張雨婷 趙慧霞 孟 欣 趙佳樂 何曉園

1長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院,山西長(zhǎng)治,046000;2長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院皮膚科,山西長(zhǎng)治,046000

皮膚和腸道菌群參與機(jī)體免疫的建立,是許多促炎疾病的重要驅(qū)動(dòng)因素[1,2]。銀屑病和微生態(tài)菌群變化之間有著密不可分的聯(lián)系,菌群紊亂可能是導(dǎo)致銀屑病發(fā)生的關(guān)鍵因素[3,4]。與正常人群相比,銀屑病患者皮膚及腸道菌群多樣性改變,進(jìn)一步支持了腸-免疫-皮膚軸[5,6]的存在。為探討銀屑病皮膚及腸道菌群變化,我們?cè)炷ｃy屑病小鼠模型,收集皮膚、糞便樣本,采用16S rRNA高通量基因測(cè)序方法,檢測(cè)并分析菌群變化。皮膚及腸道菌群與宿主之間的相互作用將有助于探討銀屑病的發(fā)病機(jī)制,并為今后銀屑病微生態(tài)研究提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 構(gòu)造銀屑病小鼠模型 雄性BALB/c小鼠(SPF級(jí),5周齡,體重16～18 g,北京斯貝福生物技術(shù)有限公司)置于隔離環(huán)境中飼養(yǎng)。溫度23℃,濕度50%。所有動(dòng)物操作均通過長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

適應(yīng)環(huán)境1周后將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組納入6只。使用脫毛膏將全部小鼠背部毛發(fā)脫除。實(shí)驗(yàn)組小鼠背部皮膚涂抹咪喹莫特乳膏[IMQ,四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司,3 g/支,(批準(zhǔn)文號(hào))國(guó)藥準(zhǔn)字H20030129]62.5 mg/日,連續(xù)7天[7];對(duì)照組小鼠接受相同體積的凡士林(山東德州利康醫(yī)藥科技有限公司,300 g/盒),連續(xù)7天,見圖1。在此期間,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組在相同條件下飼養(yǎng),飼料、水、飼養(yǎng)溫度、濕度均無明顯差異。第8日麻醉后處死小鼠。

1a、1b:對(duì)照組;1c、1d:實(shí)驗(yàn)組

1.2 皮膚組織樣本采集 造模第8日,使用二氧化碳?xì)怏w麻醉機(jī)(PerkinElmer)將小鼠麻醉后,取背部皮膚組織,大小約1 cm×1 cm×2份,標(biāo)記為1號(hào)樣本、2號(hào)樣本。取樣后即刻將1號(hào)樣本放入無菌福爾馬林溶液固定,2號(hào)樣本放入無菌凍存管,置入-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆?。所有樣本均由同一?shí)驗(yàn)人員采集,嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則,避免實(shí)驗(yàn)標(biāo)本在采集過程中受其他菌群污染。

1.3 糞便樣本采集 造模第8日,采集兩組小鼠新鮮糞便,取樣后即刻分裝2 g糞便樣本于無菌凍存管,置入-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆?。采集過程及要求同前。

1.4 樣本處理 1號(hào)樣本送至長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院病理科,經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色等步驟,制作成石蠟切片,結(jié)果回報(bào)后閱片。

2號(hào)樣本及糞便樣本送至上海寶藤生物醫(yī)藥科技股份有限公司進(jìn)行檢測(cè),提取樣本中的細(xì)菌總DNA,對(duì)V3～V4可變區(qū)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,使用Illumina NovaSeq平臺(tái)行高通量測(cè)序,分類學(xué)分析得到代表序列的物種注釋結(jié)果。選用SILVA138數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),并在門、綱、目、科、屬、種分類水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成,分析兩組小鼠菌群多樣性、群落差異、組間物種及功能差異等[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0軼件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以(X±S)表示,正態(tài)分布樣本采用t檢驗(yàn),非正態(tài)分布樣本采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),組間差異分析采用χ2檢驗(yàn)、Anosim檢驗(yàn)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚組織病理 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組小鼠局部皮膚組織病理結(jié)果見圖2。

