陳志達(dá)，陳 凜，郗洪慶

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心普通外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)具有干細(xì)胞特性，同時(shí)也具有腫瘤細(xì)胞的不死性、去接觸抑制、遷徙性等固有本質(zhì)，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥的主要原因[1]。Lgr5蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，是由Lgr5基因編碼表達(dá)的跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于消化道組織，具有極強(qiáng)的干細(xì)胞活性，能夠持續(xù)自我更新，可以分化多譜系子代細(xì)胞[2]。近10年來(lái)，大量分子生物學(xué)、基于免疫抗體反應(yīng)的基因譜系追蹤、類器官培養(yǎng)和小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等研究結(jié)果不斷證實(shí)Lgr5陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的潛能[3-5]?；贚gr5蛋白在胃腸腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)屬性，Lgr5蛋白被推薦為胃腸惡性腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物[6]。為更好地認(rèn)識(shí)跨膜蛋白Lgr5的干細(xì)胞標(biāo)記物屬性和特點(diǎn)，本文薈萃追蹤近年來(lái)Lgr5蛋白作為干細(xì)胞標(biāo)記物在胃腸道腫瘤基礎(chǔ)領(lǐng)域的最新進(jìn)展，并結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和不同胃腸道腫瘤生物學(xué)活性特點(diǎn)，梳理分析Lgr5蛋白的標(biāo)記識(shí)別作用、調(diào)控誘導(dǎo)機(jī)制以及作為靶標(biāo)臨床靶向治療的潛在可能性，為下一步研究提供理論儲(chǔ)備。

1 Lgr5蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

Lgr5基因大小144 kb，位于12q22 ~ 23染色體區(qū)域，內(nèi)有907個(gè)堿基序列的開(kāi)放式閱讀框架編碼區(qū)域，由此轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生Lgr5蛋白。Lgr5蛋白的結(jié)構(gòu)與促甲狀腺激素、促卵泡激素、促黃體激素受體等其他糖蛋白激素受體相似，都屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族(G protein-coupled receptor，GPCR)，但其N末端胞外配體結(jié)合區(qū)域卻顯著不同[7]。Lgr5蛋白的N末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)由富含亮氨酸的17個(gè)重復(fù)序列、1個(gè)信號(hào)肽和7次α-螺旋跨膜的高度保守區(qū)域組成，是Lgr5蛋白與糖蛋白配體相互接觸的重要結(jié)構(gòu)[2]。

Lgr蛋白家族同屬于胞膜蛋白，其中激素受體Lgr1、Lgr2和Lgr3蛋白很早就已經(jīng)通過(guò)分離實(shí)驗(yàn)獲知其相應(yīng)的配體。因苦于沒(méi)有找到相應(yīng)的配體，Lgr蛋白家族的Lgr4、Lgr5和Lgr6蛋白一直被認(rèn)為是“孤兒”受體，直到2011年荷蘭學(xué)者De Lau等[8]在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)R-spondin生長(zhǎng)因子(R-spondin growth factor)作為配體可以與Lgr4、Lgr5和Lgr6蛋白結(jié)合，繼而激活相應(yīng)信號(hào)通路發(fā)揮作用。

Lgr5蛋白是跨膜蛋白，主要定位在細(xì)胞膜表面，通過(guò)與配體因子相互作用激活信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，Lgr5蛋白具有空間動(dòng)態(tài)分布特點(diǎn)，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中也可以檢測(cè)到Lgr5蛋白的表達(dá)[9]。因此，Lgr5蛋白的多次跨膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)分布屬性是其介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞的重要基礎(chǔ)，為L(zhǎng)gr5蛋白標(biāo)記調(diào)控細(xì)胞通路影響腫瘤細(xì)胞功能提供了可能。

2 Lgr5蛋白標(biāo)記與信號(hào)通路的關(guān)系

2.1 Wnt信號(hào)通路 Wnt信號(hào)通路是目前胃腸道腫瘤Lgr5蛋白相關(guān)性研究較為集中的通路。在Lgr5蛋白參與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，受到強(qiáng)化的Wnt信號(hào)通路是最核心的通路途徑，刺激腫瘤干細(xì)胞增殖和自我更新[10]。當(dāng)它被異常激活后，將會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和EMT轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的耐藥能力，而且Wnt/βcatenin 信號(hào)通路也被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)組織修復(fù)和干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵途徑。

