李春玲,牛莎莎, 牛 春,石彥鵬,張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司, 銀川 750101)

紅霉素(Erythromycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,其分子式為C37H67NO13,由放線菌屬(Actinomycetes)紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)通過次級代謝途徑生成[1-3]。紅霉素及其半合成衍生物阿奇霉素(Azithronmycin)、甲紅霉素(Clarithromycin)、地紅霉素(Dirithromycin)、羅紅霉素(Roxithromycin)、氟紅霉素(Flurithromycin)等,對革蘭氏陽性菌具有較好抗性作用,常用于對青霉素耐藥的革蘭氏細(xì)菌感染及對青霉素過敏的患者,是軍團(tuán)菌肺炎、支原體肺炎、沙眼衣原體所致的嬰兒肺炎及結(jié)腸炎,皮膚軟組織感染的首選藥,應(yīng)用較為廣泛,生產(chǎn)前景廣闊[4-7]。

紅霉素主要通過工業(yè)發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn),但目前國內(nèi)發(fā)酵效價(jià)一般為4000～5000 mg/mL,與國外水平8000～12000 mg/mL相比,還存在較大差距,究其原因主要在于缺少優(yōu)良的發(fā)酵菌株和適宜發(fā)酵條件。因此,優(yōu)良菌株選育以及配套發(fā)酵條件優(yōu)化是解決這一問題的有效途徑。劉峰等[8]通過UV(紫外誘變)誘變,選育出一株發(fā)酵效價(jià)增加10%的菌株F1-57,并通過添加前體物等措施優(yōu)化了發(fā)酵條件,大幅提高了發(fā)酵水平。楊雪清[9]利用紅霉素堿作為誘變劑篩選出紅霉素耐受性突變株 LJ-12-2,其發(fā)酵效價(jià)增加10.8%。孟祥學(xué)等[10]運(yùn)用UV(紫外誘變)誘變選育出一株效價(jià)增加20%的菌株。趙宏圖[11]綜合運(yùn)用離子注入技術(shù)、UV誘變、鹽酸輕胺誘變開展紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)菌株的選育,并對發(fā)酵條件系統(tǒng)優(yōu)化,使發(fā)酵效價(jià)達(dá)到8500 mg/mL。另外,卞晨光等[12]、劉曉宏等[13]、Zou等[14]開展了發(fā)酵條件優(yōu)化研究,大幅提高了紅霉素發(fā)酵效價(jià)。但是,整體而言當(dāng)前國內(nèi)紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)還處于較低水平,亟待提升。鑒于此,本研究以引進(jìn)保存的產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)SE-2207菌株作為原始菌株,利用EMS(甲基磺酸乙酯)、UV以及ARTP(常壓室溫等離子體誘變)誘變的方法,對菌株進(jìn)行誘變處理,選育出優(yōu)良發(fā)酵菌株,并從發(fā)酵培養(yǎng)基組成方面優(yōu)化發(fā)酵條件,以期提高發(fā)酵水平,推動(dòng)紅霉素規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌種 原始菌株為產(chǎn)紅霉素(Erythromycin)的紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)SE-2207菌株,由本實(shí)驗(yàn)室低溫保藏。

1.2 儀器及耗材 恒溫振蕩搖床(武漢科學(xué)儀器廠,編號:HQL150C)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱(江蘇杰瑞爾電器有限公司,LHP160)、ARTP等離子體生物育種機(jī)(北京思清源生物科技有限公司,ARTP-Ⅱ型),紫外分光光度計(jì)(德國耶拿,SPECORD S600)、高效液相色譜儀(Watesr公司,E2695)、顯微鏡(Leica DM500)。Erythromycin對照品購自 Sigma 公司,其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 斜面和分離培養(yǎng)基(g/L):淀粉 1,玉米漿 1,氯化鈉 0.3,硫酸銨0.3,碳酸鈣0.5,瓊脂 20, pH 7.0,32 ℃,培養(yǎng)7 d。種瓶培養(yǎng)基(g/L):蔗糖6,硝酸鉀 1.0,硫酸銨 0.2,磷酸二氫鉀0.3,七水硫酸鎂 0.1,pH 7.0。斜面培養(yǎng)基挖塊約1 cm3,接種于種子培養(yǎng)基中(250 mL容積的錐形瓶裝量40 mL),置于32 ℃搖床,220 rpm,培養(yǎng)32 h。發(fā)酵瓶培養(yǎng)基(M/V):黃豆餅粉3%,玉米漿3%,葡萄糖6%,硫酸銨 0.1%,磷酸氫二鉀 0.1%,碳酸鈣 0.4%,pH自然,接種量8%(500 mL容積的錐形瓶裝量80 mL),32 ℃,220 rpm振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)7 d。中試(500 L)培養(yǎng)基(g/L):淀粉20,蔗糖53,玉米漿98,酵母粉10,硫酸銨4,磷酸二氫鉀 1,氯化鈣 2,碳酸鈣 0.5,pH自然,溫度32 ℃,時(shí)間7 d。