2a、2b:對(duì)照組;2c、2d實(shí)驗(yàn)組

實(shí)驗(yàn)組病理顯示:角化過度,顆粒層變薄或消失,棘層增厚,表皮突規(guī)則下延,真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張,周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)。符合銀屑病病理改變,造模成功。

2.2 小鼠皮膚組織菌群

2.2.1 α多樣性分析 通過計(jì)算每個(gè)樣本的α多樣性指數(shù),可以反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度、多樣性和均勻度。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組Shannon指數(shù)(P=0.1)、Simpson指數(shù)(P=0.1)、ACE指數(shù)(P=0.1)降低,而Chao 1指數(shù)(P=0.7)、goods_coverage(P=0.1)升高,如表1所示。各指數(shù)均P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但這些指數(shù)的數(shù)值表明銀屑病小鼠皮膚群落豐度和物種多樣性均略低。

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組皮膚微生態(tài)菌群α多樣性指數(shù)分析

2.2.2 β多樣性分析 β多樣性分析關(guān)注樣本間的菌群組成差異。結(jié)果顯示,加權(quán)距離Anosim檢驗(yàn)結(jié)果R=1,P=0.1。R>0,說明組間差異大于組內(nèi)差異,但P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們基于Bray-Curtis距離進(jìn)行PCoA分析,計(jì)算得不同分組因素對(duì)樣本差異的解釋度R=0.5767,分組顯著性P=0.1。分析結(jié)果,雖然P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍能說明菌群多樣性差異較大。

2.2.3 菌群組成分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組皮膚菌群豐度較對(duì)照組變化顯著。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中擬桿菌門、彎曲桿菌門、腸桿菌門、紅蝽菌綱、脫鐵桿菌綱、脫硫弧菌綱、梭狀芽孢桿菌目_UCG-014、毛螺菌目、理研菌科、瘤胃球菌科、副桿菌屬、丁酸桿菌屬、沙門氏菌種、耐久腸球菌種等的相對(duì)豐度降低,而厚壁菌門、芽孢桿菌綱、葡萄球菌目、巴斯德氏菌科等的相對(duì)豐度升高,乳桿菌目無明顯變化。因此,在門、綱、目、科、屬、種水平上,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,菌群豐度顯示有明顯差異。兩組樣本在各分類水平上的物種相對(duì)豐度柱狀圖、兩組間屬水平物種的聚類熱圖見圖3。

圖3 3a:門水平物種相對(duì)豐度柱狀圖;3b:綱水平物種相對(duì)豐度柱狀圖; 3c:目水平物種相對(duì)豐度柱狀圖; 3d:科水平物種相對(duì)豐度柱狀圖; 3e:兩組間屬水平物種的聚類熱圖

2.2.4 兩組群落差異分析(LefSe) 采用LefSe分析兩組的皮膚菌群組成、樣本所含菌群種類及各分類群的相對(duì)豐度差異,辨別對(duì)兩組間差異起決定作用的的物種。結(jié)果顯示小鼠皮膚菌群中,在綱水平,紅蝽菌綱、擬桿菌綱、彎曲桿菌綱、脫鐵桿菌綱、脫硫弧菌綱、芽孢桿菌綱在兩組樣本菌群的差異中起主要作用,在目水平,紅蝽菌目、擬桿菌目、黃桿菌目、彎曲菌目、脫鐵桿菌目、脫硫弧菌目、無膽甾原體目、丹毒絲菌目、乳桿菌目、葡萄球菌目起主要作用。見圖4。

圖4 皮膚菌群LefSe進(jìn)化分支圖

2.2.5 組間物種及功能差異分析(MetagenomeSeq) MetagenomeSeq利用線性模型找到對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組菌群差異所在,結(jié)果顯示,χ2=16.069,P=0.003,95%CI[0.098,0.393],兩組菌群在門、綱、目、科、屬、種水平均存在差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。較為顯著的是,小鼠皮膚菌群中,實(shí)驗(yàn)組中巴斯德菌科、葡萄球菌屬、關(guān)節(jié)桿菌科占優(yōu)勢(shì),而對(duì)照組中螺桿菌屬、擬桿菌屬、毛螺菌科占優(yōu)勢(shì)。見圖5。

