素對BCP 小鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

圖2 淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)Fig.2 The analgesic effect of icaritin on BCP mice

為了探究在停藥后24 h 以內(nèi)淫羊藿素對BCP小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，在BCP 模型組小鼠給予淫羊藿素7 天后，分別在停藥后第0 h、3 h、6 h、12 h、24 h進(jìn)行痛閾檢測。結(jié)果顯示，在停藥后24 h 以內(nèi)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，淫羊藿素均能增加BCP 小鼠同側(cè)后爪對MWT 和對冷痛刺激的PWL（見圖3A, 3B），并減少自發(fā)縮足次數(shù)和抬足保護(hù)時(shí)間（見圖3C, 3D）。結(jié)果表明，在停藥24 h 以內(nèi)淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)穩(wěn)定，無明顯波動。

圖3 淫羊藿素對BCP 小鼠停藥后鎮(zhèn)痛效應(yīng)及EC50 確定Fig.3 The analgesic effect of icaritin on BCP mice and the determination of EC50

為了進(jìn)一步確定淫羊藿素對BCP 小鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)的EC50(concentration for 50% of maximal effect)，選取在淫羊藿素停藥后第2 天（即BCP 造模后第15 天），測定小鼠同側(cè)后爪對MWT 以及冷痛刺激的PWL，分別繪制劑量-效應(yīng)曲線。結(jié)果顯示，淫羊藿素對BCP 小鼠機(jī)械痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)的EC50為68.22 mg/kg（見圖3E），對BCP 小鼠冷痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)的EC50為98.95 mg/kg（見圖3F）。綜合以上結(jié)果，提示淫羊藿素對BCP 小鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)的EC50約為70～100 mg/kg。

3.全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)聯(lián)合嗎啡用藥的鎮(zhèn)痛效應(yīng)

為了探究淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，使用2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯(lián)合用藥，并進(jìn)行痛閾檢測。機(jī)械痛行為學(xué)結(jié)果顯示，在BCP 造模后第10天以及第14 天，與單獨(dú)使用淫羊藿素(200 mg/kg)相比，淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯(lián)合用藥能夠提高淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)與10 mg/kg 嗎啡和20 mg/kg 嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)接近。此外，聯(lián)合用藥對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可以穩(wěn)定地持續(xù)至停藥后第7 天（見圖4A）。同樣地，冷痛及自發(fā)痛行為學(xué)結(jié)果也顯示，在BCP 造模后第10 天以及第14 天，與單獨(dú)使用淫羊藿素(200 mg/kg)相比較，淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯(lián)合用藥對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與200 mg/kg 淫羊藿素組以及10 mg/kg嗎啡組和 20 mg/kg 嗎啡組接近，并且在聯(lián)合用藥組，對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)也可以穩(wěn)定地持續(xù)至停藥后第7 天（見圖4B-D）。以上結(jié)果表明，2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯(lián)合用藥可以顯著延長停藥后對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)（即停藥后鎮(zhèn)痛效應(yīng)）。

圖4 全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)聯(lián)合嗎啡用藥的鎮(zhèn)痛效應(yīng)Fig.4 Analgesic effects of icaritin at a full-effect dose (200 mg/kg) in combination with morphine

4.半效劑量淫羊藿素(100 mg/kg)聯(lián)合嗎啡用藥的鎮(zhèn)痛效應(yīng)

為了探究淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥是否能夠減少嗎啡的用藥劑量，使用半效劑量淫羊藿素(100 mg/kg)與嗎啡聯(lián)合用藥。在造模后第14 天，分別測定各組小鼠同側(cè)后爪的機(jī)械痛閾（見圖5A）、冷痛閾（見圖5B）以及自發(fā)痛行為（見圖5C, 5D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg 淫羊藿素+ 4 mg/kg 嗎啡組以及100 mg/kg 淫羊藿素+ 8 mg/kg 嗎啡組對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)優(yōu)于100 mg/kg 淫羊藿素+ 1mg/kg 嗎啡組以及100 mg/kg 淫羊藿素+ 2 mg/kg 嗎啡組，并且前兩組的鎮(zhèn)痛效應(yīng)均能接近10 mg/kg 嗎啡組。以上結(jié)果提示，100 mg/kg 淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥，在達(dá)到10 mg/kg 嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)時(shí)，最多可以減少60%的嗎啡用藥劑量。

圖5 半效劑量淫羊藿素（100 mg/kg）聯(lián)合嗎啡用藥的鎮(zhèn)痛效應(yīng)Fig.5 Analgesic effects of icaritin at a half-effect dose (100 mg/kg) in combination with morphine