1.4 孢子液的制備 參考李春玲等[15]的方法,取成熟斜面孢子,用4.5 mL無菌水沖洗,將沖洗的孢子液用研磨器研磨,然后將菌液用濾紙過濾,離心管收集濾液,稀釋至1×10-6濃度備用。

1.5 甲基磺酸乙酯 (EMS)誘變 取一定量的孢子液于無菌三角瓶中,加入EMS(終濃度為0.2%),放在搖床上振蕩培養(yǎng),誘變處理時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h,然后將孢子液均勻涂布于分離培養(yǎng)基上,以未經(jīng)EMS處理的孢子液作為對照,于32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7 d。

1.6 紫外線(UV)誘變 取2 mL制備好的孢子液放入置有圓形磁片的培養(yǎng)皿中(直徑為9 cm),打開預(yù)熱15 W紫外燈(波長253.7 nm)30 min,將離紫外燈管置于培養(yǎng)皿垂直高度35 cm處,然后打開皿蓋,分別采用照射20、40、60、80 s進(jìn)行處理,蓋上皿蓋,誘變處理過程在黑暗條件下進(jìn)行。誘變結(jié)束后,再將培養(yǎng)皿在黑暗處條件下放置2 h,然后吸取孢子液,均勻涂布于分離培養(yǎng)基上,于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,統(tǒng)計(jì)致死率。

1.7 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變 ARTP的工作氣體為純度為99.99%的氦氣,處理功率為80 W,等離子體發(fā)生器待處理樣品與出口之間的距離為4 mm,氣體的流量9.0 L/min。將準(zhǔn)備好的50 μL孢子液均勻涂布于載片上,然后進(jìn)行照射,照射的時(shí)間分別為0(對照)、20、40、60、80 s,用50 μL 無菌水沖洗,將照射后的菌液洗脫倒入平皿中,反復(fù)洗脫4次,均勻涂布在平皿中,在32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,統(tǒng)計(jì)致死率。

1.8 致死率和正突變率 每個(gè)誘變處理36培養(yǎng)皿,重復(fù)3次,以未經(jīng)誘變處理的孢子液為對照,致死率等于(對照處理平皿菌落-誘變處理平皿菌落)/對照處理平皿菌落×100%;正突變率等于誘變處理效價(jià)高于對照3%的菌株數(shù)/誘變處理的菌株總數(shù)×100%。

1.9 菌株遺傳穩(wěn)定性測定 將選育出的高產(chǎn)菌株以斜面形式保存,產(chǎn)生孢子后取少許孢子轉(zhuǎn)入另一斜面,此為一代,連續(xù)傳代 3次,使用搖瓶檢測法測定每一代菌株的紅霉素效價(jià),分析其遺傳的穩(wěn)定性。

1.10 紅霉素堿耐受性的檢測 將孢子液稀釋后,分別均勻涂布在含有500、1000、1500 mg/L紅霉素堿的培養(yǎng)基上,于32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d,觀察菌株的紅霉素堿耐受性。

1.11 紅霉素含量測定 參考張立軍等[16]的方法測定。

1.12 ?；o酶A合成酶活力測定 參考卞晨光等[12]的方法測定。

1.13 正丙醇對發(fā)酵的影響 分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%、1%、1.5%濃度的正丙醇,分析不同濃度正丙醇對發(fā)酵效價(jià)的影響。

1.14 豆油對發(fā)酵的影響 分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.05%、0.1%、0.15%濃度的豆油,分析不同濃度豆油對發(fā)酵效價(jià)的影響。

1.15 中試發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 在中試發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1%正丙醇、0.1%豆油,以及同時(shí)加入1%正丙醇和0.1%豆油,分析不同添加物對發(fā)酵效價(jià)的影響。

1.16 數(shù)據(jù)分析 所有處理數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析,以t-檢驗(yàn)檢測差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始菌株的復(fù)壯篩選 將引進(jìn)保存的7株產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌菌株進(jìn)行復(fù)壯,經(jīng)過傳代3次,結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號SE-2207菌株發(fā)酵效價(jià)較高,為6668 mg/L,且該菌株遺傳穩(wěn)定性較好,作為后續(xù)誘變處理的原始菌株(表1)。