2.3 小鼠腸道菌群

2.3.1 α多樣性分析 實(shí)驗(yàn)組腸道菌群Shannon指數(shù)(P=0.2)、Chao 1指數(shù)(P=0.4)、ACE指數(shù)(P=0.3)、goods_coverage(P=0.3)均降低,Simpson指數(shù)(P=0.2)無變化,如表2所示。各指數(shù)均P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但結(jié)果仍能顯示出銀屑病小鼠腸道群落豐度略高,而物種多樣性均略低。

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組腸道微生態(tài)菌群α多樣性指數(shù)分析

2.3.2 β多樣性分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加權(quán)距離Anosim檢驗(yàn)結(jié)果R=0.778,P=0.1。R>0,說明組間差異大于組內(nèi)差異,但P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；贐ray-Curtis距離的PCoA分析結(jié)果R=0.2712,分組顯著性P=0.1。雖然P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但菌群多樣性仍有差異。

2.3.3 菌群組成分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組腸道菌群豐度較對(duì)照組變化顯著。一些細(xì)菌的相對(duì)豐度降低,如擬桿菌門、腸桿菌門、變形菌門、α-變形菌綱、乳桿菌目、理研菌科、紫單胞菌屬、瘤胃球菌屬等,而其他細(xì)菌,如彎曲桿菌門、藍(lán)藻菌門、厚壁菌門、梭狀芽孢桿菌綱、毛螺菌目、念珠藻目、消化鏈球菌目、脫鐵桿菌科、脫硫弧菌科、瘤胃球菌科、丁酸桿菌屬、沙門氏菌種、埃希氏菌種等的相對(duì)豐度增加,而真桿菌科、螺桿菌屬等變化存在矛盾。因此,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比在各水平上菌群豐度均有差異。兩組在各分類水平上的物種相對(duì)豐度柱狀圖、兩組間屬水平物種的聚類熱圖。見圖6。

圖6 6a:門水平物種相對(duì)豐度柱狀圖; 6b:綱水平物種相對(duì)豐度柱狀圖; 6c:目水平物種相對(duì)豐度柱狀圖; 6d:科水平物種相對(duì)豐度柱狀圖; 6e:兩組間屬水平物種的聚類熱圖

2.3.4 兩組群落差異分析(LefSe) LefSe分析結(jié)果顯示,小鼠腸道菌群中,在綱水平,擬桿菌綱、脫鐵桿菌綱、脫硫弧菌綱、梭狀芽孢桿菌綱、α-變形菌綱在兩組樣本菌群的差異中起主要作用,在目水平,擬桿菌目、脫鐵桿菌目、脫硫弧菌目、乳桿菌目、梭狀芽孢桿菌目_vadinBB60群、毛螺菌目、念珠藻目、消化鏈球菌目、腸桿菌目起主要作用。見圖7。

圖7 腸道菌群LefSe進(jìn)化分支圖

2.3.5 組間物種及功能差異分析(MetagenomeSeq) MetagenomeSeq結(jié)果顯示,χ2=16.069,P=0.003,95%CI[0.098,0.393],兩組菌群在門、綱、目、科、屬、種水平均存在差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示小鼠腸道菌群中,實(shí)驗(yàn)組中顫螺旋菌科、毛螺菌科、毛螺菌屬_FCS020群、黏液螺旋菌屬、舍氏小螺菌種占優(yōu)勢(shì),而對(duì)照組中擬桿菌屬、鼠乳桿菌種占優(yōu)勢(shì)。見圖8。

3 討論

綜上所述,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,皮膚和腸道菌群的相對(duì)豐度均存在明顯差異,提示銀屑病小鼠存在微生態(tài)菌群失調(diào)。目前學(xué)者普遍認(rèn)為,正常情況下微生態(tài)菌群處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài),具有維持機(jī)體穩(wěn)定、抵御病原微生物入侵、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、調(diào)控營(yíng)養(yǎng)代謝等多種功能。菌群失調(diào)會(huì)使代謝產(chǎn)物釋放入血,引發(fā)免疫炎癥反應(yīng),進(jìn)而參與銀屑病的進(jìn)程[9-10]。