由成纖維細(xì)胞分泌的頂部盤狀底板反應(yīng)蛋白(roof plate-specific spondins，RSPOs)是Lgr5蛋白的特異性配體，兩者相結(jié)合后以二聚體的形式存在[11]。兩者結(jié)合可以抑制β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的泛素化降解復(fù)合體功能，導(dǎo)致β-catenin累積增多[12]，激活TCF轉(zhuǎn)錄因子，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TCF4蛋白，形成中介復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)Wnt通路信號(hào)下游的靶基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，對(duì)胃腸道腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、EMT轉(zhuǎn)化和耐藥等過(guò)程發(fā)揮作用[13-14]。

2.2 Hedgehog信號(hào)通路 在正常成年人體內(nèi)該通路表達(dá)靜默，但在胃腸道腫瘤組織中十分活躍，并與腫瘤的增殖分化、細(xì)胞凋亡、血管新生、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[15-16]。該通路被激活時(shí)，釋放配體蛋白SHH與Ptch蛋白結(jié)合，解除Ptch蛋白對(duì)Smoothed (Smo)的抑制，而Smo蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄因子1轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而改變細(xì)胞生物學(xué)特性，促進(jìn)腫瘤增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17-19]。

2.3 Hippo信號(hào)通路 Hippo信號(hào)通路高度保守。不同于其他信號(hào)通路，Hippo沒(méi)有特異性受體和配體，通路的核心是接收上游G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)或活化的酪氨酸激酶調(diào)控引起激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)降解或積累下游效應(yīng)因子YAP來(lái)完成CSC穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[20]。正常狀態(tài)下，YAP可以參與和誘導(dǎo)EGFR、Notch信號(hào)通路啟動(dòng)腸道干細(xì)胞暫時(shí)性再生功能，修復(fù)腸道黏膜損傷[21]。而在胃腸道腫瘤發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞核中的YAP又可聯(lián)合β-catenin蛋白、TCF4形成結(jié)構(gòu)復(fù)合體，以Lgr5作為靶基因，驅(qū)動(dòng)胃腸道腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[22]。

3 Lgr5蛋白標(biāo)記與胃腸道惡性腫瘤生物學(xué)活性的關(guān)系

3.1 胃癌 在正常胃部組織中，Lgr5蛋白主要局限表達(dá)于成熟幽門腺體的底部，并且具有自我更新能力，承擔(dān)著胃上皮細(xì)胞組織的長(zhǎng)期更新工作。但當(dāng)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生腸上皮化生，Lgr5蛋白又轉(zhuǎn)變角色，成為促癌蛋白，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展[23]。Barker等[24]首次通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Lgr5+干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)胃上皮組織的自我更新的能力，并提出Lgr5蛋白可以作為干細(xì)胞研究穩(wěn)定標(biāo)記物的論斷。隨后，Yamanoi等[25]通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增技術(shù)也發(fā)現(xiàn)了Lgr5蛋白雙重身份屬性，在蛋白質(zhì)合成的第一步，即基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平，Lgr5在胃癌組織中表達(dá)即顯著高于正常胃黏膜組織。

胃癌組織中Lgr5蛋白異常升高的程度與患者生存預(yù)后密切相關(guān)，人們開(kāi)始將Lgr5蛋白視為胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)，Lgr5+患者中位生存期較Lgr5-患者減少26個(gè)月，提示我們Lgr5蛋白高表達(dá)狀態(tài)預(yù)示較低生存率。分析其原因，除了Lgr5蛋白能夠維持胃癌CSC的“干”性導(dǎo)致腫瘤難治難控的特點(diǎn)以外，Lgr5蛋白表達(dá)與胃癌的TNM臨床分期密切相關(guān)。一項(xiàng)納入257例Ⅰ、Ⅱ期胃癌術(shù)后患者的研究中發(fā)現(xiàn)，N0~1亞群中Lgr5+患者5年總生存率顯著低于Lgr5-患者(89.4%vs54.4%)，T1~2亞群中，Lgr5+患者5年無(wú)病生存率顯著高于Lgr5-患者(94.1%vs0)[27]。

相較于CD133、CD44、上皮細(xì)胞黏附分子、ABCG2等其他跨膜蛋白類胃癌相關(guān)標(biāo)記物，Lgr5蛋白具有維持胃癌CSC持續(xù)更新的能力，因此Lgr5蛋白被視為突破CSC耐藥困境的新策略靶點(diǎn)[28]。