討 論

骨癌痛是由原發(fā)性骨腫瘤或骨轉(zhuǎn)移引起的癌性疼痛，被認(rèn)為是慢性疼痛中最嚴(yán)重和最難治療的類型之一[23]。研究表明，約四分之三的晚期癌癥病人經(jīng)歷過中重度疼痛[24]，并且約有一半以上的轉(zhuǎn)移性癌痛病人通過藥物治療無法緩解[11]。因此，迫切需要開發(fā)新的治療藥物用于減輕疼痛并提高生活質(zhì)量。建立與骨癌痛病人狀況相似的實(shí)驗(yàn)動物模型對開發(fā)針對骨癌痛的鎮(zhèn)痛藥物至關(guān)重要[25]。本研究采用Wang 等[22]報(bào)道的方法，將Lewis 肺癌細(xì)胞接種于小鼠股骨骨髓腔內(nèi)，以建立BCP 小鼠模型。該模型可部分還原骨癌痛病人的疼痛狀態(tài)，并可以比較好地用于模擬BCP 的發(fā)生機(jī)制，目前已經(jīng)在許多骨癌痛的臨床前研究中采納應(yīng)用。在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到，BCP 小鼠在造模后第7～21 天其荷瘤側(cè)后爪的MWT 和PWL 顯著低于對照組，且疼痛呈逐漸加重的趨勢。在造模后的第10 天至第21 天，BCP 小鼠自發(fā)抬足次數(shù)以及抬足保護(hù)時(shí)間顯著增加。綜合這些結(jié)果表明BCP 小鼠模型的成功建立。

已有研究表明，淫羊藿素具有強(qiáng)大的抗腫瘤[26]和抗炎[27]等作用，但迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在骨癌痛治療方面的相關(guān)研究報(bào)道。為了探究淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，我們選擇在小鼠BCP造模后第7～14 天灌胃給予淫羊藿素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在BCP 造模后第10～18 天明顯增加BCP 小鼠的MWT 和PWL，同時(shí)減少了自發(fā)抬足次數(shù)以及抬足保護(hù)時(shí)間，表明淫羊藿素對小鼠BCP 有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。為了評估淫羊藿素鎮(zhèn)痛效應(yīng)的持續(xù)性和穩(wěn)定性，本研究在小鼠BCP 造模后第14 天，即在第7 天給藥停止后的不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)進(jìn)行了疼痛行為學(xué)檢測，結(jié)果表明，在停藥后24 h 以內(nèi)，淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)相對穩(wěn)定，沒有明顯波動。因此，我們選取在淫羊藿素停藥后第2 天（即BCP 造模后第15 天），測定小鼠同側(cè)后爪對機(jī)械痛刺激的縮足閾值以及對冷痛刺激的縮足潛伏期，分別繪制了劑量-效應(yīng)曲線。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推斷出淫羊藿素對BCP 小鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)的EC50約為70～100 mg/kg。值得注意的是，淫羊藿素對機(jī)械刺激與冷刺激鎮(zhèn)痛效應(yīng)敏感性存在差異，這可能與淫羊藿素在不同痛敏行為中的作用靶點(diǎn)不同有關(guān)。

為了研究淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，本研究首先建立了BCP 小鼠模型，在BCP 造模后第7～14 天進(jìn)行給藥，分別給予嗎啡或淫羊藿素與不同劑量嗎啡聯(lián)合用藥。使用2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與不同劑量嗎啡聯(lián)合用藥，結(jié)果顯示，200 mg/kg 淫羊藿素與不同劑量嗎啡聯(lián)合用藥均對BCP 小鼠產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且與單獨(dú)給予嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)接近。這可能是因?yàn)?00 mg/kg 淫羊藿素已經(jīng)達(dá)到嗎啡最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)的相同效果（即天花板效應(yīng)），因此200 mg/kg淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥沒有顯著增強(qiáng)鎮(zhèn)痛效應(yīng)。然而，在停止給藥后（即在BCP造模后第14～21天），與單獨(dú)給予嗎啡或者淫羊藿素相比，200 mg/kg 淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)仍然持續(xù)存在。這些結(jié)果表明，2 倍EC50的全效劑量淫羊藿素(200 mg/kg)與嗎啡聯(lián)合用藥可顯著延長停藥后的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。需要注意的是，相同劑量的淫羊藿素在多次行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)存在差異，這可能與不同批次實(shí)驗(yàn)中小鼠的個(gè)體差異有關(guān)。

為了探究淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥在達(dá)到嗎啡最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)時(shí)可以減少的嗎啡用藥劑量，本研究采用半效劑量淫羊藿素(100 mg/kg)與不同劑量嗎啡聯(lián)合用藥。結(jié)果顯示，100 mg/kg 淫羊藿素與4 mg/kg 嗎啡以及8 mg/kg 嗎啡聯(lián)合用藥對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與10 mg/kg 嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)相似。因此，這些結(jié)果表明，100 mg/kg 淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥最多可以減少60%的嗎啡使用量，且達(dá)到與10 mg/kg嗎啡相同的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

本研究探究了淫羊藿素對BCP 小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)以及淫羊藿素與嗎啡聯(lián)合用藥的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。為了明確淫羊藿素對癌痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)的穩(wěn)定性，計(jì)劃使用KPPC小鼠模型[28]等不同癌痛模型進(jìn)一步進(jìn)行研究，以加深對淫羊藿素在癌痛治療方面的了解。此外，本文尚未深入探究淫羊藿素對BCP 小鼠鎮(zhèn)痛作用的潛在機(jī)制。未來將進(jìn)一步探究淫羊藿素對BCP 小鼠腫瘤的影響，并深入探討對淫羊藿素鎮(zhèn)痛效應(yīng)的具體機(jī)制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。