馮亞文,張秋娜,吳 蘭,陳 靜,張 娜,李會平,張培訓,安莎莎,孔紅君

(1.河北省獸藥飼料工作總站,石家莊 050000;2.保定冀中生物科技有限公司,河北 保定 071000;3.保定冀中藥業(yè)有限公司,河北 保定 071500; 4.河北省中獸藥技術創(chuàng)新中心,河北 保定 071500)

玉屏風口服液源于元代《丹溪心法》,具有益氣固表,提高機體免疫力的功能;主治表虛不固,易感風邪。由保定冀中藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)的玉屏風口服液于2010年獲得新獸藥證書,至今上市已超過12年,現(xiàn)收錄于《中華人民共和國獸藥典》2020年版二部。

該制劑臨床使用安全有效,但隨著時代的發(fā)展,其原有的質(zhì)量標準也需要進一步優(yōu)化提升。查閱文獻,近年來,廣大學者[1-8]對玉屏風散、玉屏風口服液、玉屏風顆粒等人用藥品進行深入的多指標含量測定及指紋圖譜研究,多集中于黃酮-色原酮藥效物質(zhì)群?？梢娖湓匈|(zhì)量標準收載的黃芪甲苷的含量測定過于片面,無論是藥效還是物質(zhì)基礎都已不能滿足對產(chǎn)品品質(zhì)提升的需求。

研究中,采用高效液相色譜(HPLC)法同時對玉屏風口服液中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行定量檢測,同時優(yōu)化原有質(zhì)量標準中的薄層鑒別項,為全面提升玉屏風口服液的質(zhì)控標準提供了依據(jù),也實現(xiàn)了提升產(chǎn)品品質(zhì)、保證療效、提高養(yǎng)殖戶用藥認可度的目標。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 e2695高效液相系統(tǒng),2489UV檢測器,Empower3色譜工作站(美國Waters公司)、CPA225D電子分析天平(德國Sartorius公司)。色譜柱:SymmetryC18(5 μm 4.6×250 mm)。

標準品:升麻素苷(批號:111522-201913,純度為94.6%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號:111523-201811,純度為97.4%)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號:111920-201907,純度為96.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈(Merck公司,色譜純),磷酸(天津市致遠化學試劑有限公司,色譜純),水為超純水。

玉屏風口服液樣品共計6批,保定冀中藥業(yè)有限公司3批,批號為202201002、202205003、202205004;保定冀中生物科技有限公司3批,批號為202201001、202202005、202201002。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(5 μm 4.6 mm×250 mm);乙腈為流動相A,0.2%磷酸溶液為流動相B。按表1梯度洗脫;檢測波長為254 nm,流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃;進樣體積10 μL。

表1 梯度洗脫方法Tab 1 Gradient elution method

1.2.2 對照品溶液的制備 分別取升麻素苷對照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量,精密稱定,加50%甲醇定容至刻度,制得濃度分別為400、400、200 μg/mL的儲備液。再分別精密量取各個對照品儲備液,加50%甲醇制成每1 mL含升麻素苷20 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷20 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷10 μg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取玉屏風口服液2 mL,置25 mL容量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,搖勻,用0.22 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.4 陰性玉屏風口服液的制備 參照《中華人民共和國獸藥典》2020版二部,分別制備缺黃芪和缺防風的陰性玉屏風口服液。

2 結(jié)果和分析

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性 通過對比玉屏風口服液樣品和自行制備的陰性樣品,記錄色譜圖,結(jié)果表明在與升麻素苷對照品(保留時間9.842 min)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(保留時間21.543 min)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(保留時間14.390 min)保留時間一致處,玉屏風口服液中均見相對應的色譜峰。同時各陰性樣品在與3種對照品保留時間一致處無干擾,見圖1～圖4。因此,該方法的專屬性良好。

圖1 混合對照品高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of mixed standards

圖2 玉屏風口服液高效液相色譜圖Fig 2 HPLC of Yupingfeng Oral Liquid

圖3 缺防風陰性樣品高效液相色譜圖Fig 3 HPLC of negative Fangfeng sample

圖4 缺黃芪陰性樣品高效液相色譜圖Fig 4 HPLC of negative Huangqi sample

2.1.2 線性 精密稱取升麻素苷對照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量,精密稱定,分別加50%甲醇制成每1 mL含升麻素苷381 μg、含5-O-甲基維斯阿米醇苷354 μg、含毛蕊異黃酮葡萄糖苷203 μg的對照品溶液儲備液,備用。