3.2 結(jié)直腸癌 眾多研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)干擾或敲除等方式調(diào)低Lgr5蛋白的表達(dá)，可以抑制結(jié)直腸腫瘤的干細(xì)胞自我更新能力。Gzil等[29]的病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Lgr5蛋白表達(dá)程度與結(jié)直腸腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期高度相關(guān)，即低分化、深度浸潤(rùn)和晚期分期的結(jié)直腸腫瘤中存在Lgr5蛋白高表達(dá)。且Lgr5蛋白高表達(dá)患者更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，其機(jī)制主要通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn)：(1) Lgr5+腫瘤干細(xì)胞可能承擔(dān)轉(zhuǎn)移性腫瘤干細(xì)胞的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的播散和轉(zhuǎn)移；(2) Lgr5蛋白通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞 - 間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)生。因此，依據(jù)以上兩種作用方式，Lgr5蛋白可以作為判斷結(jié)直腸腫瘤預(yù)后的重要參考因素。

Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在直腸腫瘤患者中，Lgr5蛋白高表達(dá)組放療有效率低于對(duì)照組，而且更容易出現(xiàn)化療藥物的耐藥性，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展。近年來(lái)，Lgr5蛋白高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性成為探究腫瘤細(xì)胞耐藥性原因的重要方向。

對(duì)分選Lgr5標(biāo)記后的結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞系使用10 μg/mL伊立替康藥物3 d，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞停止增殖，只有約50%的細(xì)胞存活，暫時(shí)失去Lgr5標(biāo)記，且Lgr5 mRNA水平顯著下降。然而，把抗腫瘤藥物處理因素去除后，又可以通過(guò)免疫反應(yīng)檢測(cè)到19% ~ 43%的細(xì)胞有Lgr5表面標(biāo)記。用5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑藥物處理，也獲得了相同的結(jié)果[31]。以上結(jié)果也提示我們Lgr5+CSC在化療治療時(shí)可暫時(shí)性轉(zhuǎn)為L(zhǎng)gr5-狀態(tài)，以逃脫化療藥物的捕殺；當(dāng)化療藥物濃度下降或消失時(shí)，再由Lgr5-轉(zhuǎn)為L(zhǎng)gr5+狀態(tài)并恢復(fù)腫瘤細(xì)胞大量快速增殖。因此，如何能夠緊緊錨定Lgr5+CSC，避免脫靶現(xiàn)象，成為藥理學(xué)家關(guān)注的重點(diǎn)。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

Lgr5蛋白的廣泛消化道實(shí)體腫瘤高表達(dá)特點(diǎn)以及與腫瘤生物學(xué)活性的高度相關(guān)性，顯示出其作為抗癌治療靶點(diǎn)的潛力。通過(guò)深入研究基因組編輯技術(shù)或源于抗體特異性免疫反應(yīng)靶向投送藥物的傳遞送系統(tǒng)，達(dá)到調(diào)控實(shí)體腫瘤中Lgr5表達(dá)，將成為抗耐藥治療的突圍點(diǎn)[32]。

此外，調(diào)控Lgr5在穩(wěn)態(tài)干細(xì)胞和CSC中表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚，如果我們能夠進(jìn)一步掌握多面的Lgr5復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制，將可以極大地推動(dòng)Lgr5靶向治療的進(jìn)步。雖然該領(lǐng)域已經(jīng)在干細(xì)胞和體外器官培養(yǎng)疾病建模方面取得了巨大的進(jìn)步，但距離臨床應(yīng)用仍然很遠(yuǎn)。通過(guò)將基因組編輯技術(shù)與類器官培養(yǎng)相結(jié)合，有可能更加真實(shí)地模擬疾病發(fā)展過(guò)程，并跟蹤Lgr5+干細(xì)胞在正常生理和癌癥環(huán)境中的生物學(xué)行為特點(diǎn)。以Lgr5為干細(xì)胞標(biāo)記物和在多信號(hào)通路背景下研究Lgr5+干細(xì)胞特點(diǎn)，應(yīng)用于腫瘤疾病建模、耐藥性機(jī)制研究、藥物靶向投送系統(tǒng)、動(dòng)物模型移植等方向，將是未來(lái)腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)研究的前景領(lǐng)域和必經(jīng)途徑。

作者貢獻(xiàn)陳志達(dá)：論文書寫，文獻(xiàn)檢索及整理；陳凜：選題指導(dǎo)；郗洪慶：論文校審；課題基金支持。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突。