近年來多項(xiàng)研究報(bào)道,銀屑病患者存在不同程度的皮膚及腸道微生物群紊亂,提示菌群變化可能在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[11-12]。本研究中,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,在門、綱、目、科、屬、種水平上,皮膚和腸道菌群相對(duì)豐度均存在顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LefSe分析表明,小鼠皮膚菌群中紅蝽菌綱、擬桿菌綱、乳桿菌目、葡萄球菌目等起主要作用,腸道菌群中擬桿菌綱、梭狀芽孢桿菌綱、腸桿菌目、毛螺菌目等起主要作用。MetagenomeSeq分析結(jié)果顯示,銀屑病小鼠皮膚菌群中巴斯德菌科、葡萄球菌屬、關(guān)節(jié)桿菌科等占優(yōu)勢(shì),而腸道菌群中顫螺旋菌科、毛螺菌科、毛螺菌屬_FCS020群、黏液螺旋菌屬、舍氏小螺菌種等占優(yōu)勢(shì)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前多項(xiàng)關(guān)于銀屑病菌群研究的結(jié)果基本一致。Hidalgo-Cantabrana等[13]的研究顯示,銀屑病患者腸道中厚壁菌門的比例顯著升高,而擬桿菌門、嗜黏蛋白阿克曼菌屬、瘤胃球菌屬、普拉梭菌種降低,同時(shí),厚壁菌門/擬桿菌門比值與銀屑病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14]。我們的實(shí)驗(yàn)中銀屑病小鼠腸道厚壁菌門、擬桿菌門、瘤胃球菌屬的變化與Hidalgo-Cantabrana等的研究結(jié)果相同,但普拉梭菌屬在銀屑病小鼠腸道中無明顯變化。Wang等[15]對(duì)27例銀屑病樣本和54例對(duì)側(cè)非皮損皮膚及健康皮膚樣本進(jìn)行了菌群成分的測(cè)序和分析,結(jié)果顯示,銀屑病皮膚樣本菌群α多樣性和β多樣性顯著低于健康人群,且不動(dòng)桿菌、假單胞菌、沙門氏菌、芽孢桿菌的豐度較健康人群皮膚明顯降低,本實(shí)驗(yàn)中也顯示出相似的結(jié)果,但銀屑病小鼠皮膚中不動(dòng)桿菌的變化不明顯。Zhang等[16]的研究結(jié)果也相似,且與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這些結(jié)果差異可能與銀屑病患者容易受到外界環(huán)境影響或與飲食結(jié)構(gòu)不同有關(guān),導(dǎo)致部分菌群受干擾,而小鼠在相同環(huán)境下飼養(yǎng),受干擾的因素較少。但總體而言,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和之前的研究基本一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的可信度。

我們通過成功構(gòu)建咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型,采用16S rRNA高通量測(cè)序比較并分析了銀屑病小鼠與正常小鼠皮膚及腸道中菌群差異,并與目前已公開發(fā)表的關(guān)于銀屑病患者菌群變化的結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析,提示銀屑病患者存在明顯的皮膚及腸道菌群變化,菌群相對(duì)豐度及多樣性發(fā)生改變。其原因可能與銀屑患者皮膚屏障受損有關(guān),動(dòng)態(tài)平衡被破壞,增加了致病菌感染的風(fēng)險(xiǎn),通過腸道進(jìn)入機(jī)體,進(jìn)而腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂,影響相關(guān)炎癥因子釋放和免疫應(yīng)答,導(dǎo)致疾病的發(fā)生,但具體發(fā)生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

然而,我們的實(shí)驗(yàn)也存在不足之處,一是實(shí)驗(yàn)樣本量較小,二是檢測(cè)的菌群數(shù)量有限。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,皮膚及腸道微生態(tài)菌群對(duì)銀屑病的影響仍需更深入剖析。菌群變化對(duì)銀屑病慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展具有重要意義,調(diào)節(jié)皮膚、腸道菌群可能成為銀屑病的替代治療方式。我們將繼續(xù)進(jìn)一步探索皮膚、腸道菌群與銀屑病的關(guān)聯(lián),為今后研究銀屑病、研發(fā)新型治療藥物提供新的策略,皮膚及腸道菌群作為治療銀屑病新的靶點(diǎn),可能將在銀屑病的診療中發(fā)揮舉足輕重的作用。