分別取三種儲備液各1 mL分別置100、50、20、10、5 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成線性1～5的混合對照品溶液;分別取三種儲備液各3 mL,置10 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成線性6的混合對照品溶液,即得升麻素苷濃度為3.81、7.62、19.05、38.10、76.20、114.30,5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度為3.54、7.08、17.70、35.40、70.80、106.20,毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為2.03、4.06、10.15、20.30、40.60、60.90 μg/mL的標準曲線溶液。照1.2.1液相條件測定,并計算回歸方程和相關系數(shù),見表2。

表2 三種對照品的線性關系考察Tab 2 Linear relationship investigation of three comparasites

2.1.3 精密度 取供試品溶液,連續(xù)進樣6次測定。經(jīng)計算升麻素苷對照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品的峰面積RSD分別為0.94%、0.95%、0.86%,表明該方法精密度良好。

2.1.4 重復性 按1.2.3項下方法制備6份供試品溶液,測得該批產(chǎn)品中黃升麻素苷對照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品的平均含量分別為0.156、0.230、0.121 mg/mL,RSD分別為0.57%、0.43%、0.62%,結(jié)果表明該方法的重復性良好。

2.1.5 溶液穩(wěn)定性 取2.1.4項下的同一份供試品溶液,分別于0、4、6、8、10、12、18、24 h進樣測定,測得升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.77%、1.67%、1.70%,結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 準確度 精密量取已知含量的玉屏風口服液1 mL,置25 mL容量瓶中,加入0.156 mg/mL的升麻素苷對照品溶液,0.230 mg/mL的5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液和0.121 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液各1 mL,加50%甲醇定容至刻度,搖勻,過濾,即得。照上述供試品方法制備6份供試品溶液,照1.2.1所述方法進行測得,計算平均加樣回收率,結(jié)果見表3。3種物質(zhì)的加樣回收率均在96%～102%之間,相對標準偏差均小于2.0%。

表3 玉屏風口服液3種成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab 3 Recovery results of 3 compands in Yupingfeng oral liquid(n=6)

2.2 含量測定 分別取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量,加50%甲醇稀釋成每1 mL含升麻素苷20 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷20 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷10 μg的混合對照品溶液。按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液,供試品溶液和對照品溶液各進10 μL,以“1.2.1”項下色譜條件檢測,記錄色譜圖,計算含量,結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果Tab 4 The results of the sample content

3 討論與結(jié)論

3.1 標準來源與追溯 玉屏風口服液歷次標準修訂過程中,主要是對【鑒別】(1)(3)進行了修訂,《獸藥質(zhì)量標準》2017年版中藥卷刪除【鑒別】(3)“采用5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品HPLC法鑒別防風”,在【鑒別】(1)增加了“采用5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品用于TLC法防風的鑒別”,并沿用至今,具體見表5。

表5 玉屏風口服液質(zhì)量標準對比表Tab 5 The Comparison table of the Yupingfeng oral liquid

本研究中,注重藥效物質(zhì)基礎的關系,擬將防風、黃芪中的有效成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行定量檢測,同時用于薄層鑒別研究,進一步豐富了檢測指標,提升了質(zhì)量控制標準。

3.2 全面性 相比單一指標性成分(黃芪甲苷),藥效組分群含量測定可更好地表達玉屏風口服液的總體功效。查閱大量文獻,發(fā)現(xiàn)玉屏風制劑中的研究多集中在黃酮-色原酮組分群[1-3],黃酮-色原酮-內(nèi)酯組分群[4-7],目標成分多見于毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、芒柄花苷、芒柄花素、白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯II、白術內(nèi)酯III,共計11種。

在諸多成分中,申亞君[8]等通過建立玉屏風散的HPLC指紋圖譜,分別對上述11種成分進行進行聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn),各批次樣品之間的質(zhì)量差異導致15批樣品聚為2類,并進一步通過正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)得出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷是對玉屏風散整體質(zhì)量影響較大的5種成分。但是鑒于前期研究中發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮、芒柄花素均低于0.05 mg/mL,因此本研究中僅對毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷的含量測定進行研究。

3.3 與藥效相關性 毛蕊異黃酮葡萄糖苷(CG)是黃芪藥材中的異黃酮成分。現(xiàn)代藥理學研究表明,CG能夠明顯對抗4刀豆蛋白A(ConA)誘導的T淋巴細胞增殖和脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞毒性,具有免疫抑制和抗炎作用[9]。姜文月等[10]采用Spearman雙變量相關分析對化學成分與其增強免疫藥效的譜效相關性進行分析,發(fā)現(xiàn)CG含量與脾臟指數(shù)呈顯著正相關,是有免疫增強功能的主要藥效物質(zhì)。此外,CG還具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理功效。

3.4 結(jié)論 綜上所述,本方法采用高效液相色譜(HPLC)法同時對玉屏風口服液中的黃芪和防風進行定量分析,經(jīng)驗證定量準確、快速、重復性好,為提升玉屏風口服液質(zhì)量控制的全面性提供了方法。