表1 原始菌株的效價(jià)及遺傳穩(wěn)定性Tab 1 Potency and inheritance stability of the rejuvenation strains

2.2 EMS誘變處理 SE-2207菌株經(jīng)EMS誘變處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增加,菌體致死率呈現(xiàn)升高的趨勢,處理時(shí)間為3 h時(shí),致死率為72.5%,正突變率為16.6%;處理時(shí)間為5 h時(shí),致死率最高,達(dá)到95.2%,正突變率為11.2%,見表2。綜合考慮,確定誘變處理適宜時(shí)間為3 h。采用EMS誘變處理3 h,初篩出18株正突變菌株,經(jīng)搖瓶效價(jià)檢測復(fù)篩,得到3株效價(jià)升高的菌株(編號為SEM-1、SEM-2、SEM-3),其效價(jià)分別為7422、7192、7127 mg/L。

表2 不同誘變方法誘變效果的比較Tab 2 Comparison of mutagenic effects of different mutagenic methods

2.3 UV誘變處理 SE-2207菌株經(jīng)UV誘變處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間增加,菌體致死率呈現(xiàn)升高的趨勢,處理時(shí)間60 s時(shí),致死率為69.3%,正突變率為22.7%;處理時(shí)間為80 s時(shí),致死率最高,達(dá)到82.1%,正突變率為10.3%。綜合考慮,確定誘變處理適宜時(shí)間為60 s,見表2。采用UV誘變處理60 s,初篩出21株正突變菌株,經(jīng)搖瓶效價(jià)檢測復(fù)篩,得到3株效價(jià)升高的菌株(編號為SEM-4、SEM-5、SEM-6),其效價(jià)分別為7376、7356、7287 mg/L。

2.4 ARTP誘變處理 SE-2207菌株經(jīng)ARTP誘變處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間增加,菌體致死率呈現(xiàn)升高的趨勢,處理時(shí)間60 s時(shí),致死率為71.5%,正突變率為19.5%;處理時(shí)間為80 s時(shí),致死率最高,達(dá)到82.1%,正突變率為10.3%。綜合考慮,確定誘變處理適宜時(shí)間為60 s,見表2。采用ARTP誘變處理60 s,初篩出16株正突變菌株,經(jīng)搖瓶效價(jià)檢測復(fù)篩,得到2株效價(jià)升高的菌株(編號為SEM-7、SEM-8),其效價(jià)分別為7656 mg/L、7731 mg/L。

2.5 優(yōu)良菌株遺傳穩(wěn)定性的檢測 對獲得的效價(jià)升高菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株SEM-1、SEM-3、SEM-4、SEM-7的遺傳穩(wěn)定性較好,其中,SEM-7效價(jià)最高,達(dá)到8368 mg/L,較原始菌株SE-2207提高了25.5%(表3)。

表3 優(yōu)良菌種遺傳穩(wěn)定性分析Tab 3 Inheritance stability analysis of the excellent strains

2.6 優(yōu)良菌株紅霉素耐受性檢測 對菌株SEM-1、SEM-3、SEM-4、SEM-7的紅霉素耐受性進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與原始菌株相比,SEM-7在含500、1000、1500 mg/L紅霉素堿的培養(yǎng)基上均能較好生長,表明SEM-7菌株具有較好的紅霉素耐受性(表4)。

表4 優(yōu)良菌種紅霉素耐受性檢測Tab 4 Erythromycin tolerance test of excellent strain

2.7 SEM-7菌株?；o酶A合成酶活力檢測 以原始菌株SE-2207為對照,對菌株SEM-7的?；o酶A合成酶活力進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株SEM-7?；o酶A合成酶活力為31.6 U/mg,較原始菌株提高了19.6%(表5)。

表5 SEM-7菌株酰基輔酶A合成酶活力檢測Tab 5 Activity of acyl-CoA synthetase in excellent strain

2.8 正丙醇對SEM-7菌株發(fā)酵效價(jià)的影響 測定添加不同濃度正丙醇發(fā)酵液的效價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加1%正丙醇的效價(jià)最高,為8757 mg/L,添加0.5%、1.5%正丙醇的效價(jià)分別為8421、8322 mg/L,而未添加正丙醇(無正丙醇)的效價(jià)為8298 mg/L,添加1%正丙醇的效價(jià)顯著高于其他三者(P<0.05),且其他三者之間無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 添加不同濃度正丙醇SEM-7發(fā)酵效價(jià)(不同小寫字母表示效價(jià)存在顯著差異(P<0.05),下同)Fig 1 Fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of n-propanol

2.9 豆油對SEM-7發(fā)酵效價(jià)的影響 測定添加不同濃度豆油發(fā)酵液的效價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加0.1%豆油的效價(jià)最高,為8893 mg/L,添加0.05%、0.15%豆油的效價(jià)分別為8631、7922 mg/L,而未添加正丙醇的效價(jià)為8311 mg/L,添加0.05%、0.1%濃度正丙醇的效價(jià)顯著高于未添加的(無豆油)(P<0.05),但添加0.15%的效價(jià)有所降低(圖2)。

圖2 添加不同濃度豆油SEM-7發(fā)酵效價(jià)Fig 2 Fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of soybean oil

2.10 SEM-7中試發(fā)酵條件優(yōu)化 綜合上述結(jié)果,在中試發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1%正丙醇、0.1%豆油,以及同時(shí)加入1%正丙醇和0.1%豆油,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同時(shí)添加正丙醇和豆油的效價(jià)最高,為9155 mg/L,只添加正丙醇或豆油的效價(jià)分別為8734、8792 mg/L,而未添加正丙醇和豆油(無豆油與正丙醇)的效價(jià)為8486 mg/L,同時(shí)添加1%正丙醇和0.1%豆油的效價(jià)顯著高于其他三者(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同添加物條件下中試發(fā)酵效價(jià)Fig 3 The pilot fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of additives

3 討 論

發(fā)酵菌種性能對紅霉素生產(chǎn)起著極其重要的作用,而誘變選育是獲得優(yōu)良性能菌種的必由途徑,EMS、UV和ARTP等誘變方法是常用且行之有效菌種誘變選育手段[17]。本研究采用EMS、UV、ARTP,選育出了高產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌SEM-7。這與劉峰等[8]、趙宏圖[11]所采用的誘變方法相一致。在發(fā)酵過程中,紅色糖多孢菌易受發(fā)酵產(chǎn)物紅霉素反饋抑制,因此菌株對紅霉素的耐受性高低是評價(jià)其性能的重要指標(biāo)。本研究將紅霉素耐受性作為菌株選育的前置篩選指標(biāo),選育出的優(yōu)良菌株SEM-7具有較強(qiáng)紅霉素耐受性,這與楊雪清等[9]所采用的選育思路及結(jié)論類似。紅霉素的生物合成起始于丙酰輔酶A,而丙酰輔酶A受?；o酶A合成酶活力的調(diào)控,有學(xué)者的研究結(jié)論表明菌株?；o酶A合成酶活力可能與紅霉素發(fā)酵效價(jià)存在一定關(guān)聯(lián)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)菌株SEM-7的酰基輔酶A合成酶活力高于原始菌株,推測這一特性可能對其發(fā)酵效價(jià)的提高存在一定作用。

劉峰等[8]研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中補(bǔ)加正丙醇可以大幅提高紅霉素發(fā)酵效價(jià);沈兆兵等[18]研究發(fā)現(xiàn),在紅色糖多孢菌發(fā)酵過程中補(bǔ)加豆油可顯著提高紅霉素產(chǎn)量。本研究也發(fā)現(xiàn),補(bǔ)加正丙醇、豆油可顯著提高紅霉素產(chǎn)量,且提高作用與補(bǔ)加正丙醇、豆油的濃度相關(guān)。本研究還進(jìn)一步探究了分別補(bǔ)加正丙醇、豆油,以及同時(shí)補(bǔ)加正丙醇、豆油對中試發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)同時(shí)補(bǔ)加正丙醇、豆油對發(fā)酵效價(jià)的提高作用更為顯著。劉峰等[8]認(rèn)為正丙醇是內(nèi)酯環(huán)生物合成前體,而紅霉素來源于內(nèi)酯環(huán)生物合成途徑,在發(fā)酵過程中補(bǔ)加正丙醇提高了合成前體物質(zhì)的濃度,進(jìn)而提高了紅霉素效價(jià)。卞晨光等[12]、沈兆兵等[18]分析推測,豆油對紅色糖多孢菌產(chǎn)紅霉素促進(jìn)機(jī)制是,豆油通過進(jìn)入菌體的三羧酸循環(huán),生成紅霉素另一前體物質(zhì)2-甲基丙二酰輔酶A,繼而提高了紅霉素效價(jià)。本研究同時(shí)補(bǔ)加正丙醇和豆油,對紅霉素效價(jià)提高作用更強(qiáng),推測可能是兩者的疊加作用所致。

本研究選育出產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌優(yōu)良菌株SEM-7,并對菌株中試發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化,后續(xù)還需對該菌株的性能、生成應(yīng)用開展更深入的探索。